陳鴻飛，張志興，林文雄

（1.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建福州 350002；2.福建農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福建福州 350002；3.福建農(nóng)林大學作物生態(tài)與分子生理學福建省高校重點實驗室，福建福州 350002）

促芽肥對頭季稻灌漿后期葉片蛋白質(zhì)表達的影響

陳鴻飛1，2，3，張志興1，2，3，林文雄1，2，3

（1.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建福州 350002；2.福建農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福建福州 350002；3.福建農(nóng)林大學作物生態(tài)與分子生理學福建省高校重點實驗室，福建福州 350002）

為探究促芽肥對頭季稻的調(diào)控效應(yīng)，以Ⅱ優(yōu)1273為材料，在頭季稻齊穗后18 d設(shè)置施用促芽肥和未施用促芽肥2種處理，采用比較蛋白質(zhì)組學的方法和技術(shù)，并結(jié)合相關(guān)生理指標測定，分析了促芽肥對頭季稻灌漿后期葉片蛋白質(zhì)表達及相應(yīng)生理特性的影響。不同促芽肥處理的頭季稻灌漿后期葉片蛋白質(zhì)經(jīng)雙向電泳分離后共獲得了15個差異表達的蛋白質(zhì)點，涉及頭季稻灌漿后期葉片的光合碳同化、電子傳遞與光合磷酸化和抗逆抗衰老響應(yīng)等，分析結(jié)果表明，頭季稻后期劍葉中與光合碳同化、電子傳遞與光合磷酸化相關(guān)蛋白隨灌漿進程呈下降趨勢，施用促芽肥能明顯減緩其下調(diào)幅度，從而使頭季稻灌漿后期劍葉具有相對較高的葉綠素含量和凈光合速率，提高了頭季稻灌漿后期的干物質(zhì)積累和源供應(yīng)能力；還能明顯提高頭季稻灌漿后期劍葉中與抗性相關(guān)蛋白的表達量，從而增強稻株的活性氧清除能力，抑制功能葉的膜脂過氧化作用，延緩頭季稻灌漿后期劍葉的衰老速率，從而顯著提高了頭季稻的結(jié)實率和產(chǎn)量。

再生稻；葉片；促芽肥；蛋白質(zhì)組學；產(chǎn)量

葉片是水稻最重要的光合源器官，籽粒灌漿所需物質(zhì)的60%～80%來自于葉片的光合作用［1］，翟虎渠等［2］研究認為決定產(chǎn)量差異的最主要時期不是在穗增重速率最快的灌漿前中期，而是在灌漿后期至成熟期，灌漿后期葉片的衰老導(dǎo)致光合作用下降，直接影響水稻的結(jié)實率和高產(chǎn)潛力的發(fā)揮［3］；水稻葉片衰老速率除了受遺傳因子影響外，很大程度上也受環(huán)境因素（如溫度、光照、水分、營養(yǎng)脅迫等）的調(diào)控［4-8］。我們發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)上高產(chǎn)再生稻的頭季稻結(jié)實率（≥90%）明顯較雙季稻或單季稻高，分析2種水稻的栽培措施，頭季稻齊穗后15～20 d時施用促芽肥是導(dǎo)致高產(chǎn)再生稻頭季稻與單季稻或雙季稻結(jié)實率差異的主要栽培措施，可見，促芽肥不但能促進再生芽的萌發(fā)［9］，對頭季稻也有著顯著的影響。關(guān)于促芽肥對頭季稻的影響，國內(nèi)外眾多學者從生理生態(tài)特性等方面進行了研究［10-12］，但對于促芽肥調(diào)控頭季稻灌漿后期葉片的分子機制仍有待進一步研究。蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生理代謝和基因間聯(lián)系的重要橋梁，因而，蛋白質(zhì)組學技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于特定生理、生態(tài)環(huán)境下水稻代謝機制的研究［13-14］；為了深入揭示促芽肥對頭季稻的影響機理，本研究從蛋白質(zhì)組學角度出發(fā)，分析促芽肥對頭季稻灌漿后期葉片蛋白質(zhì)表達特性的影響，以期為深入了解高產(chǎn)再生稻頭季稻高結(jié)實率的形成及栽培調(diào)控提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

試驗于2012年在福建農(nóng)林大學教學農(nóng)田進行，供試土壤為壤土，土壤基礎(chǔ)肥力為含有機質(zhì)25.53 g/kg、全氮2.02 g/kg、全磷0.65 g/kg、全鉀0.75 g/kg、速效氮125.6 mg/kg、速效磷43.5 mg/kg、速效鉀97.5 mg/kg，pH值5.75。

供試水稻品種為Ⅱ優(yōu)1273，播種期為3月21日，移栽期為4月26日，栽插規(guī)格為16.5 cm×19.8 cm，頭季稻齊穗期為7月6日，頭季稻齊穗后18 d進行2種促芽肥處理（NA、NNA），NA處理：頭季稻齊穗后18 d施300.00 kg/hm2尿素作為促芽肥，頭季稻割后3 d施75.00 kg/hm2尿素作為壯苗肥；NNA處理：頭季稻齊穗后18 d不施用促芽肥，頭季稻割后3 d施75.00 kg/hm2尿素作為壯苗肥；每個處理設(shè)3個小區(qū)，每個小區(qū)面積16 m2，各小區(qū)周邊用塑料材質(zhì)制作的立板和農(nóng)膜包被的土筑成田埂，2個處理除促芽肥外其他管理措施相同。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣 于頭季稻抽穗開花期，每處理選取長勢基本一致的70株稻株掛牌標記，自頭季稻齊穗后18 d即促芽肥施用當天至頭季稻成熟，每隔5 d于下午17：00左右剪掛牌標記15株稻株的劍葉，置于液氮中保存，用于蛋白質(zhì)的提取和生理生化測定，共取樣4次。

1.2.2 產(chǎn)量及其構(gòu)成因子 頭季成熟時每小區(qū)調(diào)查50株穗數(shù)，并取代表性的5叢稻株風干后考種，單株計產(chǎn)。

1.2.3 葉綠素含量 利用日產(chǎn)SPAD-502葉綠素測定儀自頭季稻齊穗后18 d即促芽肥施用當天至頭季稻成熟每隔5 d測定15株掛牌標記的水稻植株劍葉SPAD值，共4次，測定時避開葉脈分別測定劍葉的上中下3個部位，取其平均值。

1.2.4 凈光合速率 用LI-6400便攜式光合作用測定儀自頭季稻齊穗后18 d，即促芽肥施用當天至頭季稻成熟每隔5 d于上午9：00-11：00每處理測定15株掛牌標記的水稻植株劍葉凈光合速率，共4次。

1.2.5 細胞保護酶活性和MDA含量的測定 細胞保護酶活性和MDA含量測定參照張志良［15］的方法?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍染色法，超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑還原法，過氧化氫酶（CAT）活性測定采用碘量法，過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法，以樣品中含有的蛋白質(zhì)含量計算酶活性。

1.2.6 葉片蛋白質(zhì)樣品的制備 取0.5 g頭季稻劍葉樣品，參照邵彩虹等［16］的TCA-丙酮沉淀方法制備；蛋白質(zhì)樣品濃度測定采用Bradford方法進行［17］。

1.2.7 雙向電泳與圖譜分析 雙向電泳參照邵彩虹等［16］的方法進行。等電聚焦（IEF）采用18 cm自制管狀膠條，上樣量為150μg，SDS-PAGE凝膠規(guī)格為180 mm×180 mm×1.5 mm，凝膠染色采用硝酸銀染色法。

染色后采用Umax powerlookⅢ掃描儀進行掃描，構(gòu)建蛋白表達圖譜。利用ImageMaster 5.0軟件對獲得的劍葉蛋白表達圖譜進行蛋白質(zhì)表達差異分析，以不同蛋白表達圖譜間同一蛋白質(zhì)點表達豐度值差異（差異=（最大表達量-最小表達量）/最小表達量×100%）達50%以上即認為該蛋白點是差異表達蛋白點。

1.2.8 質(zhì)譜分析 切取2個處理的差異表達蛋白質(zhì)點，采用串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-Q MS/MS、復(fù)旦大學蛋白組學研究中心）對差異表達蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜分析。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2007和統(tǒng)計分析軟件SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行錄入、處理和方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 促芽肥對頭季稻產(chǎn)量及其構(gòu)成因子的影響

由表1可知，頭季稻產(chǎn)量施用促芽肥NA處理的為12 546.91 kg/hm2，未施促芽肥NNA處理的為11 355.15 kg/hm2，NA處理比NNA處理高10.50%，達顯著差異水平，進一步對產(chǎn)量構(gòu)成因子進行分析還可看出，頭季稻2個處理的單位面積有效穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量基本相近，差異未達顯著水平；但結(jié)實率NA處理的顯著高于NNA處理，表明NA處理促進頭季稻增產(chǎn)主要是在前期建立適宜穗數(shù)和大穗的基礎(chǔ)上通過顯著提高結(jié)實率來發(fā)揮品種高產(chǎn)潛力，從而顯著提高了稻谷產(chǎn)量。

表1 不同促芽肥處理對頭季稻產(chǎn)量及其構(gòu)成因子的影響Tab.1 Effects of different nitrogen app lication for bud developm ent on grain yield and its com ponents in first cropping rice

2.2 頭季稻灌漿后期葉片蛋白質(zhì)表達圖譜的構(gòu)建與比較分析

比較NA和NNA 2個不同促芽肥水平處理下促芽肥施用當天至頭季稻成熟的4個不同時期（施用促芽肥后0，5，10，15 d）頭季稻劍葉葉片電泳圖譜，在不同促芽肥處理下發(fā)現(xiàn)15個出現(xiàn)差異表達的蛋白質(zhì)點，并以1～15進行編號（圖1）。

圖1 頭季稻灌漿后期葉片的蛋白表達圖譜Fig.1 The 2-DE m ap of flag leaf at late grain filling stage in the first cropping rice

2.3 差異表達蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定及功能分析

根據(jù)質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)，15個差異蛋白點中共有10個差異蛋白質(zhì)點得到鑒定，通過MASCOT軟件（Matrix Science，http：//www.matrixscience.com）查詢，獲得差異蛋白質(zhì)點鑒定結(jié)果（表2）。10個蛋白質(zhì)依據(jù)功能的不同可劃分為3個類群：3個差異蛋白點與光合碳同化相關(guān)，分別為核酮糖二磷酸羧化酶大亞基（spot2）、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶大鏈（spot4）、磷酸甘油酸激酶（spot9）；電子傳遞與光合磷酸化相關(guān)蛋白1個，為細胞色素b6/f復(fù)合體鐵硫蛋白（spot3）；抗性抗衰老相關(guān)差異蛋白點6個，分別為過氧化物酶（spot1）、錳超氧化物歧化酶（spot5）、伴侶蛋白21前體（spot6）、過氧還蛋白過氧化物酶（spot8）和抗壞血酸過氧化物酶（spot11，12）。

2.4 促芽肥對頭季稻灌漿后期葉片蛋白質(zhì)點表達豐度的影響

2.4.1 光合碳同化相關(guān)蛋白 水稻籽粒的灌漿物質(zhì)主要來源于花后的光合產(chǎn)物，光合產(chǎn)物供應(yīng)不足是影響籽粒灌漿結(jié)實和限制水稻產(chǎn)量提高的重要因素，因此，水稻葉片在灌漿結(jié)實期間光合能力下降的快慢會嚴重影響其結(jié)實率及產(chǎn)量［3，18］。本研究中共鑒定到3個與光合碳同化相關(guān)的蛋白質(zhì)（圖2），由圖2可知，在頭季稻灌漿后期隨著生育進程的進行，NA處理和NNA處理劍葉中核酮糖二磷酸羧化酶大亞基（spot2）、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶大鏈（spot4）和磷酸甘油酸激酶（spot9）表達量均呈下降趨勢，但施用促芽肥處理和未施用促芽肥處理3個蛋白的下調(diào)幅度不同，NA處理的核酮糖二磷酸羧化酶大亞基（圖3-A）、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶大鏈、磷酸甘油酸激酶表達量的下調(diào)幅度明顯小于NNA處理。

表2 頭季稻灌漿后期劍葉響應(yīng)不同促芽肥處理的差異表達蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果Tab.2 Resu lts of differen tially exp ressed p roteins of flag leaf in response to different nitrogen app lication for bud developm ent at late grain filling stage in the first cropping rice

圖2 光合作用相關(guān)差異蛋白在不同促芽肥處理下的表達豐度Fig.2 Effect of d ifferent nitrogen app lication for bud developm ent on expression of proteins involving photosynthesis of flag leaf at late grain filling stage in the first cropp ing rice

圖3 相關(guān)蛋白表達變化圖Fig.3 Exp ression changes of p roteins

2.4.2 電子傳遞與光合磷酸化相關(guān)蛋白 光合碳同化固定的CO2還需要利用光反應(yīng)中產(chǎn)生的同化力ATP和NADPH才能完成CO2的還原，實現(xiàn)光合作用的貯能過程；本研究中鑒定到的細胞色素b6/f復(fù)合體鐵硫蛋白（spot3）與同化力ATP和NADPH的合成有關(guān)（圖2），由圖2可知，無論是NA處理還是NNA處理，細胞色素b6/f復(fù)合體鐵硫蛋白表達量在頭季稻灌漿后期隨灌漿的進行均呈下降趨勢，但下降幅度NA處理明顯小于NNA處理。

2.4.3 抗性抗衰老相關(guān)蛋白 水稻葉片在進入灌漿后期時衰老開始加速，本試驗中鑒定到6個與抗性抗衰老相關(guān)的蛋白，由圖4可知，在頭季稻灌漿后期，NNA處理的過氧化物酶（spot1）、錳超氧化物歧化酶（spot5）、伴侶蛋白21前體（spot6）、過氧還蛋白過氧化物酶（spot8）（圖3-B）和抗壞血酸過氧化物酶（spot11，12）6個蛋白表達量均隨生育進程呈下調(diào)趨勢；NA處理的過氧化物酶（spot1）、錳超氧化物歧化酶（spot5）、過氧還蛋白過氧化物酶（spot8）和抗壞血酸過氧化物酶（spot11，12）5個蛋白表達量在施用促芽肥后呈先上升后緩慢下降趨勢，而伴侶蛋白21前體（spot6）蛋白表達量自促芽肥施用后至頭季稻成熟則一直呈上升趨勢；在促芽肥施用后至頭季稻成熟的各個時期，NA處理的6個與抗性抗衰老相關(guān)的蛋白表達量均較同一時期的NNA處理有明顯的上調(diào)。

圖4 抗性抗衰老相關(guān)差異蛋白在不同促芽肥處理下的表達豐度Fig.4 Effect of different nitrogen app lication for bud developm ent on exp ression of p roteins involving resistance of flag leaf at late grain filling stage in the first cropping rice

2.5 促芽肥對頭季稻灌漿后期葉片葉綠素SPAD值以及光合速率的影響

不同促芽肥處理對頭季稻灌漿后期光合作用相關(guān)蛋白的表達有顯著影響，光合代謝相關(guān)蛋白的降解在NA處理下得到明顯減緩，進而影響了葉片的SPAD值以及光合速率。由圖5可看出，施用促芽肥后，2個處理的劍葉葉綠素含量變化趨勢不同，NA處理的劍葉葉綠素含量呈現(xiàn)先小幅上升再緩慢下降，在整個頭季稻灌漿后期保持著較高的葉綠素含量水平；NNA處理的劍葉葉綠素含量在頭季稻灌漿后期則呈較大幅度下降，因而，NA處理的劍葉葉綠素含量在施用促芽肥后5，10，15 d分別比NNA處理的高出8.01%，15.53%，23.57%，差異達顯著水平，且越接近成熟期兩處理間的差異越明顯。

從圖5還可看出，施用促芽肥后，凈光合速率的變化趨勢2個處理基本相同，呈逐步下降趨勢，但下降幅度2個處理不同，NA處理的劍葉凈光合速率下降幅度明顯小，施用促芽肥后5，10，15 d分別比NNA處理的高出11.09%，23.68%，22.55%，差異達顯著水平，可見，施用促芽肥并不能改變頭季稻灌漿后期劍葉衰老、光合能力下降的趨勢，但能明顯減緩其下降幅度，使頭季稻灌漿后期劍葉能維持較高的葉綠素含量和光合速率，具有較強的源供應(yīng)能力，為增加頭季稻籽粒灌漿的物質(zhì)供應(yīng)和提高頭季稻結(jié)實率奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.6 促芽肥對頭季稻灌漿后期葉片細胞保護酶、可溶性蛋白含量及MDA含量的影響

不同促芽肥處理對頭季稻灌漿后期葉片的抗逆性有顯著影響，表3顯示，施用促芽肥后，頭季稻灌漿后期NA處理劍葉的SOD活性、POD活性、CAT活性呈現(xiàn)先上升再緩慢下降的趨勢，MDA含量呈現(xiàn)先小幅上升后明顯下降、至促芽肥施后15 d又上升的趨勢；NNA處理的劍葉中SOD活性、POD活性和CAT活性在頭季稻灌漿后期則呈逐漸下降趨勢，MDA含量呈逐步上升趨勢，因而，在施用促芽肥后至頭季稻成熟的各個時期，NA處理的劍葉SOD活性、POD活性和CAT活性均顯著高于NNA處理，與上述抗性抗衰老相關(guān)蛋白的變化相吻合，表明施用促芽肥確能提高頭季稻灌漿后期葉片抵抗逆境和適應(yīng)不良環(huán)境的能力，抑制膜脂的過氧化作用，從而有效地延緩頭季稻灌漿后期功能葉的衰老進程。

圖5 不同促芽肥水平下頭季稻灌漿后期葉片的葉綠素含量和凈光合速率Fig.5 Chlorophyll contents and net photosynthetic rate of flag leaf at late grain filling stage in the first cropping rice under different nitrogen app lications for bud developm ent

表3 不同促芽肥水平下頭季稻灌漿后期葉片的細胞保護酶活性及M DA含量Tab.3 Cell p rotective enzym es activities and p roline content of flag leaf at late grain filling stage in the first cropping rice under different nitrogen app lication for bud developm en t

3 討論與結(jié)論

植物葉片衰老是葉片逐漸喪失光合作用并進入細胞死亡的一個復(fù)雜的葉片發(fā)育過程［19］，許多研究表明，葉綠素含量和衰老之間存在明顯的負相關(guān)［20］，葉片衰老期間，葉綠體的大小、數(shù)目均減少［21］，整體光合作用水平下降［22］；1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）是光合作用中卡爾文循環(huán)里催化第一個主要的碳固定反應(yīng)的酶，是CO2固定的關(guān)鍵酶，決定了光合作用的凈效率，高等植物的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶是由8個大亞基和8個小亞基組成的寡聚體，每個大亞基上都有催化CO2與1，5-二磷酸核酮糖結(jié)合的位點，因而其含量與CO2的固定密切相關(guān)，陸?。?3］和張榮銑等［24］研究認為，水稻葉片光合功能衰退時，1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的下降速度明顯快于光合電子傳遞活性，從而使光合碳循環(huán)和能量供需平衡遭到破壞，最終導(dǎo)致葉片喪失光合功能，因而，提高1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的羧化效率對延緩水稻葉片光合功能衰退具有重要意義；Ding等［25］研究認為氮素能夠調(diào)節(jié)細胞分裂素（CTK）的代謝，而CTK能夠誘導(dǎo)1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的合成［26］。羧化階段產(chǎn)生的3-磷酸甘油酸，是一種有機酸，還需要磷酸甘油酸激酶（PGAK）和甘油醛磷酸脫氫酶利用光反應(yīng)中產(chǎn)生的同化力ATP和NADPH，使3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)變成磷酸丙糖，才能實現(xiàn)CO2的還原和光合貯能過程；本試驗中發(fā)現(xiàn)在頭季稻灌漿后期，葉片中的核酮糖二磷酸羧化酶大亞基、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶大鏈、磷酸甘油酸激酶表達量逐漸下調(diào)，但這3個蛋白表達量在促芽肥施用后的下調(diào)幅度明顯小于未施用促芽肥的，核酮糖二磷酸羧化酶大亞基、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶大鏈是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的重要組成部分，1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶和PGAK都是卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶，卡爾文循環(huán)將CO2轉(zhuǎn)化為糖類，并運輸?shù)剿氩抗┙o籽粒灌漿，這其中1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶參與CO2的羧化，PGAK參與CO2的還原，可見，施用促芽肥通過提高頭季稻灌漿后期稻株的氮素水平，有效地延緩了卡爾文循環(huán)中1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶和PGAK 2個關(guān)鍵酶的降解，使卡爾文循環(huán)在頭季稻灌漿后期能順利的運轉(zhuǎn)，保證了頭季稻灌漿后期能有較充足的光合同化物質(zhì)供應(yīng)。

卡爾文循環(huán)中CO2的還原還需要利用光反應(yīng)中產(chǎn)生的同化力ATP和NADPH，鑒定到的細胞色素b6/f復(fù)合體鐵硫蛋白參與光合作用原初反應(yīng)過程，與同化力ATP和NADPH的合成有關(guān)，含有Cyt f、Cyt b6（2個，電子傳遞循環(huán)劑）和（Fe-S）R，在光合電子傳遞及能量轉(zhuǎn)換過程中扮演著重要角色，它一方面作為中間電子載體連接PSⅠ與PSⅡ2個光系統(tǒng)，介導(dǎo)PSⅠ與PSⅡ之間的線性電子傳遞和圍繞PSⅠ的循環(huán)電子傳遞；另一方面作為能量轉(zhuǎn)換器利用電子傳遞過程中釋放出來的電子自由能將質(zhì)子從類囊體膜外側(cè)（基質(zhì)側(cè)）跨膜轉(zhuǎn)運到類囊體膜內(nèi)側(cè)（囊腔側(cè)），形成跨膜質(zhì)子電化學梯度，為ATP合酶催化合成ATP提供能量［27-28］。此外，它還參與調(diào)節(jié)LHCⅡ激酶的活化，控制激發(fā)能在2個光系統(tǒng)之間的分配及NADPH與ATP的比例，使植物在環(huán)境的變化中維持盡可能高的光能轉(zhuǎn)換效率［29］。在水稻生育后期，隨著葉片的衰老，產(chǎn)生的同化力NADPH和ATP也逐步下降，致使羧化階段固定的CO2無法完全轉(zhuǎn)化為磷酸丙糖，而此時是雜交水稻弱勢粒灌漿的重要時期，CO2同化能力的下降速度直接影響弱勢粒的灌漿。本試驗發(fā)現(xiàn)，施用促芽肥能相對提高細胞色素b6/f復(fù)合體鐵硫蛋白在頭季稻灌漿后期葉片中的表達，意味著促芽肥能夠減緩頭季稻灌漿后期光合電子傳遞活性和光合同化能力的下降速度，保證了頭季稻灌漿后期葉片具有較高的光合同化能力。

對頭季稻灌漿后期葉片葉綠素SPAD值以及光合速率的考察發(fā)現(xiàn)，葉片葉綠素SPAD值以及光合速率隨著灌漿的進行總體呈逐漸下降趨勢，但在NA處理中，葉片葉綠素SPAD值以及光合速率的下降趨勢明顯比NNA處理小，與上述光合相關(guān)蛋白表達的趨勢一致，證明了蛋白鑒定結(jié)果的準確性。上述結(jié)果說明施用的促芽肥確能有效地延緩頭季稻灌漿后期葉片卡爾文循環(huán)中CO2羧化和還原的關(guān)鍵酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）和磷酸甘油酸激酶的降解，保證了頭季稻灌漿后期卡爾文循環(huán)的運轉(zhuǎn)，相對提高與光合同化能力相關(guān)蛋白細胞色素b6/f復(fù)合體鐵硫蛋白在頭季稻灌漿后期葉片中的表達，使該時期葉片仍具有較高的CO2光合同化能力，從而提高頭季稻灌漿后期的干物質(zhì)積累和源供應(yīng)能力，為增加頭季稻籽粒灌漿的物質(zhì)供應(yīng)和提高頭季稻結(jié)實率奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

水稻進入生育后期，一方面稻株體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生在增加，另一方面活性氧的清除在減弱，使活性氧的平衡被打破，不能被及時清除，從而對細胞及組織造成損害，是導(dǎo)致葉片衰老加速的重要原因［30］。葉片衰老速度的快慢與活性氧清除系統(tǒng)存在極其密切的關(guān)系［31］，錳超氧化物歧化酶、過氧還蛋白過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物、過氧化物酶都是活性氧酶促清除系統(tǒng)的成員，對防御活性氧毒害、維持細胞膜結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用［32］；本試驗發(fā)現(xiàn)，在頭季稻灌漿后期，NNA處理的錳超氧化物歧化酶、過氧還蛋白過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物、過氧化物酶蛋白表達量均隨生育進程呈下調(diào)趨勢；NA處理的這5個蛋白表達量在施用促芽肥后呈先上升后緩慢下降趨勢，在促芽肥施用后至頭季稻成熟的各個時期，NA處理的這5個蛋白表達量均較同一時期的NNA處理有明顯的上調(diào)。與2個處理的保護酶生理測定結(jié)果一致，證明了蛋白鑒定結(jié)果的準確性，說明在頭季稻灌漿后期稻株體內(nèi)活性氧大量增多導(dǎo)致葉片衰老加速的情況下，施用的促芽肥能夠通過提高稻株體內(nèi)與活性氧酶促清除系統(tǒng)相關(guān)酶蛋白的表達量來防御活性氧的毒害，從而提高了頭季稻灌漿后期葉綠體的膜電阻和流動性，延緩了功能葉的衰老和光合作用能力的下降速度。

植物衰老的差誤理論認為基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)過程中的差誤包括氨基酸排列順序的錯誤或多肽鏈折疊的錯誤，累積達到一定程度時引起衰老；分子伴侶是一類在細胞中能識別正在合成的多肽或部分折疊的多肽并與多肽的一定部位相結(jié)合，幫助這些多肽折疊、組裝或轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)，不僅能幫助新生蛋白質(zhì)進行正確的折疊和組裝，而且在修復(fù)受傷害、變性蛋白質(zhì)的過程中也有重要作用［33-35］，分子伴侶含量與分子伴侶前體密切相關(guān)，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施用促芽肥改變了頭季稻灌漿后期劍葉中伴侶蛋白前體的表達量趨勢，使其表達量從未施用促芽肥處理下的隨生育進程逐漸下調(diào)趨勢轉(zhuǎn)變?yōu)橹饾u上升趨勢，說明施用促芽肥能顯著減少頭季稻灌漿后期葉片中蛋白質(zhì)合成過程因多肽鏈折疊錯誤而引起的差誤積累，還能加速被破壞無法復(fù)性蛋白質(zhì)的降解，減少它們的聚集積累及同功能蛋白質(zhì)間發(fā)生有害作用的可能性，從而延緩頭季稻灌漿后期功能葉的衰老。綜上研究結(jié)果可知，促芽肥對頭季稻灌漿后期葉片蛋白質(zhì)的表達有明顯影響，頭季稻后期劍葉中與光合碳同化、電子傳遞與光合磷酸化相關(guān)蛋白隨灌漿進程呈下降趨勢，施用促芽肥能明顯減緩其下調(diào)幅度，從而使頭季稻灌漿后期劍葉具有相對較高的葉綠素含量和凈光合速率，提高了頭季稻灌漿后期的干物質(zhì)積累和源供應(yīng)能力；還能明顯提高頭季稻灌漿后期劍葉中與抗性相關(guān)蛋白的表達量，從而增強稻株的活性氧清除能力，抑制功能葉的膜脂過氧化作用，延緩頭季稻灌漿后期劍葉的衰老速率，這是高產(chǎn)再生稻頭季稻結(jié)實率明顯高于單季稻或雙季稻的原因，研究結(jié)果在一定程度上豐富了再生稻高產(chǎn)栽培的促控機理，可為進一步的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

［1］ 謝金水，邵彩虹，唐秀英，等.養(yǎng)分脅迫對籽粒灌漿期水稻葉片衰老影響的蛋白質(zhì)組學分析［J］.中國水稻科學，2011，25（2）：143-149.

［2］ 翟虎渠，曹樹青，萬建民，等.超高產(chǎn)雜交稻灌漿期光合功能與產(chǎn)量的關(guān)系［J］.中國科學：C輯，2002，32（3）：211-217.

［3］ 徐芳芳，桑賢春，任德勇，等.水稻早衰突變體esl2的遺傳分析及基因定位［J］.作物學報，2012，38（8）：1347-1353.

［4］ Xie X J，Shen SH H，Li Y X，et al.Effect of photosynthetic characteristic and dry matter accumulation of rice under high temperature at heading stage［J］.African Journal of Agricultural Research，2011，6（7）：1931-1940.

［5］ Kim JW，Shon JY，Lee C K，et al.Relationship between grain filling duration and leaf senescence of temperate rice under high temperature［J］.Field Crops Research，2011，122（3）：207-213.

［6］ 李木英，鄭 偉，石慶華，等.不同雜交稻灌漿期葉片衰老特性及其對水分虧缺的響應(yīng)［J］.中國農(nóng)學通報，2011，27（3）：44-45.

［7］ 王丹英，章秀福，邵國勝，等.不同葉色水稻葉片的衰老及對光強的響應(yīng)［J］.中國水稻科學，2008，22（1）：77-81.

［8］ 魏海燕，張洪程，馬 群，等.不同氮肥吸收利用效率水稻基因型葉片衰老特性［J］.作物學報，2010，36（4）：645-654.

［9］ 陳鴻飛，張志興，林文雄.促芽肥對水稻再生芽萌發(fā)生長過程蛋白質(zhì)表達的影響［J］.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報，2014，22（12）：1405-1413.

［10］ 馬 均，王化新，孫曉輝，等.促芽肥15N在再生稻中的分配及其作用研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學報，1992，5（1）：41-46.

［11］ 劉保國，王光明，陳 靜，等.促芽肥影響水稻再生芽萌發(fā)的生理系列化基礎(chǔ)［J］.西南農(nóng)業(yè)學報：水稻栽培專輯，1998，11：41-47.

［12］ 黃育民，李義珍，蔡亞港，等.再生稻豐產(chǎn)技術(shù)研究Ⅷ報-再生稻株對促芽肥的吸收積累［J］.福建稻麥科技，1995，13（3）：45-47.

［13］ 張志興，陳 軍，李 忠，等.水稻籽粒灌漿過程中蛋白質(zhì)表達特性及其對氮肥運籌的響應(yīng)［J］.生態(tài)學報，2012，32（10）：3209-3224.

［14］ 邵彩虹，唐秀英，李明心，等.6-芐基腺嘌呤延緩水稻衰亡效應(yīng)的蛋白質(zhì)組學分析［J］.華北農(nóng)學報，2014，29（1）：14-19.

［15］ 張志良.植物生理學實驗指導(dǎo)［M］.北京：高等教育出版社，1995：155-163.

［16］ 邵彩虹，王 萍，陳 金，等.養(yǎng)分脅迫對不易早衰類型水稻生育后期葉片影響的蛋白質(zhì)組學分析［J］.華北農(nóng)學報，2015，30（4）：51-58.

［17］ 夏其昌，曾 嶸.蛋白質(zhì)化學與蛋白質(zhì)組學［M］.北京：科學出版社，2004：278.

［18］ 段 俊，梁承鄴，黃毓文.雜交水稻開花結(jié)實期間葉片衰老［J］.植物生理學報，1997，23（2）：139-144.

［19］ 張艷軍，趙江哲，張可偉.植物激素在葉片衰老中的作用機制研究進展［J］.植物生理學報，2014，50（9）：1305-1309.

［20］ 楊淑慎，高俊鳳，李學俊.高等植物葉片的衰老［J］.西北植物學報，2001，21（6）：1271-1277.

［21］ Hashimoto H，Kura-Hotta M，Katoh S，et al.Changes in protein content and in the structure and number of chloroplasts during leaf senescence in rice seedling［J］. Plant Cell Physiol，1989，30（5）：707-715.

［22］ 王復(fù)標，黃福燈，程方民，等.水稻生育后期葉片早衰突變體的光合特性與葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察［J］.作物學報，2012，38（5）：871-879.

［23］ 陸 巍.水稻光合功能衰退與Rubisco結(jié)構(gòu)與功能變化的研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2000.

［24］ 張榮銑，戴新賓，許曉明，等.葉片光合功能期與作物光合生產(chǎn)潛力［J］.南京師大學報：自然科學版，1999，22（3）：376-386.

［25］ Ding C，You J，Wang S，et al.A proteomic approach to analyze nitrogen and cytokinin responsive proteins in rice roots［J］.Mol Biol Rep，2012，39：1617-1626.

［26］ Ookawa T，Naruoka Y，Sayama A，et al.Cytokinin effects on Ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase and nitrogen partitioning in rice during ripening［J］. Crop Sci，2004，44：2107-2115.

［27］ Cramer W A，Zhnag H，Yan J，et al.Evolution of Photosynthesis：Time-independent structure of the cytochrome b6/f comp lex［J］.Biochemistry，2004，43：5921-5928.

［28］ Hope A B.The chloroplasts cytochrome b6 f complex：a critical of focus on function［J］.Biochim Biophys Acta，1993，1143：1-22.

［29］ 候 程.高等植物菠菜光合膜蛋白Cyt b6 f純化及其結(jié)晶條件初探［D］.石家莊：河北科技大學，2012.

［30］ Gill S S，Tuteja N.Reactive oxygen species and antioxidantmachinery in abiotic stress tolerance in crop plants［J］.Plant Physiol Biochem，2010，48（12）：909-930.

［31］ 李 健，趙 宇，李錦錦，等.不同基因型玉米葉片衰老與活性氧代謝的關(guān)系及其調(diào)控［J］.華北農(nóng)學報，2011，26（1）：131-135.

［32］ 史 靜，潘根興，夏運生，等.鎘脅迫對兩品種水稻生長及抗氧化酶系統(tǒng)的影響［J］.生態(tài)環(huán)境學報，2013，22（5）：832-837.

［33］ 彭春瑞，邵彩虹，潘曉華，等.水稻育秧肥的壯秧效應(yīng)及其蛋白質(zhì)組學分析［J］.中國水稻科學，2012，26（1）：27-33.

［34］ 杜曉華，黃伶俐，劉會超.植物熱激蛋白70（HSP70）研究進展［J］.河南科技學院學報，2014，42（3）：1-5.

［35］ Hartl F U，Hayer-Hartl M.Molecular chaperones in the cytosol：from nascent chain to folded protein［J］.Science，2002，295：1852-1858.

Effects of Nitrogen App lication for Bud Developm ent on Protein Expression of Flag Leaf at Late G rain Filling Stage in the First Cropping Rice

CHEN Hongfei1，2，3，ZHANG Zhixing1，2，3，LINWenxiong1，2，3（1.School of Life Sciences，F(xiàn)ujian Agricultural and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China；2.Institute of Agricultural Ecology，F(xiàn)ujian Agricultural and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China；3.Key Laboratory of Crop Ecology and Molecular Physiology of Fujian Universities，F(xiàn)ujian Agricultural and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

By using comparative proteom ics combined with bioinformatics and related physiological indicators，this paper studied the regulating effects of nitrogen application for bud development on protein expression of flag leaf at late grain filling stage in the first cropping rice withⅡYou 1273 as a material.Two treatments of urea levels：300.00，0.00 kg/ha applying at18 d after heading stage were included in the experiment in the first cropping rice. A total of 15 differentially expressed proteins were detected in different fertilizer treatments by the 2D maps of flag leaf proteome.And these proteins were grouped into three expression patterns according to their functions in photosynthesis carbon assim ilation，electron-transfer and photophosphorylation，the defense response to stresses etc..Our results indicated that the proteins involving photosynthesis were down-regulated at late grain filling stage in the first cropping rice.But，nitrogen app lication for bud development could significantly slow down the decreased amplitude of photosynthesis-related proteins in expression abundance，which relatively enhanced the chlorophyll content and photosynthetic rate of functional leaf and increased the source supply ability at late grain filling stage in the first cropping rice.The result also showed that nitrogen application for bud development could significantly increase the expression abundance of resistance-related protein at late grain filling stage in the first cropping rice，which helpedenhance the scavenging of active oxygen，retard the peroxidation ofmembrane lipid and delay the senescence rate of flag leaf.As a result，the seed-setting rate and yield of the first cropping rice were significantly increased under NA treatment.

Ratooning rice；Leaf；Nitrogen application for bud development；Proteom ics；Grain-yield

S511.03 文獻標識碼：A 文章編號：1000-7091（2016）03-0127-08

10.7668/hbnxb.2016.03.019

2016-03-10

國家自然科學基金項目（31401306）；福建省生態(tài)學重點學科項目（6112C0611）；福建農(nóng)林大學科技發(fā)展資金項目（KF2015039）

陳鴻飛（1977-），男，福建莆田人，實驗師，博士，主要從事作物生理與分子生態(tài)學研究。

林文雄（1957-），男，福建莆田人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事作物生理與分子生態(tài)學研究。