王玉，劉奔，曲金力，俞曉，馮楠楠，錢碧云,△

YY1基因在肺癌組織中的表達(dá)及其對肺癌細(xì)胞功能的影響

王玉1，劉奔1，曲金力2，俞曉3，馮楠楠3，錢碧云1,3△

摘要：目的檢測轉(zhuǎn)錄因子YY1在肺癌組織中的表達(dá)情況，并分析其對肺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的影響。方法應(yīng)用Taqman探針實時熒光定量PCR方法檢測235例肺癌組織以及62例配對癌旁組織中YY1 mRNA的表達(dá)，并分析其表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。應(yīng)用Lipofectamine 3000試劑在肺癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染YY1過表達(dá)質(zhì)粒及對照質(zhì)粒。噻唑藍(lán)（MTT）分別檢測對照組和YY1過表達(dá)組在24、48及72 h時A549和H1299細(xì)胞增殖能力的變化。劃痕實驗和Transwell實驗檢測YY1過表達(dá)對肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果與癌旁組織（5.80± 0.58）相比，YY1 mRNA在肺癌組織（5.07±0.58）中表達(dá)下調(diào)（P<0.01），且YY1 mRNA的表達(dá)在不同性別、吸煙狀態(tài)、病理類型及臨床分期中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。YY1過表達(dá)組H1299細(xì)胞增殖能力在48 h和72 h均低于對照組（P<0.01），A549細(xì)胞在72 h低于對照組（P<0.05）。劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染過表達(dá)YY1質(zhì)粒后，肺癌細(xì)胞的侵襲能力及遷移能力明顯下降（P<0.05）。結(jié)論YY1在肺癌組織中低表達(dá)，上調(diào)YY1的表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

關(guān)鍵詞:肺腫瘤；細(xì)胞系,腫瘤；細(xì)胞遷移分析；腫瘤侵潤；轉(zhuǎn)錄因子YIN-YANG 1；A549細(xì)胞；H1299細(xì)胞

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（81573231）；天津市自然科學(xué)基金資助項目（13JCYBJC23100）

作者單位：1天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，腫瘤研究所腫瘤分子流行病與生物統(tǒng)計研究室，國家腫瘤臨床研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（郵編300060）；2天津市西青區(qū)疾病預(yù)防控制中心；3上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

作者簡介：王玉（1991），女，碩士在讀，主要從事腫瘤分子流行病學(xué)研究

△

通訊作者E-mail:qianbiyun@126.com

在我國，肺癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居首位［1］。肺癌是一個多基因參與的過程，癌基因和抑癌基因在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2-4］。轉(zhuǎn)錄因子YIN-YANG 1（YY1）是鋅指類轉(zhuǎn)錄因子GLl-Kruppel家族的一員，有研究表明YY1能抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生［5］。但有關(guān)YY1在肺癌中的表達(dá)及其與肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的關(guān)系尚鮮見報道。本研究采用實時熒光定量PCR方法檢測肺癌組織和癌旁組織中YY1的表達(dá)，并采用體外實驗觀察YY1過表達(dá)對肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為進(jìn)一步研究肺癌的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制提供線索。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標(biāo)本235例肺癌組織及62例配對癌旁組織（同一患者距癌組織5 cm以上的正常肺組織）均來自于2007年6月—2011年8月在天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院實施手術(shù)切除的患者組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實為原發(fā)性肺癌。患者年齡23～83歲，平均年齡（60.99±9.81）歲。既往無其他惡性腫瘤史。TNM分期參考國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2009年肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑和儀器Trizol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國）；Taqman Gene Expression Master Mix、GAPDH基因（Hs02758991_g1）和YY1基因（Hs00998747_m1）Taqman熒光探針（Applied Biosystems公司，美國）；RPMI 1640、胎牛血清（FBS）及胰酶（HyClone公司，美國）；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司，美國）；matrigel膠、Transwell小室（BD公司，美國）；快速瑞氏-姬姆薩染色試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；YY1過表達(dá)質(zhì)粒（GV144-YY1）、對照質(zhì)粒（GV144）購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所保存。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)水平取約50 mg新鮮冰凍肺癌組織在液氮中研磨，至細(xì)粉末狀后加入1 mL Trizol試劑，按照試劑說明書提取總RNA，放于-80℃冰箱保存。5 μg總RNA根據(jù)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系5 μL：2.5 μL 2×gene expression Mix、0.25 μL 20×Taqman gene probe、0.4 μL cDNA、1.85 μL DEPC水。反應(yīng)條件：50℃2 min；95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，40個循環(huán)。每個樣本反應(yīng)設(shè)復(fù)孔3個。以GAPDH為內(nèi)參，基因的相對表達(dá)量用lg2-ΔΔCt（取對數(shù)后表達(dá)量呈正態(tài)分布）表示：ΔCt=CtYY1-CtGAPDH；ΔΔCt=ΔCt-ΔCtYY1mean。采用YY1過表達(dá)質(zhì)粒及對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞至1.5 mL EP管，加入1 mL Trizol充分裂解細(xì)胞，后續(xù)抽提RNA及逆轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量PCR的步驟與組織基因表達(dá)檢測方法相同。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299，0.25%胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后細(xì)胞貼壁，融合率達(dá)到70%～80%，采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.3MTT實驗用0.25%胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞制成細(xì)胞懸浮液，以每孔3×103個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100 μL，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱。待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染YY1過表達(dá)質(zhì)粒和對照質(zhì)粒。每組設(shè)6個復(fù)孔。分別于24、48、72 h后，向待測孔中加入50 μL 1×MTT溶液，孵育4 h后，吸去待測孔中的上清液，加入150 μL DMSO。輕輕震蕩使紫色結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀在550 nm波長處檢測光密度（OD）值。

1.2.4細(xì)胞劃痕實驗取適量對數(shù)生長期細(xì)胞（2×105個/mL），待貼壁后轉(zhuǎn)染YY1過表達(dá)質(zhì)粒和對照質(zhì)粒。培養(yǎng)24 h后細(xì)胞融合度達(dá)100%，用無菌的10 μL槍頭劃出等寬的直線，PBS清洗脫落的細(xì)胞，更換新培養(yǎng)基。置于37℃5%CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在200倍顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，并拍攝0、48 h的細(xì)胞遷移圖像。

1.2.5Transwell小室遷移和侵襲實驗將matrigel膠與無血清RPMI 1640按1∶4比例混合，每孔加80 μL的稀釋膠，置于37℃、1 h，膠凝固后加入50 μL無菌PBS水化基底膜，放于37℃、30 min。將Transwell小室放入24孔板中，在下室中加入750 μL含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，避免其與小室之間產(chǎn)生氣泡。用胰酶消化轉(zhuǎn)染YY1過表達(dá)質(zhì)粒和對照質(zhì)粒24 h后的細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)調(diào)整其密度，將500 μL細(xì)胞密度為4×104個/mL的細(xì)胞懸浮液加入覆蓋matrigel膠的上室，500 μL細(xì)胞密度為2×104個/mL的細(xì)胞懸浮液加入沒有matrigel膠的上室。培養(yǎng)24 h后，取出小室，PBS清洗3次，棉簽拭去Transwell小室上表面的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞后進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色。用200倍的倒置顯微鏡計數(shù)穿透膜的細(xì)胞數(shù)，每個樣品設(shè)3個重復(fù)孔，每孔計數(shù)3個視野，計算平均值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。配對資料比較采用配對t檢驗，2組比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肺癌組織中YY1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系235例肺癌組織中，62例肺癌組織的YY1 mRNA表達(dá)水平（5.07±0.58）低于與其配對癌旁組織（5.80±0.58），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.084，P< 0.01）。235例肺癌患者中，不同性別、病理類型、臨床分期、是否吸煙患者的肺癌組織中YY1 mRNA表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），在不同年齡分組間YY1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2YY1對肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24 h，YY1過表達(dá)組和對照組的A549 和H1299細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染后48 h，YY1過表達(dá)組的H1299細(xì)胞增殖能力較對照組降低（P<0.01），而A549細(xì)胞2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染后 72 h，YY1過表達(dá)組的A549和H1299肺癌細(xì)胞增殖能力較對照組明顯下降（P< 0.05），見表2。

Tab.1　Association between expression of YY1mRNA and clinic pathological parameters of patients with lung cancer表1肺癌組織中YY1 mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

Tab.2　The effect of YY1 over-expression on proliferation of A549 and H1299 cells表2　YY1過表達(dá)對A549和H1299細(xì)胞增殖能力的影響

2.3YY1對肺癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用YY1過表達(dá)組YY1 mRNA表達(dá)（15.22±2.24）高于對照組（1.00±0.06），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.977，n=3，P< 0.01）。細(xì)胞劃痕實驗表明，過表達(dá)YY1后，肺癌細(xì)胞A549和H1299的細(xì)胞遷移均受到明顯抑制，見圖1。Transwell小室遷移實驗顯示，A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞YY1過表達(dá)組與對照組相比，穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)減少（P<0.01）。Transwell小室侵襲實驗顯示，YY1過表達(dá)組與對照組相比，A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的侵襲能力下降（P<0.01），見表3。

Fig.1　The wound healing assay showed that the effect of YY1 on migration of A549 and H1299 cells(×200)圖1　劃痕實驗檢測上調(diào)YY1后對肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299遷移能力的影響（×200）

Tab.3　The effect of YY1 over-expression on migration and invasion of A549 and H1299 cells表3　YY1對A549和H1299細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響（n=3，個，±s）

Tab.3　The effect of YY1 over-expression on migration and invasion of A549 and H1299 cells表3　YY1對A549和H1299細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響（n=3，個，±s）

＊＊P<0.01

組別對照組YY1過表達(dá)組t A549遷移細(xì)胞數(shù)102.67±14.19 9.33±2.30 11.245＊＊侵襲細(xì)胞數(shù)29.00±2.65 6.00±2.65 10.647＊＊H1299遷移細(xì)胞數(shù)169.67±28.34 23.00±3.60 8.864＊＊侵襲細(xì)胞數(shù)63.00±7.21 14.67±1.53 11.357＊＊

3　討論

YY1的功能涉及細(xì)胞增殖調(diào)控、分化、凋亡等生物學(xué)過程［5］。近年來，YY1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受關(guān)注，目前在胃癌、食管癌、直腸癌、胰腺癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已有報道，在肺癌中的報道較少。但YY1在不同的腫瘤類型中發(fā)揮的作用不同。Luo等［6］研究發(fā)現(xiàn)YY1在食管癌組織中高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，其高表達(dá)患者預(yù)后較差，表明YY1與食管癌的進(jìn)展密切相關(guān)。但Yokoyama等［7］研究表明YY1參與Wnt信號通路的調(diào)節(jié)，抑制LEF-1的表達(dá)，從而抑制直腸癌發(fā)生。同時，Zhang等［8］研究發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，在胰腺癌組織中YY1高表達(dá)，且其高表達(dá)患者預(yù)后較好，表明YY1在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮潛在的抑癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中YY1的表達(dá)量低于癌旁的正常組織，且在臨床分期Ⅰ、Ⅱ期的肺癌組織中表達(dá)量高于Ⅲ、Ⅳ期，表明YY1可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

Ishii等［9］研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌和惡性膠質(zhì)瘤中，YY1可抑制PCNA的表達(dá)和Rb的磷酸化，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Lee等［10］研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)YY1可抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231裸鼠移植瘤在體內(nèi)的生長形成，明顯抑制腫瘤的生長。但是，在食管癌和胃癌研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)YY1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［6，11］，其可能原因為腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性。本研究結(jié)果顯示在肺癌細(xì)胞中上調(diào)YY1的表達(dá)后，肺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力明顯受到抑制，提示YY1在肺癌中展現(xiàn)為抑癌基因特征，然而其在肺癌中的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究探索。Wang等［12-13］的研究發(fā)現(xiàn)YY1可通過上調(diào)HLJ1表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移，與本研究結(jié)果一致。尚鮮見研究闡明YY1在肺癌中的作用機(jī)制，本研究通過臨床樣本驗證及細(xì)胞功能研究提示YY1與肺癌發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系，YY1在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到抑癌的作用，是一個潛在的抑癌基因，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。

參考文獻(xiàn)

［1］Chen WQ，Zhang SW，Zeng HM，et al.Report of cancer incidence and mortality in China，2010［J］.China Cancer，2014，23（1）：1-10.［陳萬青，張思維，曾紅梅，等.中國2010年惡性腫瘤發(fā)病與死亡［J］.中國腫瘤，2014，23（1）：1-10］.doi：10.11735/j. issn.1004-0242.2014.01.A001.

［2］Lee B，Lee T，Lee SH，et al.Clinicopathologic characteristics of EGFR，KRAS，and ALK alterations in 6，595 lung cancers［J］. Oncotarget，2016 Mar 14.doi：10.18632/oncotarget.8074.［Epub ahead of print］.

［3］Smardova J，Liskova K，Ravcukova B，et al.Complex analysis of the p53 tumor suppressor in lung carcinoma［J］.Oncol Rep，2016，35 （3）：1859-1867.doi：10.3892/or.2015.4533.

［4］Wang FM，Zhang H，Xu FX，et al.Study on the relationship between expression of miRNAs and receptors of epidermal growth factors in lung adenocarcinoma of non-smoking female［J］.Tianjin Med J，2016，44（3）：336-340.［王富民，張寰，許芳秀，等.非吸煙女性肺腺癌組織中miRNAs的表達(dá)與表皮生長因子受體關(guān)系的研究［J］.天津醫(yī)藥，2016，44（3）：336-340］.doi：10.11958/ 20150331.

［5］Zhang Q，Stovall DB，Inoue K，et al.The oncogenic role of Yin Yang 1［J］.Crit Rev Oncog，2011，16（3/4）：163-197.

［6］Luo J，Jiang X，Cao L，et al.Expression of YY1 correlates with progression and metastasis in esophageal squamous cell carcinomas ［J］.Onco Targets Ther，2014，7：1753-1759.doi：10.2147/OTT. S66667.

［7］Yokoyama NN，Pate KT，Sprowl S，et al.A role for YY1 in repression of dominant negative LEF-1 expression in colon cancer ［J］.Nucleic Acids Res，2010，38（19）：6375-6388.doi：10.1093/ nar/gkq492.

［8］Zhang JJ，Zhu Y，Xie KL，et al.Yin Yang-1 suppresses invasion andmetastasisofpancreaticductaladenocarcinomaby downregulating MMP10 in a MUC4/ErbB2/p38/MEF2C-dependent mechanism［J］.Mol Cancer，2014，13：130.doi：10.1186/1476-4598-13-130.

［9］Ishii H，Hulett MD，Li JM，et al.Yin Yang-1 inhibits tumor cell growth and inhibits p21WAF1/Cip1 complex formation with cdk4 and cyclin D1［J］.Int J Oncol，2012，40（5）：1575-1580.doi：10.3892/ijo.2012.1362.

［10］Lee MH，Lahusen T，Wang RH，et al.Yin Yang 1 positively regulates BRCA1 and inhibits mammary cancer formation［J］. Oncogene，2012，31（1）：116-127.doi：10.1038/onc.2011.217.

［11］Wang AM，Huang TT，Hsu KW，et al.Yin Yang 1 is a target of microRNA-34 family and contributes to gastric carcinogenesis［J］. Oncotarget，2014，5（13）：5002-5016.doi：10.18632/oncotarget.2073.

［12］Wang CC，Tsai MF，Hong TM，et al.The transcriptional factor YY1 upregulates the novel invasion suppressor HLJ1 expression and inhibits cancer cell invasion［J］.Oncogene，2005，24（25）：4081-4093.doi：10.1038/sj.onc.1208573.

［13］Wang CC，Tsai MF，Dai TH，et al.Synergistic activation of the tumor suppressor，HLJ1，by the transcription factors YY1 and activator protein 1［J］.Cancer Res，2007，67（10）：4816-4826.doi：10.1158/0008-5472.CAN-07-0504.

（2016-03-02收稿2016-04-19修回）

（本文編輯李國琪）

中圖分類號：R734.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.11958/20160105

Expression of YY1 in lung cancer tissue and its effect on lung cancer cells

WANG Yu1,LIU Ben1,QU Jinli2,YU Xiao3,FENG Nannan3,QIANBiyun1,3△
1 Department of Epidemiology and Biostatistics,Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy,Ministry of Education,Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,National Clinical Research Center of Cancer, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin 300060,China;2 Xiqing District Center for Disease Control and Prevention,Tianjin；3 School of Public Health,Shanghai Jiao Tong University△Corresponding AuthorE-mail:qianbiyun@126.com

Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of transcriptional factor YY1 in lung cancer tissues and discuss its function in cell proliferation,migration and invasion.MethodsThe mRNA expression of YY1 was determined by realtime quantitative PCR in 235 samples of lung cancer tissues and 62 samples of adjacent tumor tissues,and its relationship with clinical pathological characteristics was analyzed.Non-small cell lung cancer(NSCLC)cell lines were transfected with YY1 over-expression vector and negative control vector using Lipofectamine 3000.The proliferation of cells was measured by MTT in control group and YY1 over-expression group after 24 h,48 h and 72 h of transfection in A549 and H1299 cells. Wound-healing assay and Transwell assay were performed to investigate the effect of YY1 over-expression on the invasion and migration of lung cancer cells.ResultsCompared to normal adjacent tissues(5.80±0.58),the expression of YY1 mRNA was significantly lower in lung cancer tissues(5.07±0.58,P<0.01)．There were significant differences in the expression levels of YY1 mRNA between gender,smoking status,histology subtypes or clinical stages(P＜0.05).Furthermore,compared to control group,the over-expression of YY1 was found to suppress the proliferation for 48 h and 72 h in H1299 cells(P<0.01),and A549 cell for 72 h(P<0.05).Wound-healing assay and Transwell assay showed that the over-expression of YY1 inhibited migratory and invasive capability of lung cancer cells(P<0.05).Conclusion The expression level of YY1 mRNA is lower in lung cancer tissue,and YY1 suppresses proliferation,migration and invasion of lung cancer cells.

Key words:lung neoplasms;cell line,tumor;cell migration assays;neoplasm invasiveness;YIN-YANG 1 transcription factor;A549 cells;H1299 cells