梅潔花 崔 冬 王 勤 溫鵬強(qiáng) 徐明國 唐 根 劉 琮 李成榮 王國兵

·論著·

急性期川崎病γ干擾素組蛋白乙?；淖兗耙饬x初探

梅潔花1,3崔 冬1,3王 勤2溫鵬強(qiáng)1徐明國1唐 根1劉 琮1李成榮1王國兵1

目的 探討急性期川崎病(KD)患兒IFN-γ組蛋白乙?；淖兗捌湓贙D免疫發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 以2015年2月至2016年6月深圳市兒童醫(yī)院診斷并住院治療的KD患兒為KD組，經(jīng)IVIG治療后為KD-IVIG組，KD組依冠狀動脈有無損傷分為冠狀動脈損傷(KD-CAL+)亞組和無冠狀動脈損傷(KD-CAL-)亞組，于IVIG治療前、后取血備檢；同期體檢的健康兒童為對照組。采用染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測外周血CD4+T細(xì)胞IFN-γ組蛋白H3乙酰化水平及組蛋白乙?；竝300和去乙?；窰DAC1/2結(jié)合水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD4+IFN-γ+細(xì)胞(Th1)比例及IFN-γ、pSTAT4、pSTAT5和T-bet蛋白表達(dá)水平；實時熒光定量PCR檢測CD4+T細(xì)胞IFN-γ、IL-2Rα/β、IL-12Rβ1/2、IL-18Rα/β和ITLR4 mRNA表達(dá)；ELISA檢測外周血漿中IL-12、IL-2和IL-18濃度。結(jié)果 ①KD患兒38例(男20例)，年齡1～5.2歲；KD-CAL+亞組16例，KD-CAL-亞組22例。對照組32例(男17例)，年齡1.2～4.9歲。KD組和對照組年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。②急性期KD患兒Th1細(xì)胞比例、IFN-γmRNA和蛋白表達(dá)及其組蛋白乙酰化水平顯著高于對照組(P<0.05)，且KD-CAL+亞組高于KD-CAL-亞組(P<0.05)，經(jīng)IVIG治療后明顯恢復(fù)(P<0.05)。③急性期KD患兒CD4+T細(xì)胞IFN-γ組蛋白乙?；竝300結(jié)合水平顯著增加(P<0.05)，HDAC1/2結(jié)合水平明顯降低(P<0.05)，p300/HDAC1/2明顯高于對照組且與IFN-γ組蛋白H3乙酰化水平呈正相關(guān) (r=0.52;P<0.05)，經(jīng)IVIG治療后均有所恢復(fù)(P<0.05)。其中KD-CAL+亞組p300結(jié)合水平及p300/HDAC1/2比值均高于KD-CAL-亞組 (P<0.05)，而HDAC1/2結(jié)合水平則低于后者(P<0.05)。④急性期KD患兒血漿IL-2、IL-12和IL-18濃度顯著增高(P<0.05)，CD4+T細(xì)胞表面受體IL-2Rα/β、IL-12Rβ1/2、IL-18Rα/β和TLR4及其下游信號分子pSTAT5、pSTAT4、T-bet和MyD88表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，且KD-CAL+亞組前述各項均高于KD-CAL-亞組(P<0.05)，經(jīng)IVIG治療后均有不同程度恢復(fù)(P<0.05)。結(jié)論 IFN-γ組蛋白過度乙酰化可能是導(dǎo)致急性期KD患兒免疫功能紊亂的重要因素之一。

川崎??； IFN-γ； 組蛋白乙?；?Th1細(xì)胞； 免疫

川崎病(KD)是一種急性免疫功能紊亂所致的全身血管炎綜合征，其病因及發(fā)病機(jī)制迄今仍未完全闡明[1-3]。Ⅰ型輔助性T細(xì)胞(Th1)是一類介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的T細(xì)胞亞群，其數(shù)量或功能異常可導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[4-6]。IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的標(biāo)志性細(xì)胞因子，在其分化、成熟及免疫功能中發(fā)揮著重要作用。研究已證實外界刺激或細(xì)胞微環(huán)境改變可導(dǎo)致Th1細(xì)胞IFN-γ蛋白表達(dá)及功能異常[7-9]，但調(diào)節(jié)IFN-γ表達(dá)的分子機(jī)制尚不完全清楚。組蛋白乙酰化是一種常見的表觀遺傳學(xué)修飾，通過改變?nèi)旧|(zhì)的空間結(jié)構(gòu)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性[10,11]。本文通過觀察KD患兒IFN-γ基因組蛋白乙?；揎椉跋嚓P(guān)信號的改變，探討導(dǎo)致急性期KD患兒Th1細(xì)胞異?；罨目赡芊肿訖C(jī)制，從而進(jìn)一步闡明KD及其血管損傷的免疫發(fā)病機(jī)制。

1 方法

1.1 研究設(shè)計 以病例對照研究設(shè)計。收集入住遵義醫(yī)學(xué)院深圳市兒童醫(yī)院(我院)的KD患兒，以急性期KD患兒為KD組、同期我院體檢的健康兒童為對照組，觀察KD組及其IVIG治療后IFN-γ組蛋白乙?；拖嚓P(guān)信號分子的表達(dá)變化。

1.2 倫理和知情同意 本研究經(jīng)我院倫理委員會審核同意。KD組患兒分別于急性期及IVIG治療有效后4～5 d取血備檢，對照組于體檢當(dāng)日取血備檢 ；兩組受試兒童及其父母或監(jiān)護(hù)人了解本研究的目的，自愿參與本研究。

1.3 KD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]日本川崎病研究會制定的標(biāo)準(zhǔn)：①體溫39～40℃﹥5 d；②急性期手腳末梢出現(xiàn)紅腫，第2～4周時可能在手腳掌或指尖及肛門周圍產(chǎn)生脫皮現(xiàn)象；③多形性紅斑；④兩側(cè)性結(jié)膜炎，結(jié)膜充血、發(fā)紅，通常無分泌物；⑤口腔黏膜變化，如草莓舌、口腔咽喉黏膜充血，嘴唇紅腫、干裂甚至流血；⑥急性非化膿性頸部淋巴結(jié)腫大，單側(cè)或雙側(cè)，直徑﹥1.5 cm。除符合第①項之外，還需要滿足②～⑥中的4項，并且排除其他可以引起類似癥狀的疾病。病程10 d以內(nèi)且未使用IVIG治療，視為急性期KD患兒 。

1.4 KD冠狀動脈損傷診斷指標(biāo) KD患兒均分別于急性期及IVIG治療后行心臟彩色多普勒檢查。①冠狀動脈擴(kuò)張：<3歲冠狀動脈內(nèi)徑﹥2.5 mm，～5歲冠狀動脈內(nèi)徑﹥3.0 mm，≥5歲冠狀動脈內(nèi)徑﹥4.0 mm；②冠狀動脈瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)：①冠狀動脈內(nèi)徑>4 mm, ≤8 mm；≥ 5歲年長兒冠狀動脈擴(kuò)張的內(nèi)徑為正常的 1.5～4倍, 診斷為冠脈瘤；②巨大冠脈瘤：冠狀動脈內(nèi)徑>8 mm； ≥ 5歲年長兒冠狀動脈擴(kuò)張的內(nèi)徑大于正常4倍，診斷為巨大冠脈瘤。

1.5 分組 KD患兒依據(jù)IVIG使用前后分為KD組和KD-IVIG組，KD組依據(jù)有無冠狀動脈損傷分為冠狀動脈損傷(KD-CAL+)亞組和無冠狀動脈損傷(KD-CAL-)亞組，健康兒童為對照組。

1.6 KD組納入標(biāo)準(zhǔn) 2015年2月至2016年6月來我院就診并被診斷為KD急性期的住院患兒。

1.7 對照組納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 同期我院保鍵科體檢的、年齡與KD組盡量匹配的健康兒童，排除先天性心臟病、遺傳性疾病等。

1.8 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.8.1IL-2Rα/β、IL-12Rβ1/2、IL-18Rα/β、TLR4和MyD88基因轉(zhuǎn)錄水平檢測 采用實時熒光定量PCR方法，① 無菌采集乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA·Na2)抗凝靜脈血3 mL，采用免疫磁珠(美國LifeTec公司, 111.45 D)分離CD4+T細(xì)胞，并抽提總RNA。② 按試劑盒(美國Thermo公司，K1632)說明， 將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。③ 根據(jù)Genebank中IL-2Rα/β、IL-12Rβ1/2、IL-18Rα/β、TLR4、MyD88和β-actinmRNA序列設(shè)計引物(表1 )，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增并送交上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致。④ 參照SYBR Green試劑盒(德國Qiagen公司，204143)說明定量分析，結(jié)果以目的基因/β-actin的比值表示。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.8.2IFN-γ基因組蛋白H3乙酰化及乙?；竝300和去乙酰化酶HDAC1/2結(jié)合水平檢測 采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)，① 用含1%甲醛的PBS重懸部分已分離的CD4+T細(xì)胞， 37℃交聯(lián)10 min。經(jīng)含1mM PMSF, 1μg·mL-1aprotinin 和1μg·mL-1pepstatin A的冷PBS洗滌2次后，重懸于200 μL SDS裂解液，冰上孵育10 min;。② 采用超聲法打斷基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定片段長度為400～600 bp后，參照染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒(美國Upstate公司，17-295)說明， 分別加入抗Acetyl-H3、p300和HDAC1/2抗體，分離input DNA和抗體特異性結(jié)合DNA。 ③ 根據(jù)IFN-γ基因序列設(shè)計引物，參照SYBR Green試劑盒(德國Qiagen，204143)說明進(jìn)行定量分析，分別計算抗Acetyl-H3、p300和HDAC1/2抗體特異性結(jié)合DNA與input DNA比值。

1.8.3 血漿IL-2、IL-12和IL-18濃度檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。KD患兒及對照組兒童空腹6 h后，取外周血2 mL以肝素抗凝，500 g離心10 min，分離上層血漿；參照試劑盒(美國eBioscience公司，BMS221HS*、BMS238HS*和BMS267/2*)說明，檢測血漿IL-2、IL-12和IL-18濃度。

1.8.4 Th1細(xì)胞比例及IFN-γ、pSTAT4、pSTAT5和T-bet蛋白水平檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測，① 采用密度梯度離心法分離外周血PBMC，重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入20 ng·mL-1PMA、1 μg·mL-1Ionomycin和2 μmol·L-1Monensin刺激6小時；以CD4-eFluro450設(shè)門，固定、破膜，經(jīng)IFN-γ-FITC抗體胞內(nèi)染色30 min，檢測CD4+IFN-γ+(Th1)細(xì)胞比例及IFN-γ蛋白表達(dá)水平；② 以CD4-eFluro450設(shè)門，固定、破膜，經(jīng)pSTAT4-PE、pSTAT5-Alexa647和T-bet-PE-Cy7抗體核內(nèi)染色30 min，檢測CD4+T細(xì)胞pSTAT4、pSTAT5和T-bet蛋白表達(dá)水平。所有數(shù)據(jù)經(jīng)Diva軟件獲取分析，蛋白表達(dá)水平以平均熒光強(qiáng)度(MFI)表示。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 符合本文納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的KD患兒38例進(jìn)入本文分析，其中男20例、女18例，年齡1～5.2歲，平均年齡(2.9±1.3)歲；KD-CAL+亞組16例，KD-CAL-亞組22例。對照組32例，其中男17例，女15例，年齡1.2～4.9歲，平均年齡(2.8±1.3)歲。KD組和對照組年齡(t=0.32，P=0.97) 、性別(χ2=0.002，P=0.97) 差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 Th1細(xì)胞比例、IFN-γ表達(dá)及組蛋白乙?；瘷z測結(jié)果 表2和圖1、2顯示，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)和real-time PCR觀察到急性期KD患兒Th1細(xì)胞比例及IFN-γ蛋白水平顯著增高(P<0.05)，其中KD-CAL+亞組前述二項均高于KD-CAL-亞組(P<0.05)，經(jīng)IVIG治療后明顯恢復(fù)(P<0.05)；進(jìn)一步分析IFN-γ基因組蛋白H3乙酰化及mRNA水平，發(fā)現(xiàn)急性期KD患兒CD4+T細(xì)胞IFN-γ組蛋白H3乙酰化及mRNA水平顯著增加(P<0.05)，且KD-CAL+亞組IFN-γ組蛋白H3乙?；癿RNA水平明顯高于KD-CAL-亞組 (P<0.05)，經(jīng)IVIG治療后均明顯恢復(fù)(P<0.05)。

表2 KD患兒外周血Th1細(xì)胞比例及IFN-γ組蛋白乙?；嚓P(guān)因子流式細(xì)胞檢測結(jié)果( ±s)

注 1)與對照組比較，P<0.05；2)與KD-CAL-亞組比較P<0.05；3) 與KD組比較，P<0.05

圖1 KD患兒Th1細(xì)胞及相關(guān)分子流式細(xì)胞檢測結(jié)果

注 A：Th1細(xì)胞檢測結(jié)果；B：IFN-γ及其組蛋白乙酰化相關(guān)分子檢測結(jié)果

2.3IFN-γ組蛋白乙?；?去乙酰化酶檢測結(jié)果 圖2顯示，經(jīng)ChIP檢測組蛋白乙酰化酶p300、去乙酰化酶HDAC1/2與IFN-γ基因的結(jié)合水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性期KD患兒CD4+T細(xì)胞IFN-γ基因p300結(jié)合水平顯著增加(P<0.05)，而HDAC1/2結(jié)合水平明顯降低(P<0.05)，導(dǎo)致p300/HDAC1/2明顯高于對照組且與IFN-γ組蛋白H3乙?；匠收嚓P(guān)關(guān)系(r=0.52;P<0.05)，經(jīng)IVIG治療后均有所恢復(fù)(P<0.05)。進(jìn)一步比較KD-CAL+和KD-CAL-亞組上述各項表達(dá)，發(fā)現(xiàn)KD-CAL+亞組IFN-γ基因p300結(jié)合水平及p300/HDAC1/2比值均高于KD-CAL-亞組 (P<0.05)，而HDAC1/2結(jié)合水平則低于后者(P<0.05)。

2.4IFN-γ組蛋白乙?；嚓P(guān)因子檢測結(jié)果 表2、3和圖1、3顯示，急性期KD患兒血漿IL-2、IL-12和IL-18濃度顯著增加(P<0.05)，且KD-CAL+亞組IL-2、IL-12和IL-18濃度均高于KD-CAL-亞組(P<0.05)，經(jīng)IVIG治療后均有所恢復(fù)(P<0.05)。進(jìn)一步分析炎癥因子受體及TLR下游信號分子，發(fā)現(xiàn)急性期KD患兒CD4+T細(xì)胞表面受體IL-12Rβ1/2、IL-2Rα/β、IL-18Rα/β和TLR4及其下游信號分子pSTAT4、T-bet、pSTAT5和MyD88表達(dá)顯著上調(diào)，且KD-CAL+亞組上述各項均高于KD-CAL-亞組(P<0.05)，經(jīng)IVIG治療后均有不同程度恢復(fù)(P<0.05)。

圖2 KD患兒IFN-γ組蛋白H3乙?；皃300、HDAC1/2結(jié)合水平檢測結(jié)果

注 A：CD4+T細(xì)胞基因組DNA超聲破碎瓊脂糖凝膠電泳圖；B：IFN-γ基因組蛋白乙?；疕3Ac水平及p300、HDAC1/2結(jié)合水平檢測結(jié)果，各組結(jié)果經(jīng)匯總后以直方圖形式表示；1)與對照組比較，P<0.05；2)與KD-CAL-亞組比較P<0.05；3) 與KD組比較，P<0.05

表3 KD患兒血漿IFN-γ組蛋白乙?；嚓P(guān)因子ELISA

注 1)與對照組比較，P<0.05；2)與KD-CAL-亞組比較P<0.05；3) 與KD組比較，P<0.05

3 討論

KD病因及發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚，大量的臨床、流行病學(xué)資料和免疫學(xué)觀察指標(biāo)提示，KD可能是感染引起急性自身免疫功能紊亂所致[1-3]，但導(dǎo)致KD自身免疫功能異?；罨臋C(jī)制仍有待闡明。Th1是一類介導(dǎo)細(xì)胞免疫功能的T細(xì)胞亞群，可通過表達(dá)FasL直接介導(dǎo)細(xì)胞毒作用或分泌細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2等)活化免疫活性細(xì)胞而促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)，其數(shù)量異?；蚬δ苷系K可導(dǎo)致免疫功能紊亂[4-6]。國外報道及本研究顯示，急性期KD患兒Th1細(xì)胞比例及IFN-γ蛋白表達(dá)異常增加，其中KD-CAL+亞組前述二項均明顯高于KD-CAL-亞組，經(jīng)IVIG治療后明顯恢復(fù)，提示KD及血管損傷的發(fā)病機(jī)制可能與Th1細(xì)胞數(shù)量及功能異常有關(guān)，但導(dǎo)致KD患兒Th1細(xì)胞數(shù)量及功能異常的分子機(jī)制仍不完全清楚。

圖3 KD患兒IFN-γ組蛋白H3乙?；嚓P(guān)分子檢測結(jié)果

注 1)與對照組比較P<0.05，2)與KD-CAL-組比較P<0.05，3)與KD組比較P<0.05

IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的標(biāo)志性分子，在Th1細(xì)胞分化、成熟及免疫功能中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其表達(dá)受細(xì)胞因子信號、表觀遺傳學(xué)修飾等多種因素調(diào)節(jié)[7-9]。組蛋白乙?；且环N常見的表觀遺傳學(xué)修飾，可將乙?；D(zhuǎn)移至組蛋白而使包繞在核小體外圍的染色質(zhì)形成松散、開放的空間結(jié)構(gòu)，從而有利于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合并啟動基因表達(dá)[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)急性期KD患兒CD4+T細(xì)胞IFN-γ基因組蛋白H3乙?；癿RNA表達(dá)水平顯著增加，且KD-CAL+亞組IFN-γ基因組蛋白H3乙?；癿RNA水平均高于KD-CAL-亞組，經(jīng)IVIG治療后均明顯恢復(fù)，提示IFN-γ基因組蛋白過度乙酰化可能是導(dǎo)致急性期KD患兒Th1細(xì)胞數(shù)量及功能異常的重要因素之一。

調(diào)節(jié)IFN-γ基因組蛋白乙?；姆肿訖C(jī)制仍未完全闡明。p300是一種組蛋白乙?；?，可在輔因子CBP協(xié)助下，催化IFN-γ基因組蛋白發(fā)生乙?；痆8,13-15]。而去乙?；窰DAC1/2與Sin3A等蛋白形成免疫復(fù)合物Sin3A-HDAC1/2，后者結(jié)合至IFN-γ基因序列并促使組蛋白發(fā)生去乙?；瑥亩鴧⑴c調(diào)節(jié)IFN-γ基因組蛋白乙?；絒16]。本研究發(fā)現(xiàn)急性期KD患兒CD4+T細(xì)胞IFN-γ基因p300結(jié)合水平顯著增加，而HDAC1/2結(jié)合水平明顯降低，導(dǎo)致p300/HDAC1/2比值明顯高于對照組且與IFN-γ組蛋白H3乙?；匠收嚓P(guān)關(guān)系，經(jīng)IVIG治療后均有所恢復(fù)。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)KD-CAL+亞組IFN-γ基因p300結(jié)合水平及p300/HDAC1/2比值均高于KD-CAL-亞組，而HDAC1/2結(jié)合水平則低于后者，提示IFN-γ基因組蛋白過度乙?；赡芘cp300和HDAC1/2的結(jié)合水平異常有關(guān)。既往的研究已證實IL-12可與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)下游信號分子STAT4發(fā)生磷酸化并募集T-bet、p300/CBP共同結(jié)合至IFN-γ基因序列，促使與IFN-γ基因結(jié)合的Sin3A-HDAC1/2發(fā)生解離，從而催化相關(guān)的組蛋白發(fā)生乙?；痆8,13-15]。與此相類似的是，IL-2亦可通過下游信號分子STAT5募集p300/CBP而介導(dǎo)IFN-γ基因組蛋白乙酰化[17,18]。另有研究表明IL-18刺激或TLR4信號可通過其共同的下游信號促進(jìn)p300的表達(dá)及乙酰化酶活性并抑制HDAC1/2去乙?；富钚?，從而增強(qiáng)IFN-γ基因組蛋白乙?；絒8,19-21]。而靜脈注射IVIG經(jīng)Fc段與細(xì)胞表面受體結(jié)合，可通過抑制DC成熟和炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生、下調(diào)TLR受體表達(dá)等機(jī)制介導(dǎo)抗炎作用，從而維持免疫系統(tǒng)動態(tài)平衡[22,23]。為探討導(dǎo)致KD患兒IFN-γ基因p300和HDAC1/2結(jié)合水平異常的可能分子機(jī)制及IVIG的藥物動力學(xué)影響，本研究比較了各組血漿IL-12、IL-2和IL-18濃度，發(fā)現(xiàn)急性期KD患兒IL-12、IL-2和IL-18濃度顯著增高，且KD-CAL+亞組IL-12、IL-2和IL-18濃度均高于KD-CAL-亞組，經(jīng)IVIG治療后均有所恢復(fù)。進(jìn)一步分析炎癥因子受體及TLR下游信號分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)急性期KD患CD4+T細(xì)胞表面受體IL-12Rβ1/2、IL-2Rα/β、IL-18Rα/β和TLR4及其下游信號分子pSTAT4、T-bet、pSTAT5和 MyD88表達(dá)顯著上調(diào)，且KD-CAL+亞組前述各項均高于KD-CAL-亞組，經(jīng)IVIG治療后均有不同程度恢復(fù)，提示炎癥因子及TLR信號過度活化可能是導(dǎo)致急性期KD患兒IFN-γ基因p300和HDAC1/2結(jié)合水平異常的關(guān)鍵因素，而IVIG或可通過抑制炎癥因子及TLR4信號而調(diào)節(jié)p300、HDAC1/2結(jié)合水平。

基于上述結(jié)果，推測感染因素觸發(fā)了KD患兒細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致IL-12、IL-2和IL-18等炎癥因子的大量產(chǎn)生，造成組織損傷并釋放內(nèi)源性配體。在炎癥因子及內(nèi)、外源性配體誘導(dǎo)的TLR4信號的共同作用下IFN-γ基因組蛋白乙?；竝300結(jié)合水平明顯增加，而去乙?；窰DAC1/2結(jié)合水平顯著降低，從而促使IFN-γ基因組蛋白過度乙?；险{(diào)其表達(dá)，最終導(dǎo)致Th1細(xì)胞數(shù)量及功能異常。而IVIG可通過抑制炎癥因子及TLR4信號調(diào)節(jié)IFN-γ基因組蛋白乙酰化酶p300、HDAC1/2結(jié)合水平，進(jìn)而促進(jìn)IFN-γ表達(dá)及Th1細(xì)胞恢復(fù)。但組蛋白乙?；且环N較為復(fù)雜的酶促動力學(xué)過程，是否存在其他因素參與調(diào)節(jié)IFN-γ基因組蛋白乙酰化仍有等進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：張崇凡，孫晉楓)

Changesandsignificancesofhistone3acetylationofIFN-γgeneduringacutephaseofKawasakidisease

MEIJie-hua1,3,CUIDong1,3,WANGQin2,WENPeng-qiang1,XUMing-guo1,TANGGen1,LIUCong1,LICheng-rong1,WANGGuo-bing1

(1ShenzhenInstituteofPediatrics,ShenzhenChildren'sHospital,ZunyiMedicalCollege,Shenzhen518038,China; 2LabCentre,ShenzhenMaternity&ChildHealthcareHospital,SouthernMedicalUniversity,Shenzhen518028,China; 3hasequalcontribution)

Corresponding Author：WANG Guo-bing, E-mail: rogasan@163.com

ObjectiveTo investigate the changes and significances of histone 3 acetylation ofIFN-γgene in patients with acute Kawasaki disease(KD). MethodsChildren with KD were enrolled in Shenzhen Children's Hospital from February 2015 to June 2016, and sub-grouped as with or without coronary artery lesions (CAL). Age-matched healthy children attending routine physical examination were recruited as controls during the same period. Chromatin immunoprecipitation was performed to determine acetylation level of histone 3 ofIFN-γgene, and binding level of histone acetyltransferase p300 and deacetylase HDAC1/2 withIFN-γgene. The proportion of CD4+IFN-γ+ cells (Th1) and protein levels of IFN-γ, pSTAT4, pSTAT5 and T-bet were analyzed by flow cytometry. Quantitative real-time PCR was used to evaluate the levels ofIFN-γ,IL-2Rα/β,IL-12Rβ1/2,IL-18Rα/βandITLR4 mRNA in CD4+T cells. Plasma concentrations of IL-12, IL-2 and IL-18 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results① Thirty-eight children with KD, including 16 children with CAL (KD-CAL+) and 22 children without CAL(KD-CAL-), aged from 1 to 5.2 years with a mean of 2.9 years were recruited. The KD group consisted 20 males and 18 females, and 32 age-matched healthy children with 17 males were recruited as controls. No difference of age or sex was found between the two groups(P>0.05). ② The proportion of Th1, expression levels of IFN-γ protein and mRNA, and acetylation levels of histone 3 ofIFN-γgene increased remarkably during acute KD(P<0.05), and restored after IVIG therapy(P<0.05). Meanwhile, all the four items aforementioned in KD-CAL+ subgroup were higher than those in KD-CAL- subgroup (P<0.05). ③ During acute KD, binding level of p300 withIFN-γgene was up-regulated significantly whereas binding level of HDAC1/2 withIFN-γgene was down-regulated(P<0.05), resulting in the higher ratio of p300/HDAC1/2 that was positive correlated with the acetylation level ofIFN-γgene in patients in acute KD(r=0.52,P<0.05). Moreover, binding level of p300 withIFN-γgene and the ratio of p300/HDAC1/2 in KD-CAL+ subgroup were higher than those in KD-CAL- subgroup (P<0.05), while a lower binding level of HDAC1/2 withIFN-γgene was found in KD-CAL+ subgroup (P<0.05). All the three items mentioned above restored remarkably after IVIG treatment(P<0.05). ④ In comparison with healthy controls, plasma concentration of inflammatory cytokines (IL-2, IL-12 and IL-18), expression levels of their receptors(IL-2Rα/β, IL-12Rβ1/2, IL-18Rα/β and TLR4) and downstream molecules (pSTAT5, pSTAT4, T-bet and MyD88) were elevated pronouncedly during acute KD(P<0.05), and restored to some extent after IVIG treatment (P<0.05). Simultaneously, all the items mentioned before in KD-CAL+ subgroup were higher than those in KD-CAL- subgroup (P<0.05). ConclusionHyper-acetylation of histone ofIFN-γgene might be one of the important factors contributing to immune dysfunction of KD.

Kawasaki disease; IFN-γ; Histone acetylation; T helper cell 1 type; Immune

國家自然科學(xué)基金：81102227，81300124；深圳市科技計劃項目：JCYJ20140416141331464， JCYJ20140416141331478，JCYJ20150403100317055；深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研項目：201401053，201402042，201501032資助

1 遵義醫(yī)學(xué)院深圳市兒童醫(yī)院兒科研究所 深圳，518038；2 南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院中心實驗室 深圳，518028；3 并列第一作者

王國兵，E-mail: rogasan@163.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.06.002

2016-10-12

2016-12-18)