靳玲俠，楊佳紅，李 琛，閔鎖田，魏雅雯

研究與開發(fā)

5-甲基胞嘧啶互變異構(gòu)體熱力學(xué)穩(wěn)定性及質(zhì)子遷移機理的理論研究

靳玲俠1，楊佳紅1，李 琛1，閔鎖田1，魏雅雯2

（1.陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點實驗室，陜西 漢中 723001；2.長安大學(xué)出版科學(xué)研究所，陜西 西安710064 ）

采用密度泛函理論，在B3LYP/6-31++G//B3LYP/6-31G基組水平上對5-甲基胞嘧啶互變異構(gòu)體及質(zhì)子轉(zhuǎn)移機理進行了研究，獲得了10種5-甲基胞嘧啶互變異構(gòu)體及12個異構(gòu)化過渡態(tài)，并獲得了互變異構(gòu)過程的反應(yīng)焓、活化能、活化吉布斯自由能和質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的速率常數(shù)等性質(zhì)。計算結(jié)果表明，5-甲基胞嘧啶各互變異構(gòu)體的相對熱力學(xué)穩(wěn)定性為：M1＞M3＞M4＞M5＞M6＞M2＞M7＞M8＞M9＞M10。其中氨-酮式結(jié)構(gòu)M1能量最低，穩(wěn)定性最高；亞氨-烯醇式結(jié)構(gòu)M10相對能量最高，穩(wěn)定性最低。在5-甲基胞嘧啶的異構(gòu)化過程中，部分異構(gòu)體之間可以相互轉(zhuǎn)化，其中鍵旋轉(zhuǎn)較質(zhì)子遷移所需活化能較低，反應(yīng)較易實現(xiàn)。由氨酮式M1通過分子內(nèi)質(zhì)子遷移及鍵旋轉(zhuǎn)異構(gòu)轉(zhuǎn)化共有6條反應(yīng)通道，其主通道（5）速控步驟的活化能為163.81 kJ·mol-1，反應(yīng)較難實現(xiàn)。

5-甲基胞嘧啶；密度泛函理論方法；互變異構(gòu)；過渡態(tài)

由于生物體內(nèi)堿基分子普遍存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，且這種互變異構(gòu)是發(fā)生變異的基礎(chǔ)，使得生物體內(nèi)這種互變異構(gòu)現(xiàn)象成為近年來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一［1-2］。核酸5種堿基中的酮基和氨基，均位于堿基環(huán)中氮原子的鄰位， 可以發(fā)生酮式、烯醇式或氨基、亞氨基之間的結(jié)構(gòu)互變，這種互變異構(gòu)在基因的突變和生物的進化中具有重要作用［3-4］。

實驗研究表明［5-6］，DNA鏈上某些分子片段的甲基化對抑制基因表達、維持染色體結(jié)構(gòu)、X染色體失活、基因印記及腫瘤的發(fā)生等有著重要影響。在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶（5-MeCyt）是唯一存在的化學(xué)性修飾堿基，是稀有堿基的一種形式，是胞嘧啶殘基的重要組成之一。5-MeCyt在DNA鏈上明顯地去甲基化或者去氨基生成胞嘧啶或胸腺嘧啶，從而引發(fā)基因突變，導(dǎo)致人類發(fā)生許多的病變［7］。

文獻報道［8］，Adamowicz等采用紅外光譜法對該化合物異構(gòu)體的穩(wěn)定性以及在氣相中的互變異構(gòu)現(xiàn)象進行了研究，證明在惰性氣體中該化合物主要以4種互變異構(gòu)體形式存在，其中包括烯醇式-亞胺式、烯醇式-氨基式、酮式-氨基式。5-MeCyt通過分子內(nèi)H遷移可形成酮式-醇式多種互變異構(gòu)體，而不同異構(gòu)體都可以與其它堿基發(fā)生配對。由于對含量低于0.1%～1.0%的異構(gòu)體，實驗上很難檢測到［9］，在堿基對復(fù)制過程中，異構(gòu)體含量在10-8～10-11即會發(fā)生自發(fā)變異，導(dǎo)致遺傳變異異構(gòu)體的濃度比實驗可檢測到的最低濃度還要低若干個數(shù)量級，因此，用實驗方法直接檢測導(dǎo)致堿基對錯配的微量異構(gòu)體形式，研究異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化機理比較困難。盡管Sambroano等采用DFT方法已經(jīng)研究了7種5-MeCyt異構(gòu)體的穩(wěn)定性及3對互變異構(gòu)現(xiàn)象［10］，但遺憾的是，到目前為止，還未見關(guān)于5-MeCyt烯醇式-亞胺式、烯醇式-氨基式、酮式-氨基式互變異構(gòu)動力學(xué)機理理論研究的報道。因此，從理論上研究揭示標題化合物質(zhì)子轉(zhuǎn)移互變異構(gòu)機理及動力學(xué)性質(zhì)具有重要的實際意義。本文利用密度泛函理論B3LYP方法，在6-31++G//6-31G水平上對標題化合物分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移互變異構(gòu)反應(yīng)動力學(xué)進行了計算研究，分別獲得了5-MeCyt鍵旋轉(zhuǎn)及質(zhì)子遷移異構(gòu)的反應(yīng)焓、活化能、活化吉布斯自由能和速控步驟的速率常數(shù)等性質(zhì)，這些理論計算結(jié)果對于5-甲基胞嘧啶性質(zhì)的實驗研究具有一定的參考價值。

1 計算方法

采用密度泛函B3LYP方法對質(zhì)子遷移及鍵旋轉(zhuǎn)異構(gòu)化體系的研究已有不少文獻報道，且取得了與實驗研究極為相符的結(jié)果［11-15］。因此，本文選用B3LYP/6-31G方法，對5-甲基胞嘧啶質(zhì)子遷移及互變異構(gòu)化反應(yīng)路徑上的各駐點（反應(yīng)物、產(chǎn)物和過渡態(tài)）的幾何構(gòu)型進行了全優(yōu)化，通過振動頻率計算對各駐點進行了確認，同時獲得了零點能、總能量、熱焓和吉布斯自由能，并在相同水平上進行內(nèi)稟反應(yīng)坐標（IRC）［16］計算，以證實反應(yīng)物、過渡態(tài)和產(chǎn)物的相關(guān)性。全部計算采用Gaussian03程序包［17］在PIV微機上完成。

2 結(jié)果與討論

圖1給出了5-甲基胞嘧啶異構(gòu)體的幾何結(jié)構(gòu)，各異構(gòu)體的非氫原子編號是一致的，具體編號已在圖中標出，以Mn （n=1～10）命名。根據(jù)圖1中異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)，本文設(shè)計了2種可能的反應(yīng)途徑：（a）鍵旋轉(zhuǎn)異構(gòu)化；（b）分子內(nèi)質(zhì)子遷移異構(gòu)化。

圖1 B3LYP/6-31G方法水平上10種5-甲基胞嘧啶異構(gòu)體的幾何構(gòu)型（鍵長： ?，鍵角： °）

振動頻率分析表明，所有異構(gòu)體的振動頻率均為實頻，表明均為勢能面上的穩(wěn)定點；而所有過渡態(tài)有且僅有一個虛振動頻率，表明均為勢能面上的一階鞍點，而且虛振動模式矢量展示了從一個異構(gòu)體走向另一個異構(gòu)體的趨勢，表明圖2中列出的過渡態(tài)是真實可信的。

2.1 異構(gòu)體的相對穩(wěn)定性

表1列出了氣相5-甲基胞嘧啶異構(gòu)體及過渡態(tài)總能量ET、零點能EZPE、相對能ER和異構(gòu)化反應(yīng)過渡態(tài)的虛頻v。比較表1中10種異構(gòu)體能量可知，在室溫氣相中，各異構(gòu)體的相對穩(wěn)定性為M1＞M3＞M4＞M5＞M6＞M2＞M7＞M8＞M9＞M10。其中氨-酮式結(jié)構(gòu)的M1相對能量最低，穩(wěn)定性最高，亞氨-烯醇式結(jié)構(gòu)的M10相對能量最高，穩(wěn)定性最低。次穩(wěn)定的亞氨-酮式結(jié)構(gòu)的相對能量為7.82 kJ·mol-1。Mezey［18］指出，當2種互變異構(gòu)體的能量差值在40 kJ·mol-1以內(nèi)時，其互變異構(gòu)體可平衡存在于同一體系中。據(jù)此可推測，5-甲基胞嘧啶的氨-酮式結(jié)構(gòu)M1與亞氨-酮式結(jié)構(gòu)M3和M4、氨-烯醇式結(jié)構(gòu)M5和M6、氨-酮式結(jié)構(gòu)M2在氣相中可平衡共存，這與Adamowicz的紅外光譜法的實驗結(jié)論一致。比較表1中數(shù)據(jù)還發(fā)現(xiàn)，4種亞氨-烯醇式結(jié)構(gòu)M7、M8、M9和M10的相對能量均在70kJ·mol-1以上，可見氣相時均不是穩(wěn)定異構(gòu)體。

2.2 鍵旋轉(zhuǎn)異構(gòu)化及質(zhì)子遷移異構(gòu)化機理

5-甲基胞嘧啶鍵旋轉(zhuǎn)異構(gòu)化及分子內(nèi)質(zhì)子遷移反應(yīng)過程中涉及的各駐點物種的幾何構(gòu)型如圖2所示。由于過渡態(tài)中氫的位置不同，因此采用HT來表示。計算結(jié)果表明，圖2中所有異構(gòu)體及過渡態(tài)羥基O-H上H原子在內(nèi)，各原子均處在同一平面中，這種構(gòu)型有利于分子內(nèi)氫鍵形成。其中TSM5/M6、TSM3/M4、TSM7/M8和TSM9/M10屬于鍵旋轉(zhuǎn)異構(gòu)化的過渡態(tài)，而TSM1/M3、TSM1/M5、TSM6/M2、TSM3/M10、TSM5/M7、TSM3/M7、TSM4/M9和TSM4/ M8屬于分子內(nèi)質(zhì)子遷移異構(gòu)化的過渡態(tài)。

表 1 5-甲基胞嘧啶體系中各駐點電子結(jié)構(gòu)能量E、零點能EZPE、 總能量ET、相對能量ER及異構(gòu)化反應(yīng)過渡態(tài)虛頻v

圖2 B3LYP/6-31G方法計算得到的12個5-甲基胞嘧啶過渡態(tài)構(gòu)型（鍵長： ?，鍵角： °）

在5-甲基胞嘧啶分子中，由于HT原子鍵連位置不同，導(dǎo)致5-甲基胞嘧啶存在多種異構(gòu)體形式。因此，我們從5-甲基胞嘧啶異構(gòu)體M1出發(fā)，研究了5-甲基胞嘧啶異構(gòu)體的互變異構(gòu)化過程。通過對所有可能的反應(yīng)途徑的嘗試，找到了如下6條反應(yīng)通道，分別是：

圖3示出了分子內(nèi)質(zhì)子遷移及鍵旋轉(zhuǎn)異構(gòu)化的反應(yīng)勢能面剖面圖。從表1和圖3看出，通道（1）、（2）中第三步異構(gòu)化反應(yīng)M4→TSM4/M8→M8、M4→TSM4/M9→M9所需活化能均高于其它兩步，是反應(yīng)的速控步驟；通道（3）、（4）、（6）中第二步異構(gòu)化反應(yīng)M3→TSM3/M7→M7、M3→TSM3/ M10→M10、M5→TSM5/M7→M7所需活化能均高于其它兩步，是反應(yīng)的速控步驟；通道（5）中第一步異構(gòu)化反應(yīng)M1→TSM1/M5→M5所需活化能均高于其它兩步，是反應(yīng)的速控步驟。因此，各通道速率控制步驟的活化能分別為204.82、204.12、192.23、225.32、163.81和192.26 kJ·mol-1。通道（5）速控步驟M1→TSM1/M5→M5的活化能最低，且形成的中間體M5、M6和M2的相對能量較低，是熱力學(xué)上的優(yōu)勢異構(gòu)體。通道（1）和（2）的速控步驟所需活化能幾乎相同，但形成產(chǎn)物M8和M9的相對能量極高。因此，從各通道各步驟活化能大小及各異構(gòu)體相對能量高低等因素分析判斷，可以認為，通道（5）是最有利的異構(gòu)化反應(yīng)路徑。因此可以預(yù)測，氣相中5-甲基胞嘧啶主要以氨-酮式異構(gòu)體M1形式存在，同時也會有微量的氨-烯醇式異構(gòu)體M5和M6以及痕量的氨-酮式M2同時存在。

以下僅以通道（5）為例來分析異構(gòu)化過程幾何構(gòu)型的變化。結(jié)合圖1和圖2可以看出，當氨-酮式異構(gòu)體M1經(jīng)過渡態(tài)TSM1/M5使HT由N1轉(zhuǎn)移到O2，形成中間體氨-烯醇式異構(gòu)體M5時，C2=O2鍵的鍵長由1.240?增大至1.360?，C2-N3鍵由1.380?減小至1.330?，說明隨著HT的轉(zhuǎn)移，C2=O2逐漸向單鍵轉(zhuǎn)變，而C2-N3逐漸向雙鍵轉(zhuǎn)變。同時，在HT轉(zhuǎn)移過程中，嘧啶環(huán)形狀發(fā)生較大變化，環(huán)內(nèi)鍵角N1C2N3增大了11.4o，C2N3C4減小了4.5o，N3C4C5增大了-2.0o，環(huán)外鍵角O2C2N3減小了9.5o。第二步經(jīng)過渡態(tài)TSM5/M6是氨-烯醇式異構(gòu)體M5和M6的互變異構(gòu)化過程，使O-H鍵繞C2-O2鍵旋轉(zhuǎn)約90°形成產(chǎn)物M6時，除了鍵長C2-N3由原來的0.1340 nm縮小至1.330?外，其余鍵長及鍵角等參數(shù)均未發(fā)生大的變化。因此，鍵旋轉(zhuǎn)異構(gòu)化所需的活化能較低，僅有34.49 kJ·mol-1。第三步經(jīng)過渡態(tài)TSM6/M2，使HT由O2轉(zhuǎn)移至N3形成氨-酮式，C2-O2、C2-N3等的鍵長以及鍵角等參數(shù)也發(fā)生類似于步驟1的變化。單雙鍵轉(zhuǎn)變及環(huán)骨架的顯著改變必然需要較大的變形能量。所以5-甲基胞嘧啶分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移異構(gòu)化的活化能較高，這與胞嘧啶分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移異構(gòu)化的結(jié)果相似。另外，比較第一步質(zhì)子遷移經(jīng)歷的過渡態(tài)TSM1/M5以及第三步質(zhì)子遷移經(jīng)歷的過渡態(tài)TSM6/M2的結(jié)構(gòu)和表1中的數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，對結(jié)構(gòu)相似的過渡態(tài)，其相對能量也很相近。

3 結(jié)論

本文通過B3LYP/6-31++G//B3LYP/6-31G方法對5-甲基胞嘧啶10種異構(gòu)體穩(wěn)定性以及各異構(gòu)體間相互轉(zhuǎn)化機理的詳細計算研究，可得出如下結(jié)論：

1） 5-甲基胞嘧啶各互變異構(gòu)體的相對熱力學(xué)穩(wěn)定性為：M1＞M3＞M4＞M5＞M6＞M2＞M7 ＞M8＞M9＞M10。其中氨-酮式結(jié)構(gòu)的M1能量最低，穩(wěn)定性最高，亞氨-烯醇式結(jié)構(gòu)的M10相對能量最高，穩(wěn)定性最低。

圖 3 分子內(nèi)質(zhì)子遷移及鍵旋轉(zhuǎn)異構(gòu)化時的反應(yīng)勢能剖面圖

2） 在5-甲基胞嘧啶的異構(gòu)化過程中，質(zhì)子遷移反應(yīng)涉及化學(xué)鍵的斷裂，其活化吉布斯自由能較大，反應(yīng)較難進行。鍵旋轉(zhuǎn)異構(gòu)化過程僅需要單鍵旋轉(zhuǎn)即可完成，其活化吉布斯自由能較小，反應(yīng)較易進行。

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Theoretical Study on Thermodynamic Stability of Tautomers and Proton Transfer Isomerization of 5-Methylcytosine

JIN Ling-xia1， YANG Jia-hong1， LI Chen1， MIN Suo-tian1， WEI Ya-wen2
（1.Shaanxi Province Key Laboratory of Catalytic Fundamentals & Applications， School of Chemical & Environment Science， Shaanxi University of Technology， Hanzhong 723001， China； 2.Institute of publication Science， Chang’an University， Xi’an 710064， China）

The stability and tautomerism mechanisms of 5-methylcytosine had been investigated by the B3LYP/6-31++G//B3LYP/6-31G level of theory. 10 tautomers and 12 transition states were located and a variety of possible reaction pathways were probed. The reaction enthalpies， activation energies， activation free energies and the rate constants of tautomerism were also obtained. The results showed that the order of the thermodynamic stability of tautomers was： M1＞M3＞M4＞M5＞M6＞M2＞M7＞M8＞M9＞M10. The aminoketo form was the predominant isomer. 6 reaction pathways from amino-keto to other isomers were found by intramolecular proton transfer and tautomerisms process. The main pathway （5） associated with the activation energy was 163.8 kJ/mol， which was of no advantage to the reaction.

5-methylcytosine； density functional theory method； tautomerism； transition state

O 642

A

1671-9905（2016）06-0001-05

中央高校基金資助項目（310850160322）；陜西省教育廳專項科研基金項目（16JK1153）；陜西理工學(xué)院科研基金資助項目資助（SLGQD14-10， SLGKYQD2-13）

靳玲俠（1981-），女，講師，博士，主要從事小分子反應(yīng)機理的理論研究。E-mail： jinlx@snut.edu.cn

2016-04-06