何承輝 康小龍 劉晶 盧軍

摘要：目的 觀察刺山柑總生物堿對系統(tǒng)性硬皮?。⊿Sc）小鼠血清白細胞介素（IL）-4、IL-13和干擾素-γ（IFN-γ）水平的影響，探討其治療SSc組織纖維化的作用機制。方法 BALB/c小鼠背部注射鹽酸博萊霉素建立SSc模型。將90只小鼠隨機分為對照組、模型組、陽性藥組和刺山柑總生物堿低、中、高劑量組。刺山柑總生物堿各劑量組小鼠背部分別外敷相應劑量刺山柑總生物堿乳膏，陽性藥組給予青霉胺藥液灌胃，對照組和模型組背部外敷不含藥基質(zhì)，1次/d，連續(xù)60 d。末次給藥后，ELISA檢測小鼠血清IL-4、IL-13和IFN-γ含量。結(jié)果 與模型組比較，刺山柑總生物堿中、高劑量組小鼠血清IL-4含量降低（P<0.01），刺山柑總生物堿高劑量組小鼠血清IFN-γ含量升高（P<0.01），刺山柑總生物堿各劑量組小鼠血清IL-13含量無明顯變化。結(jié)論 刺山柑總生物堿可能通過調(diào)節(jié)小鼠SSc IL-4異常表達，調(diào)節(jié)IL-4/IFN-γ失衡，改善SSc組織纖維化。

關(guān)鍵詞：刺山柑總生物堿；系統(tǒng)性硬皮?。话准毎樗?4；干擾素-γ；白細胞介素-13；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.020

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）08-0077-03

系統(tǒng)性硬皮病（systemic sclerosis，SSc）是一種

以皮膚和內(nèi)臟器官纖維化、免疫異常及血管病變?yōu)樘卣鞯慕Y(jié)締組織病。刺山柑Capparis spinosa L.為白花菜科Capparaceae山柑屬Capparis L.植物，系維吾爾醫(yī)習用藥材之一，其性味辛苦溫，具有祛風散寒、除濕、消腫止痛、擴張血管的功效。有研究表明，刺山柑乙醇提取物可抑制SSc患者成纖維細胞增殖及Ⅰ型膠原的合成[1]；刺山柑鮮果75%乙醇調(diào)制的糊膏以及刺山柑流浸膏均能顯著抑制硬皮病模型小鼠的真皮增厚、膠原沉積[2]。本課題組前期研究表明，刺山柑總生物堿可通過調(diào)節(jié)小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑失衡，減少Ⅳ型膠原合成，改善SSc組織纖維化[3]。本實驗采用BALB/c小鼠背部注射鹽酸博萊霉素建立SSc模型，觀察刺山柑總生物堿對SSc小鼠血清白細胞介素（IL）-4、IL-13和干擾素-γ（IFN-γ）水平的影響，探討其治療SSc組織纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

8周齡清潔級BALB/c小鼠90只，體質(zhì)量18～24 g，新疆實驗動物研究中心，合格證號SCXK（新）2003-0002。飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境，正常飲食飲水。

1.2 藥物及制備

刺山柑藥材購自新疆麥迪森維藥有限公司飲片廠，經(jīng)新疆藥物研究所何江研究員鑒定為正品。刺山柑總生物堿乳膏制備方法：將刺山柑總生物堿與基質(zhì)混勻，水浴加熱至90 ℃使熔融，作為油相；甘油與濃縮液混合于水浴加熱至90 ℃，作為水相；十二烷基硫酸鈉、對羥基苯甲酸乙酯溶于適量水中，于水浴加熱使溶解，作為乳化劑；當油相、水相溫度降至85 ℃時，依次將水相和乳化劑加入油相中，至乳化完全。鹽酸博萊霉素粉針劑，日本化藥株式會社，批號430312；青霉胺片，上海信誼藥廠，批號052130503。

1.3 主要試劑與儀器

小鼠IL-4、IFN-γ ELISA試劑盒（美國R&D;公司），小鼠IL-13 ELISA試劑盒（上海江萊生物科技公司）。酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司。

1.4 分組、造模及給藥

實驗小鼠隨機分為對照組、模型組、陽性藥組和刺山柑總生物堿低、中、高劑量組，每組15只。實驗前用剃毛刀將背部毛剃除。采用皮下注射鹽酸博萊霉素粉針劑300 μg/mL制備SSc小鼠模型[4]，每日1次，每次0.1 mL，共4周，觀察小鼠背部注射部位皮膚是否出現(xiàn)皮膚增厚、彈性變差等變化。4周后，刺山柑總生物堿低、中、高劑量組小鼠背部分別外敷225、450、900 mg/kg刺山柑總生物堿乳膏，陽性藥組予125 mg/kg青霉胺藥液灌胃，對照組和模型組背部外敷不含藥基質(zhì)。1次/d，連續(xù)60 d。

1.5 小鼠血清白細胞介素-4、白細胞介素-13和干擾素-γ含量測定

末次給藥后4 h，小鼠摘除眼球取血，4000 r/min離心10 min，分離血清，ELISA檢測血清IL-4、IFN-γ和IL-13含量，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 刺山柑總生物堿對模型小鼠血清白細胞介素-4和干擾素-γ含量的影響

與對照組比較，模型組小鼠血清IL-4含量明顯升高，IFN-γ含量明顯降低，IL-4/IFN-γ比值明顯上升（P<0.01）；與模型組比較，刺山柑總生物堿中、高劑量組和陽性藥組小鼠血清IL-4含量明顯降低，IL-4/IFN-γ比值明顯下降（P<0.05，P<0.01）；刺山柑總生物堿高劑量組IFN-γ含量明顯升高（P<0.01），刺山柑總生物堿中劑量組和陽性藥組小鼠IFN-γ水平均較模型組有上升的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

2.2 刺山柑總生物堿對模型小鼠血清白細胞介素-13含量的影響

與對照組比較，模型組小鼠血清IL-13含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，刺山柑總生物堿各劑量組和陽性藥組小鼠血清IL-13含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

3 討論

研究表明，多種細胞因子參與SSc患者成纖維細胞膠原基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[5]。在諸多細胞因子中，IFN-γ僅由活化的天然殺傷細胞和輔助T淋巴細胞1（Th1）合成，體外抑制成纖維細胞增殖和膠原合成，抑制纖維化過程的進展，而IL-4則由輔助T淋巴細胞2（Th2）、肥大細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞合成，它在外傷及纖維化過程中起重要作用[6]。IL-4可刺激成纖維細胞增殖和膠原生成，細胞間黏附分子、IL-6的表達及趨化作用，它與IFN-γ作用相反，但是與IL-13之間有共同的受體和生物學活性，均能導致基質(zhì)累積[7]。此外，IL-4還可以活化轉(zhuǎn)化生長因子-β的轉(zhuǎn)錄，編碼促纖維化因子，影響膠原蛋白啟動子的活性[8]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠血清IL-4水平明顯升高，IFN-γ水平明顯降低，IL-4/IFN-γ比值增大，刺山柑總生物堿中、高劑量均可降低小鼠血清IL-4水平，減小IL-4/IFN-γ比值。提示刺山柑總生物堿可能通過調(diào)節(jié)SSc模型小鼠IL-4異常表達，調(diào)節(jié)IL-4/IFN-γ失衡，改善SSc組織纖維化。本研究還發(fā)現(xiàn)，刺山柑總生物堿僅高劑量能升高IFN-γ水平，低、中劑量和陽性藥對IFN-γ水平無明顯影響，提示刺山柑總生物堿及陽性藥青霉胺可能對IFN-γ的調(diào)節(jié)作用不明顯；另外，刺山柑總生物堿中劑量組及陽性藥組小鼠IFN-γ水平均較模型組有上升的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，這可能與實驗周期有關(guān)，還需進一步研究。

IL-13是多種細胞的免疫調(diào)節(jié)因子，目前認為它參與很多皮膚病及免疫疾病的發(fā)病及轉(zhuǎn)歸過程[9]。在SSc早期階段IL-13可促進纖維組織增生及內(nèi)皮細胞的增殖。甲皺襞毛細血管鏡檢查發(fā)現(xiàn)，SSc甲皺襞血管內(nèi)血液淤積、出血、血管擴張。這些改變與血漿中IL-13水平升高相關(guān)，表明此種因子不僅參與SSc的免疫反應和硬化過程，而且在嚴重的微血管損傷中發(fā)揮作用[10]。本研究亦發(fā)現(xiàn)模型組血清IL-13含量明顯升高，刺山柑總生物堿對小鼠血清IL-13含量無明顯影響，提示刺山柑總生物堿可能對SSc小鼠血清IL-13的異常升高無影響。

SSc的治療一直是皮膚科較為棘手的問題，至今仍是困擾醫(yī)學界的難題，中醫(yī)藥治療為該病提供了新思路。許多藥物如丹參、桃仁等單味中藥在臨床和實驗研究均被證實具有較好的抗纖維化作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)刺山柑總生物堿可糾正Th1/Th2細胞平衡向Th2偏移而干預SSc組織纖維化的發(fā)生，動物實驗的結(jié)果為刺山柑總生物堿用于改善SSc組織纖維化提供了實驗依據(jù)，也為其開發(fā)成為新型治療SSc藥物奠定了基礎。今后將就刺山柑總生物堿如何調(diào)節(jié)SSc Th1/Th2細胞失衡展開更深入的研究。

參考文獻：

[1] 曹越蘭，李欣，王群.槌果藤對硬皮病小鼠模型皮膚硬化抑制作用的實驗研究[J].中國中藥雜志，2008，33（2）：215-217.

[2] 曹越蘭，李欣，鄭敏.槌果藤對進行性系統(tǒng)性硬化癥患者成纖維細胞增殖和Ⅰ型膠原產(chǎn)生的影響[J].中國中藥雜志，2008，33（5）：560-562.

[3] 康小龍，劉晶，何承輝，等.刺山柑總生物堿對系統(tǒng)性硬皮病小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2016，23（3）：51-53.

[4] 沈佚葳，王京，周平.阿維A對硬皮病小鼠的治療作用及機制研究[J].中國醫(yī)藥導報，2013，10（25）：20-22.

[5] 朱鷺冰，高地，李明.轉(zhuǎn)化生長因子β1、結(jié)締組織生長因子和干擾素-γ對系統(tǒng)性硬化病膠原合成異質(zhì)性成纖維細胞克隆膠原基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[J].中國臨床醫(yī)學，2011，18（4）：415-418.

[6] Sergei P Atamas， Barbara White. Complex cytokine regulation of tissue fibrosis[J]. Life Sciences，2002，72（6）：631-643.

[7] 徐清，羅龍飛，雷鐵池.系統(tǒng)性硬皮病伴纖維化改變機制研究進展[J]. 臨床皮膚科雜志，20l3，42（6）：383-385.

[8] 何鈉，林有坤，劉京平.系統(tǒng)性硬皮病與組織纖維化[J].臨床皮膚科雜志，2009，38（8）：546-548.

[9] 毛笑非，孫秋寧.CD8+T細胞在系統(tǒng)性硬皮病組織纖維化中的作用[J]. 生物技術(shù)通訊，2014，25（6）：880-883.

[10] Riccieri V， Rinaldi T， Spadaro A， et al. Interleukin-13 in systemic sclerosis：relationship to nailfold capillaroscopy abnormalities[J]. Clin Rheumatol，2003，22（2）：102-106.

[11] 閆小寧，馮捷，李文彬，等.溫陽除痹湯對硬皮病模型小鼠皮膚結(jié)締組織生長因子及Ⅰ型膠原蛋白表達的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學報，2007， 5（5）：526-530.