林正余智曾博尹康

［Gly14］-Humanin減輕大鼠顱腦外傷后氧化應激及細胞凋亡☆

林正*余智△曾博※尹康*

目的 探討［Gly14］-Humanin（HNG）對大鼠顱腦外傷后腦組織超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和細胞凋亡的影響。方法 135只SD大鼠分為空白組（n=45）、對照組（n=45）及HNG組（n=45），其中對照組及HNG組建立顱腦外傷模型后前者予右側股靜脈注射生理鹽水2 mL/kg，后者則予HNG 2 μL/kg，此后各組每24 h予1次等量生理鹽水/HNG，直至大鼠被處死；而空白組不予任何處理。根據處死時間隨機分為1 h、3 d和7 d 共3個亞組，每亞組各15只。比較損傷灶周圍腦組織MDA、SOD、GSH含量水平及細胞凋亡情況。結果 HNG組大鼠腦組織中MDA含量水平及凋亡細胞計數在損傷后1 h即升高，3 d達到最高值，后開始降低，但7 d時仍高于損傷后1 h水平，均顯著低于同一時間點的對照組及空白組（P均＜0.05）；相反，SOD活性在損傷后迅速降低，3 d達到最低值，隨后逐漸上升，但7 d時仍低于損傷后1 h水平，均顯著高于同一時間點的對照組及空白組（P均＜0.05）；GSH變化規(guī)律與SOD基本一致，與各時間點的對照組比較亦有顯著性（P均＜0.05）；HNG大鼠腦組織損傷后MDA含量水平與細胞凋亡數呈正相關（r=0.720，P＜0.05），而SOD及GSH的含量與細胞凋亡數呈負相關（r=-0.702，P＜0.05；r=-0.674，P＜0.05）。結論 顱腦外傷后HNG抑制氧化應激反應，進一步減少細胞凋亡，從而發(fā)揮神經保護作用。

顱腦損傷 繼發(fā)性腦損傷 ［Gly14］-Humanin氧化應激 細胞凋亡

【Abstract】Objective To investigate the effects of［Gly14］-Humanin（HNG）on SOD，MDA，GSH and cell apoptosis in a rat model of secondary brain injury.Methods One hundred thirty-five adult and healthy male rats were randomly divided into 3 groups：sham model group（n=45），vehicle control group（n=45）and HNG group（n=45）.Secondary brain injury was induced in the vehicle control and HNG groups using improved Feeney method.Vehicle control received abdominal injections of Sodium Chloride Injection（2 ml/kg）whereas the HNG group received abdominal injections of HNG（2 μL/kg）immediately and 24 h after injury.Each group was divided into three subgroups（n=15 rats per each group）by sacrificed time including 1 h，3 d，and 7 d after injury.The expression levels of SOD，MDA and GSH of the brain tissue were analyzed and the cell apoptosis was examined using TUNEL method after brain contusion.Results MDA and cell apoptosis around the lesion started to increased at 1h，reached a peak at 3d and then gradually subsided but still remained a higher level at 7 d than 1 h.HNG significantly attenuated brain injury-induced increase in MDA and apoptosis at all time points（P＜0.05）.By contrast，SOD started to decrease at 1h，reached the lowest point at 3 d and then gradu-ally recovered but still remained a lower level at 7 d than 1 h.HNG significantly mitigated brain injury-induced increase in MDA and apoptosis at all time points（P＜0.05）.The time course of GSH expression followed a pattern similar to that of MDA.MDA expression was strongly positive correlated with the number of cell apoptosis（r=0.720，P＜0.05），strongly negative correlated with the level of SOD and GSH（r=-0.702，P＜0.05；r=-0.674，P＜0.05）.Conclusions After brain injury，HNG inhibits oxidative stress levels and reduces apoptosis，thereby mitigating secondary brain injury.

【Key words】Traumatic brain injury Secondary brain injury［Gly14］-Humanin Oxidative stress Apoptosis

顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的發(fā)病率呈現持續(xù)攀升的趨勢［1］，如何阻止顱腦損傷后繼發(fā)性損傷是研究的熱點。顱腦損傷機制十分復雜，其中氧化應激反應在其整個病理生理過程中發(fā)揮著樞紐性作用。低分子清除劑（如谷胱甘肽等）、酶清除劑（如超氧化合物歧化酶等）以及脂質過氧化的產物丙二醛（MDA）含量廣泛用于衡量氧化應激水平，評估藥物抗氧化應激的作用。既往有研究發(fā)現在機體中樞神經系統發(fā)育過程中，［Gly14］-Humanin（HNG）能抑制TBI誘導的細胞質膜完整性的破壞和自噬的激活［2］，減少腦缺損體積，改善運動和記憶功能障礙，但目前具體保護機制尚未完全闡明。本研究采用改良Feeney法制備顱腦損傷模型，予以HNG干預后，觀察損傷灶周圍腦組織MDA、SOD及GSH含量，同時比較腦挫傷灶周圍細胞凋亡情況，探討顱腦損傷后HNG對繼發(fā)性腦損傷的影響及可能機制，為進一步的臨床應用提供理論依據。

1　材料和方法

1.1研究對象 清潔級SD雄性大鼠135只［浙江大學醫(yī)學院動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（浙）2008-0033］，體質量260～290 g，月齡4～5個月。SD大鼠室溫，常規(guī)飼料、自由飲水。術前12 h禁食不禁水，以隨機數字法分為空白組（n= 45）、對照組（n=45）及HNG組（n=45），再根據傷后處死時間隨機分為1 h、3 d和7 d共3個亞組，每亞組各15只。試劑：HNG（Sigma公司，美國）；超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒及還原型谷胱甘肽（GSH）測試盒（武漢博士德）；原位末端標記（TUNEL）試劑盒（Promega公司）；電子顯微鏡（OLYMPUS，日本）等。

1.2動物模型制備及處置 空白組大鼠未給予任何外傷性干預，自由喂養(yǎng)；對照組及HNG組大鼠均采用改良的霍永強等［3］自由落體腦創(chuàng)傷模型制作閉合性顱腦損傷模型。模型成功標志［4］：存在不同程度的肢體抽搐、瞳孔改變及意識障礙，傷后各項反射消失并在30 min內恢復。待大鼠自然蘇醒后對照組則經左側股靜脈注射生理鹽水2 mL/kg，HNG組立即予以左側股靜脈注射HNG 2 μL/kg，以后每24 h左側股靜脈注射1次等量生理鹽水/ HNG，直至動物被處死。3組共3只大鼠在擊后10 min之內死亡，另隨機抽取雄性SD大鼠補充。

1.3腦組織MDA含量、SOD水平及GSH含量水平測定 將-80℃凍存的距腦挫傷灶邊緣約5 mm處腦皮質約（200±50）mg組織解凍后，嚴格按相關試劑盒檢測要求進行操作。對照組中隨機選取8只大鼠作相同處理。

1.4 TUNEL染色 取距腦挫傷灶后約5 mm厚的腦組織進行固定和石蠟包埋，獲得的組織切片嚴格按照TUNEL染色試劑盒檢測步驟進行操作。凋亡細胞（以胞核出現棕黃染色顆粒代表）計數：每只大鼠在傷側皮質、海馬隨機選取5個高倍視野（×400），計數凋亡細胞數，以平均每100個細胞中含凋亡神經細胞數作為神經細胞凋亡指數。對照組中隨機選取7只大鼠作相同處理。

1.5統計學分析 應用SPSS17.0進行統計處理。實驗數據用±s表示。組內不同時間點比較采用重復測量方差分析（repeated measures-ANOVA）；組間比較在單因素方差分析有意義的基礎上采用多元方差分析進行兩兩比較；兩變量之間相關關系采用Pearson相關分析，檢測水準α=0.05。

2　結果

2.1顱腦損傷后損傷灶周圍腦組織MDA、SOD及GSH的變化 3組MDA含量均在損傷后1 h即升高，3 d達到最高值，此后開始降低，但7 d時仍顯著高于損傷后1 h水平（P均＜0.05）；相反，SOD及GSH活性在損傷后迅速降低（P均＜0.05），3 d達到最低值，隨后逐漸上升，但7 d時仍顯著低于損傷后1 h水平；組內不同時間點比較經重復測量方差分析，協方差矩陣差異有統計學意義（F=1.614，P= 0.009）。3個時間點各指標分析，空白組、對照組與HNG組比較組間各指標均有差異，球形檢驗結果滿足球形假設（0.191），方差分析差異有統計學意義（F=25.986，P＜0.01），提示不同測量時間點之間有顯著差異，組間比較差異有統計學意義（F= 8.831，P＜0.01）；而空白組和對照組間均無統計學差異（P均＞0.05），見表1。

表1三組大鼠顱腦損傷后周圍腦組織中各時間點MDA、SOD及GSH含量的比較（±s）

表1三組大鼠顱腦損傷后周圍腦組織中各時間點MDA、SOD及GSH含量的比較（±s）

注：MDA單位為nmol/mg，SOD單位為U/mg，GSH單位為mg/g。1）采用多元方差分析，與HNG組比較，P＜0.05

組別空白組對照組HNG組n　8 8 8 1h MDA 6.71±0.181）6.07±0.431）4.13±0.21 SOD 11.09±0.171）11.14±0.491）13.59±0.23 GSH 10.13±0.411）8.38±0.381）10.94±0.36組別空白組對照組HNG組3d 7d MDA 12.54±0.261）12.47±0.571）10.94±035 SOD 7.94±0.371）7.87±0.541）9.22±0.36 GSH 8.64±0.331）6.31±0.221）8.14±0.59 MDA 8.43±0.741）8.58±0.361）6.89±0.21 SOD 12.59±0.331）10.03±0.681）12.14±0.59 GSH 9.81±0.351）7.61±0.201）9.24±0.37

2.2顱腦損傷后腦組織細胞凋亡的變化 3組神經細胞凋亡數均在損傷后1 h即升高，3 d達到最高值，此后開始降低，但7 d時仍顯著高于損傷后1 h水平；組內不同時間點比較經重復測量方差分析，協方差矩陣差異有統計學意義（F=1.376，P= 0.007）。3個時間點細胞凋亡指數分析，空白組、對照組與HNG組比較組間各指標均有差異，球形檢驗結果滿足球形假設（0.163），方差分析差異有統計學意義（F=23.548，P＜0.01），提示不同測量時間點之間有差異；組間比較差異有統計學意義（F= 7.973，P＜0.01）；而空白組和對照組間均無統計學差異（P均＞0.05），見（圖1及表2）。

2.3顱腦損傷后腦組織中MDA、SOD、GSH含量水平及細胞凋亡指數相關性分析 HNG大鼠腦組織損傷后MDA的含量與細胞凋亡指數呈正相關（r= 0.720，P＜0.05），而SOD及GSH的含量與細胞凋亡指數呈負相關（r=-0.662，P＜0.05；r=-0.674，P＜0.05）。

3　討論

目前TBI的發(fā)病率呈持續(xù)升高的趨勢［5］，造成勞動力的喪失并花費巨額的醫(yī)療資源，對家庭和社會造成巨大的影響。顱腦損傷后繼發(fā)性腦損傷易導致顱內壓的惡性上升［6］，但其機制十分復雜，主要與氧自由基水平、細胞凋亡、炎癥反應及壞死等緊密相關。因此，如何降低氧自由基水平，從而減少神經細胞的凋亡，減輕繼發(fā)性腦損傷，是目前相關領域研究的熱點和難點。腦外傷后4 h腦組織含水量開始升高，1 d達高峰，持續(xù)至3 d，5 d開始下降，7 d進一步降低。本研究結果同樣發(fā)現顱腦損傷后兩組大鼠腦組織氧化應激反應水平及凋亡細胞數較1 h即升高，3 d達到最高值，且差異有統計學意義（P均＜0.05），與既往關于顱腦損傷機制研究結果相一致［7］。

氧化應激指標中，MDA是氧自由基水平的可靠指標，而SOD及GSH是機體抵抗氧化應激的能力及清除活性氧的重要指標［8］。研究發(fā)現HNG不僅能有效地抑制多種AD相關致病因子誘發(fā)的神經細胞和非神經細胞的死亡，還能保護各種應激對神經細胞和非神經細胞的損傷，包括I/R（hypoxia/reperfusion）誘導的鼠原代皮質神經元凋亡、LPS誘導的原代星形膠質細胞炎癥反應［9］等。最近國外研究人員發(fā)現HNG通過糖原合成酶激酶-3β提供神經保護作用，其作用是通過抑制細胞凋亡相關PI3K-Akt/GSK-3β信號通路，并且發(fā)現HNG對Aβ-（25-35）誘導PC12細胞凋亡的影響［10-11］。

本研究發(fā)現，空白組及對照組大鼠腦組織中MDA含量在損傷后1 h即升高，3 d達到最高值，此后開始降低，但7 d時仍高于損傷后1 h水平，均顯著高于同一時間點HNG組（P均＜0.05）。相反，SOD活性在損傷后迅速降低，3 d達到最低值，隨后逐漸上升，但7 d時仍低于損傷后1 h水平，均顯著低于同一時間點HNG組（P均＜0.05）；GSH變化規(guī)律與SOD基本一致，與HNG組比較亦有顯著性（P均＜0.05）。說明氧自由基的產生及其酶清除活力的下降，導致脂質過氧化增強，在繼發(fā)性腦損傷過程中起關鍵作用。

表2三組大鼠顱腦損傷后周圍腦組織中各時間點細胞凋亡指數的比較（±s）

表2三組大鼠顱腦損傷后周圍腦組織中各時間點細胞凋亡指數的比較（±s）

1）經多元方差分析，與HNG組比較，P＜0.05

組別空白組對照組HNG組n　7 7 7細胞凋亡指數1h 14.73±1.291）15.15±1.831）11.47±1.31 3d 42.30±3.021）45.73±2.761）16.94±0.35 7d 28.60±3.441）27.58±0.681）21.20±2.17

圖1 HNG組各時間點細胞凋亡（TUNEL染色×400），1 h時損傷灶周圍組織少量細胞凋亡，3 d時凋亡細胞數最多，至7 d時有所降低，但仍高于同組損傷后1 h亞組

此外，細胞凋亡（Apoptosis）是細胞在體內外多種因素刺激誘導下，由多種基因調控的主動死亡過程。有研究人員證實，顱腦損傷后細胞凋亡廣泛存在并參與了繼發(fā)性腦損傷的發(fā)展過程［12］。本實驗采用T'UNEL技術檢測了神經細胞的凋亡情況，結果發(fā)現凋亡細胞主要位于損傷灶周圍腦組織中（細胞核為棕褐色）。空白組及對照組存在較多凋亡細胞，損傷后1 h凋亡細胞數量較HNG組明顯增多（P均＜0.05），隨后逐漸增多，并于損傷后3 d達到最高值，7 d時凋亡細胞有所降低，但仍高于損傷后1 h組，均顯著高于同一時間點的HNG組（P均＜0.05），故提示細胞凋亡參與了顱腦損傷后繼發(fā)性腦損傷的發(fā)展過程。本研究還發(fā)現，顱腦損傷后腦組織MDA的含量與細胞凋亡數呈正相關，而SOD及GSH的含量與細胞凋亡數呈負相關，提示氧自由基的激活后促進凋亡相關基因的轉錄表達，從而導致細胞凋亡。

由此可見，HNG可通過降低損傷后的大鼠腦組織中MDA含量水平，升高SOD及GSH的含量水平，抑制氧化應激反應，減輕了大鼠顱腦損傷后繼發(fā)性腦損傷，從而很好的減少細胞凋亡，為該藥在顱腦損傷的治療提供更為廣闊的前景。

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（責任編輯：甘章平）

［Gly14］-Humanin inhibits oxidative stress levels and controls apoptosis after traumatic brain injury in rats.

LIN Zheng，YU Zhi，ZENG Bo，YIN Kang.Department of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China.Tel：0577-55578166.

R651.1

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.03.011
☆浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（編號：201482575）
*浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院神經外科（臺州317500）
△浙江省淳安縣第一人民醫(yī)院神經內科
※溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經外科

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2015-07-20）