李 瓊* 伍 輝（重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，重慶 401120）

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肺癌3p缺失區(qū)基因傳感器的研究

李 瓊* 伍 輝
（重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，重慶 401120）

【摘要】目的 研究3p缺失區(qū)基因傳感器，早發(fā)現(xiàn)人類個體的基因缺失，以便預(yù)測、預(yù)防肺癌的發(fā)生，即使有早期肺癌，本人積極參與治療，也是可以治愈的。方法 采用電化學(xué)中的循環(huán)伏安法與金電極的自組裝法對缺失的靶基因進(jìn)行檢測。結(jié)果 自組裝的金電極用循環(huán)伏安法可檢測出缺失的靶基因。結(jié)論 對3p多個缺失基因的檢測，可早預(yù)防、預(yù)測、治療肺癌，具有較好的臨床意義。

【關(guān)鍵詞】3p缺失區(qū)；基因傳感器；肺癌；金電極；循環(huán)伏安法

醫(yī)學(xué)模式是認(rèn)識健康與疾病等醫(yī)學(xué)問題的思維方法，國家衛(wèi)生部陳竺部長反復(fù)提出與解釋的“4P”醫(yī)學(xué)模式［1］即預(yù)防性（Preventive）、預(yù)測性（Predictive）、個體化（Personalized）和參與性（participatory）更加證明了疾病的預(yù)防、預(yù)測、早診斷、早治療的重要性，同時強調(diào)干預(yù)個體生活行為以達(dá)到預(yù)防疾病、控制發(fā)展的目標(biāo)。

肺癌是世界范圍內(nèi)的主要惡性腫瘤。其發(fā)病率和病死率在許多發(fā)達(dá)國家已上升為惡性腫瘤的第一位。跟大多數(shù)腫瘤一樣，發(fā)展成肺癌需要很長時間，有的需要10年以上，而3p（人類3號染色體短臂）基因部分缺失3年以前就發(fā)生了［2-3］。如果3p缺失基因早測出，提出相應(yīng)的保健干預(yù)措施，對肺癌的早期預(yù)防、預(yù)測、診斷具有非常重要的意義，同時也是“4P”醫(yī)學(xué)模式的一個佐證。

電流型基因［4-5］傳感器即將已知序列的單鏈多核苷酸臉（ssDNA）固定在電極上（該課題是金電極），當(dāng)電極的單鏈核酸與互補靶序列雜交形成雙鏈分子時，能表現(xiàn)出一定的物理信號（電流）改變，可通過電子學(xué)等技術(shù)將信號放大而顯示。該電流型基因傳感器檢測肺癌基因缺失的方法是一種簡單的、可靠的DNA雜交基因傳感器。

該課題基于“4P”醫(yī)學(xué)模式與電流型基因傳感器的可行性，以金為基底，通過巰基與金電極形成Au-s鍵自組裝法固定基因探針，實現(xiàn)對3p缺失區(qū)的基因檢測，為肺癌的預(yù)防、預(yù)測、早診斷提供一個新的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器：電化學(xué)工作站（辰華CHI660，上海辰華儀器有限公司），金電極（直徑3 mm，天津市高仕睿聯(lián)科技有限公司），移液器，Thermo，LIBROR AEL-200電子天平（日本島津公司），BRANSON B3200S-T超聲清洗儀（上海必能信超聲公司）。

1.2 試劑：鐵氰化鉀（5 mmol/L），DNA固定與雜交緩沖液（TE Buffer組成濃度：10 mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH=8.0），3p缺失的4個基因的探針序列見表1。

表1 DNA序列表

1.3 方法

1.3.1 金電極的活化：金電極分別用1.0 μm和0.05 μm A12O3粉在鹿皮上打磨光亮后，用蒸餾水沖洗干凈，分別在蒸餾水、無水乙醇、蒸餾水中超聲洗滌10 min；然后將金電極浸泡在piranha（30%H2O2∶98%H2SO4=1∶3v/v）中10分鐘，取出在室溫下晾干待用。然后將一支活化金電極在5 mmol/L鐵氰化鉀緩沖溶液中循環(huán)伏安（CV）法掃描，掃速為0.1 V/s，掃描電壓為0.6～-0.2 V，持續(xù)掃描直到穩(wěn)定的CV圖（圖1中的b）。

1.3.2 基因傳感器的制備：將0.5 μmol/L探針液體取5 μL滴加到活化的金電極表面，冰箱0～4 ℃中過夜，通過Au-S自組裝成膜。然后金電極在5 mmol/L鐵氰化鉀緩沖溶液中循環(huán)伏安（CV）法掃描，掃速為0.1 V/s，掃描電壓為0.6～-0.2 V，持續(xù)掃描直到穩(wěn)定的CV圖（圖1中的a）。

圖1 活化金電極與組裝金電極的CV圖（a：組裝金電極；b：活化金電極）

1.3.3 探針濃度的選擇：以系列探針濃度（以SEMA3B為例，探針濃度依次：0.1、0.5、1.0 μmol/L）液體取5 μL滴加到活化后的金電極表面，冰箱0～4 ℃中過夜，通過Au-S自組裝成膜，然后組裝金電極在5 mmol/L鐵氰化鉀緩沖溶液中循環(huán)伏安（CV）法掃描，掃速為0.1 V/s，掃描電壓為0.6～-0.2 V，持續(xù)掃描直到穩(wěn)定的CV圖（圖2），以便選擇組裝探針液濃度那個濃度最恰當(dāng)。結(jié)合其他3個基因CV掃描峰電流情況，該課題選出固定探針濃度0.5 μmol/L。

1.3.4 靶基因濃度線性范圍：滴加5 μL探針液（濃度0.5 μmol/L）在活化金電極表面，0～4 ℃過夜成膜，取出用TE緩沖液小流量沖洗自然干，滴加5 μL不同濃度的靶基因在組裝金電極膜表面，37 ℃雜交2 h，取出用TE緩沖溶液沖洗自然干，然后在5 mmol/L鐵氰化鉀緩沖溶液中循環(huán)伏安（CV）法掃描，掃速為0.1 V/s，掃描電壓為0.6～-0.2 V，持續(xù)掃描直到穩(wěn)定的CV圖，其響應(yīng)電流隨靶基因濃度的增加而不斷減?。▓D3），且對不同濃度的靶基因作線性關(guān)系圖（圖4）。靶基因濃度：0、10、30、50、70、100、120、130（0.01 pmol/L）

圖2 不同探針濃度的CV圖（a：1.0 μmol/L b：0.5 μmol/L c：0.1μmol/L）

圖3 不同靶基因濃度的CV圖 圖4 不同濃度的靶基因線性關(guān)系圖

2 結(jié)果與討論

2.1 活化金電極與探針膜的cv表征：圖1b是活化裸金電極的cv圖表征，它的氧化峰和還原峰電流峰很典型，a表示探針膜的cv圖表征，它的氧化峰和還原峰電流有所下降，這是因為單核苷酸鏈通過Au-S自組裝到到金電極上，部分阻礙了電子的傳遞。同時表示探針成功組裝到金電極上。

2.2 基因傳感器自組裝不同探針濃度的cv表征（圖2）：從c到a氧化峰電流與還原峰電流均降低，是因為組裝的探針濃度從低到高，電子傳遞進(jìn)一步被阻礙，因此電流降低。同時表示組裝電極具有生物活性。

2.3 用自組裝基因傳感器分別測定靶基因濃度cv表征（圖3）：氧化峰電流與還原峰電流隨著靶基因濃度升高其峰電流降低，是因為雜交作用，隨著濃度的增加，電子傳遞進(jìn)一步被阻礙，因此電流降低。同時表示組裝電極具有生物活性，能與對應(yīng)的核苷酸單鏈發(fā)生雜交反應(yīng)。圖4的靶基因線性關(guān)系圖看出，其濃度在10～100（0.01 pmol/L）成線性。圖3與圖4表示該基因傳感器可以檢測3p缺失基因。

3 結(jié) 論

利用自主裝Au-S固定基因探針，成功構(gòu)建了靈敏的電流型肺癌基因傳感器。與傳統(tǒng)方法相比，該方法有以下三個突出優(yōu)點：①能早期篩查出肺癌發(fā)生的可能性；②自組裝固定提高靈敏度；③在本實驗中，以ssDNA固定作為基因模型，實驗了該方法對肺癌缺失基因的檢測，同時該方法可推廣到其他基因的測定，在臨床早診斷方面有著重要的應(yīng)用，為4P醫(yī)學(xué)的預(yù)防、預(yù)測、早診斷、個體化提供理論證據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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［2］ 梅新宇，孫余婕，徐美青，等.非小細(xì)胞肺癌3p染色體多區(qū)域雜合性缺失檢測的研究［J］.中國肺癌雜志，2008，11（4）：534-537.

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中圖分類號：R734.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）16-0036-02

基金項目：重慶市醫(yī)學(xué)科研計劃項目（編號：2012-2-297）

*通訊作者