劉立新，張羽男，張　磊，郭映雪，沈　宇，張?jiān)平?/p>

(黑龍江省教育廳生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，佳木斯大學(xué)藥學(xué)院， 黑龍江 佳木斯 154007)

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紫花苜蓿總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞炎性因子的抑制作用①

劉立新，張羽男，張磊，郭映雪，沈宇，張?jiān)平?/p>

(黑龍江省教育廳生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，佳木斯大學(xué)藥學(xué)院， 黑龍江 佳木斯 154007)

摘要:目的：研究紫花苜?？傸S酮對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及機(jī)理。方法：1 μg/mL LPS刺激細(xì)胞之前，分別用50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL紫花苜?？傸S酮預(yù)先處理細(xì)胞1.5h；采用MTT法測(cè)定細(xì)胞的活性；分別利用qRT-PCR法和Western boltting法檢測(cè)炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)和NF-κBp56蛋白表達(dá)。結(jié)果：紫花苜?？傸S酮可以抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位，降低TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)量，提高細(xì)胞的活力。結(jié)論：紫花苜蓿總黃酮可以通過(guò)下調(diào)NF-κB信號(hào)通路抑制炎性因子的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞：紫花苜?？傸S酮；LPS；乳腺上皮細(xì)胞；抑制作用

紫花苜蓿素有“牧草之王”的美譽(yù)，是廣泛應(yīng)用于奶牛飼料的一種產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性好的牧草，用紫花苜蓿飼喂奶?？梢蕴岣吲Ｄ痰漠a(chǎn)量和品質(zhì)[1]。黃酮為紫花苜蓿中主要的生物活性成分之一，其具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗菌、抗腫瘤、延緩衰老等作用[2]。本實(shí)驗(yàn)用LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺上皮細(xì)胞建立炎癥模型，從分子角度研究紫花苜蓿總黃酮的抗炎作用以及炎癥反應(yīng)信號(hào)通路調(diào)節(jié)方面的抗炎機(jī)理，為紫花苜蓿總黃酮深入研究和奶牛乳腺炎防治，提供了基礎(chǔ)參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1材料、試劑和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明小白鼠，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2藥物

LPS(Escherichia coli 0111:B4)(Sigma公司)；紫花苜?？傸S酮由佳木斯大學(xué)天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3試劑

優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS)(Sigma公司)，DMEM/F12干粉(Sigma公司)，Trizol (Invitrogen 公司)，MTT(sigma公司)，NF-κBp65抗體(Santa Cruz)，SYBR?Primx ExTaqTM(TaKaRa)，Prime ScriptTMRT reagent Kit(大連寶生物)。

1.1.4儀器

Sunrise-Basic酶標(biāo)分析儀(瑞士Tecan)，CKX41(光學(xué)顯微鏡日本 Olypus)，SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，7300 Real-Time PCR System(美國(guó)Applied Biosystems)，F(xiàn)orma3111 Series2 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Electron)。

1.2方法

1.2.1小鼠乳腺上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

小鼠乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法參照王楠楠等的方法[3]稍加改良，以下操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。具體步驟如下: (1)采集產(chǎn)仔5d后小鼠的乳腺實(shí)質(zhì)部分，用含有雙抗的D-Hank’s緩沖液反復(fù)清洗；(2)去除淋巴結(jié)和結(jié)締組織，在小燒杯中將乳腺組織剪成約1mm3的小塊，再用D-Hank's緩沖液反復(fù)清洗；(3)加入與組織比例為3:1左右的消化液37℃消化2～3h；(4)用200目銅網(wǎng)過(guò)濾，將過(guò)濾后的細(xì)胞液2000rpm離心15min，收集細(xì)胞；(5)加入細(xì)胞洗液洗8～10次，每次1000r/min離心1min，去除成纖維細(xì)胞；(6)加入含有10% FBS和雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞瓶中于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(7)培養(yǎng)2～3d后，吸棄上清液，加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組

將實(shí)驗(yàn)分成5組：空白對(duì)照組：正常培養(yǎng)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞；LPS組陽(yáng)性對(duì)照組：正常培養(yǎng)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞用含1μg/mL LPS的細(xì)胞培養(yǎng)液處理；紫花苜蓿總黃酮低劑量組：正常培養(yǎng)小鼠乳腺上皮細(xì)胞用含有50μg/mL的紫花苜?？傸S酮處理1.5h后，用含1μg/mL LPS的細(xì)胞培養(yǎng)液處理；紫花苜蓿總黃酮中劑量組：正常培養(yǎng)小鼠乳腺上皮細(xì)胞用含有100μg/mL的紫花苜?？傸S酮處理1.5h后，用含1μg/mL LPS的細(xì)胞培養(yǎng)液處理；紫花苜蓿總黃酮高劑量組：正常培養(yǎng)小鼠乳腺上皮細(xì)胞用含有200μg/mL的紫花苜?？傸S酮處理1.5h后，用含1μg/mL LPS的細(xì)胞培養(yǎng)液處理。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3細(xì)胞活性的檢測(cè)

將長(zhǎng)勢(shì)良好的小鼠乳腺上皮細(xì)胞以適宜的濃度接種于96孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞至生長(zhǎng)密度為80%～90%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，然后加入含紫花苜?？傸S酮終濃度為50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，作用1.5h后加入終濃度為1μg/mL的LPS進(jìn)行刺激，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組和LPS陽(yáng)性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入終濃度為0.5μg/mL 的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4～6h后，棄去上清液，每孔加入100μL DMSO，振蕩10min ，充分溶解結(jié)晶物，用酶標(biāo)儀于492nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，計(jì)算相對(duì)細(xì)胞存活率。

1.2.4細(xì)胞因子mRNA水平檢測(cè)

將生長(zhǎng)良好的小鼠乳腺上皮細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)90%左右時(shí)，按1.2.2方法對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組并給藥處理，LPS刺激培養(yǎng)12h后收集各組細(xì)胞，提取總RNA，具體方法參照：每孔加入1mL Trizol，充分裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至離心管中，靜置5min后每管分別加入200μL氯仿，振蕩后室溫靜置2～3min；12000r/min、4℃離心10min，吸取上層水相至新離心管中，加入500μL異丙醇，室溫靜置5min；12000r/min、4℃離心10min，留下沉淀；75%乙醇清洗沉淀；12000r/min、4℃離心5 min，棄上清得總RNA沉淀物，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其純度。將提取的細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-Actin為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR法檢測(cè)TNF-α，IL-6 mRNA的表達(dá)情況。TNF-α的引物序列：Sense：5' GGCGGTGCCTATGTCTCA 3'，Anti-sense： 5' GGCAGCCTTGTCCCTTGA 3'；IL-6的引物序列：Sense 5' TATGGAATAAGGCTGCTATGAA 3'，Anti-sense 5' TGGTAAGGATGTGGAGAA 3'；β-actin的引物序列：Sense 5' TATGAATAAGGCTGCTATGAA 3'，Anti-sense 5' TGGTAAGGATGTGGAGAA 3'。具體反應(yīng)條件為：95℃，10 s預(yù)變性。95℃，5s；60℃，31 s；共計(jì)循環(huán)40次。qRT-PCR所測(cè)得各基因的CT值同內(nèi)參基因β-actin的CT值相比較，計(jì)算該基因的相對(duì)表達(dá)量，所用計(jì)算公式為：相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT 。每個(gè)樣本至少設(shè)立3個(gè)平行樣。

1.2.5NF-κB p65蛋白水平檢測(cè)

將生長(zhǎng)良好的小鼠乳腺上皮細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)90%左右時(shí)，按1.2.2方法對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組并給藥處理，LPS刺激培養(yǎng)12h后收集各組細(xì)胞，提取核蛋白，具體方法參照[4]，采用Western boltting方法檢測(cè)各組核蛋白的NF-κB p65蛋白表達(dá)量的變化。將樣品在SDS-PAG中電泳(濃縮膠80V；分離膠120V)1.5h后，利用半干轉(zhuǎn)移電泳儀，將凝膠上的蛋白帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(NC)，5%脫脂乳封閉1.5h后，TBS洗滌3次，每次10～15min，于一抗工作液(稀釋比例1：1000)

中孵育過(guò)夜，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液(稀釋比例1：2000)孵育1.5h。TBS洗滌3次，超敏發(fā)光液顯光， Xz一片感光后，顯影定影，Tanon 1600R全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)掃描并分析蛋白表達(dá)量。β-actin 蛋白作為內(nèi)參蛋白，蛋白的灰度比值來(lái)表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1紫花苜?？傸S酮對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞活性的影響

采用MTT法檢測(cè)紫花苜?？傸S酮對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞活性的影響，見(jiàn)圖1，與空白對(duì)照組相比，單獨(dú)用LPS處理細(xì)胞后，細(xì)胞活性顯著下降(P<0.01)；與LPS對(duì)照組相比，用不同濃度紫花苜蓿總黃酮預(yù)處理的細(xì)胞均能顯著或極顯著地提高小鼠乳腺上皮細(xì)胞的活性(P<0.01，P<0.05)，并且劑量越大效果越明顯，結(jié)果表明，紫花苜?？傸S酮能增加LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞的活性。

注：與空白對(duì)照組相比較，*P<0.05，**P<0.01；與LPS處理組相比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖1紫花苜?？傸S酮對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞活性的影響

2.2紫花苜?？傸S酮對(duì)TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)的影響

采用qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)情況，見(jiàn)圖2，與空白對(duì)照組相比，在LPS作用下細(xì)胞TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；加入紫花苜?？傸S酮干預(yù)后再用LPS刺激后，TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)被有效地抑制了，并且加入100μg/mL和200μg/mL紫花苜?？傸S酮組與LPS陽(yáng)性對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，紫花苜?？傸S酮可以有效地抑制LPS誘導(dǎo)的炎性因子TNF-α和IL-6、的mRNA表達(dá)。

注：與空白對(duì)照組相比較，*P<0.05，**P<0.01；與LPS處理組相比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.3紫花苜蓿總黃酮對(duì)NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting法檢測(cè)每組細(xì)胞中NF-κB p65蛋白的表達(dá)情況，見(jiàn)圖3，與空白對(duì)照組相比，單獨(dú)用LPS刺激細(xì)胞，NF-κB核轉(zhuǎn)位程度增強(qiáng)，即細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的含量增加；用紫花苜?？傸S酮預(yù)先處理再用LPS刺激后，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的含量降低了，與LPS陽(yáng)性對(duì)照組相比，50μg/mL 紫花苜蓿總黃酮組顯著抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位(P<0.05)，100μg/mL和200μg/mL紫花苜?？傸S酮組極顯著抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位(P<0.01)。結(jié)果表明，紫花苜蓿總黃酮抑制了細(xì)胞中NF-κB的核轉(zhuǎn)位。

注：與空白對(duì)照組相比較，*P<0.05，**P<0.01；與LPS處理組相比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖3紫花苜?？傸S酮對(duì)NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

3討論

乳腺炎是哺乳動(dòng)物常見(jiàn)的一種乳腺疾病，嚴(yán)重威脅著母體和后代的健康。其中奶牛乳腺炎的發(fā)病率極高，全世約有30%左右的奶?；加懈鞣N類(lèi)型的乳腺炎[5]，從而導(dǎo)致奶產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)高額的經(jīng)濟(jì)損失[6]。引起乳腺炎發(fā)生的原因有多種，其中生物因素占主導(dǎo)地位，包括：球菌、桿菌、真菌、支原體、酵母菌等各種病原微生物。有報(bào)道稱，在患乳房炎的奶牛乳汁中有TNF-α、IL-1β和IL-6的增加，提示這些細(xì)胞因子在乳腺炎癥反應(yīng)過(guò)程中的起著重要作用[7]。NF-κB是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Rel家族成員之一，是多種信號(hào)傳導(dǎo)通路的聚集點(diǎn)，在調(diào)節(jié)炎癥和對(duì)外來(lái)刺激免疫應(yīng)答方面起著重要作用，NF-κB被激活后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因上的特定位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用從而導(dǎo)致大量具有致熱活性炎性因子的合成和釋放，主要有TNF-α、IL-1β、IL-6等[8, 9]。

本研究通過(guò)檢測(cè)紫花苜?？傸S酮對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)及TNF-α、IL-6的影響，從抗炎角度探討紫花苜?？傸S酮的作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS可以激活小鼠乳腺上皮細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)大量TNF-α和IL-6炎癥因子產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞活性降低。而再LPS刺激前，用紫花苜蓿總黃酮預(yù)先處理細(xì)胞可以抑制NF-κB進(jìn)入，抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)，從而增加細(xì)胞的活性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紫花苜?？傸S酮能抑制乳腺炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

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基金項(xiàng)目：①1.國(guó)家自然基金項(xiàng)目，編號(hào)：31101250；2.中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：2014M561382。

作者簡(jiǎn)介：劉立新(1978～)女，黑龍江佳木斯人，在讀博士，講師。

中圖分類(lèi)號(hào)：R322.6+6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2016)04-0001-03

(收稿日期：2016-03-09)

The inhibition effect of total flavonoids of alfalfa on inflammatory cytokines in LPS-induced mammary epithelial cell

LIULi-xin,ZHANGYu-nan,ZHANGLei,GUOYing-xue,SHENYu,ZHANGYun-jie

(The Key Laboratory of Biological Drug Affiliated to Heilongjiang Education Authority, College of Pharmacy in Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Abstract:Objective: To study the inhibition effects of total flavonoids of alfalfa on inflammatory cytokines and mechanism. Methods: Before the cells were stimulated with 1 μg/mL LPS, the cells were treated with 50μg/mL, 100μg/mL, 200μg/mL total flavonoids of alfalfa for 1.5 hours. The expression levels of TNF-α, IL-6 mRNA and NF-κBp56 protein were determined by qRT-PCR method and Western boltting method respectively. Result: Total flavonoids of alfalfa could inhibit NF-κB nuclear translocation; reduce the expression levels of TNF-a and IL-6 mRNA; and improve cells vitality. Conclusion: Total flavonoids of alfalfa can inhibit the production of inflammatory cytokines by reducing NF-κB signaling pathway.

Key words:total flavonoids of alfalfa; LPS; mammary epithelial cell; inhibition effect