徐志剛，呂淑慧，楊笑天，張　滌，王玉清

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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不同光量子數(shù)藍(lán)光對豚鼠視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的影響①

徐志剛，呂淑慧，楊笑天，張滌，王玉清

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：研究不同光量子數(shù)藍(lán)光長期間斷照射對豚鼠視網(wǎng)膜組織超微結(jié)構(gòu)的影響。方法：將42只普通級英國短毛三色健康雄性豚鼠隨即分成A、B、C、D、E、F組，給予不同強度的藍(lán)光照射，光量子數(shù)分別為3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、12.0μmol·m-2·s-1，20周后對各組豚鼠視網(wǎng)膜組織損傷情況進行電鏡檢測。結(jié)果：各組豚鼠視網(wǎng)膜組織均出現(xiàn)一定程度的超微結(jié)構(gòu)改變，光感受器細(xì)胞變性、凋亡速度加快，如萎縮、變薄、溶解、斷裂、凝固、空泡增多等，但并未發(fā)現(xiàn)某一組的損傷明顯重于其他組的情況，也未觀察到對藍(lán)光吸收最強的視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞損傷程度明顯高于其他層面的情況。結(jié)論：光量子數(shù)低于12μmol·m-2·s-1的藍(lán)光長期間斷照射對豚鼠的眼部發(fā)育是相對安全的，所造成的輕微損傷可能與幼齡豚鼠視網(wǎng)膜發(fā)育不健全有關(guān)。

關(guān)鍵詞：藍(lán)光；電鏡；視網(wǎng)膜；損傷

我國近視發(fā)病的最新資料，青少年近視發(fā)病率呈逐年上升趨勢，小學(xué)生近視發(fā)病率平均為50%,高三學(xué)生近視發(fā)病率平均為90%[1]。近年來，針對藍(lán)光照射可抑制“正視化”進程的研究已成為眼科領(lǐng)域的熱點，越來越多的實驗數(shù)據(jù)也證實藍(lán)光照射可減緩近視的發(fā)生及發(fā)展[2]。與此同時，藍(lán)光長時間照射對視網(wǎng)膜損傷作用也引起了人們的關(guān)注，藍(lán)光對視網(wǎng)膜組織敏感性最高、穿透力最強、損傷作用最明顯[2,3]。因此，在將藍(lán)光應(yīng)用于近視預(yù)防的過程中，如選擇對視網(wǎng)膜組織安全、有效的藍(lán)光照射光量子數(shù)具有重要的臨床意義。本實驗應(yīng)用不同光量子數(shù)的的藍(lán)光作為光源，對豚鼠進行間斷照射，而后對各組豚鼠的視網(wǎng)膜組織進行電鏡觀察，期待獲得對視網(wǎng)膜組織損傷最小的藍(lán)光照射光量子數(shù)或大致范圍，給進一步研究藍(lán)光對青少年近視發(fā)生發(fā)展的抑制作用提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組：普通級英國短毛三色健康豚鼠42只，體質(zhì)量90～110g，鼠齡2周，雄性(長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司)。選取屈光間質(zhì)透明度好，無明顯眼疾個體，采用隨機數(shù)字表法將豚鼠分為6組，分別為A、B、C、D、E、F組，應(yīng)用不同光量子數(shù)的藍(lán)色光進行照射。

1.1.2儀器：JEM-1200EX型透射電鏡(日本電子株式會社)；CM1950型超薄冰凍切片機(德國徠卡公司)；Lumera T型手術(shù)顯微鏡(德國卡爾·蔡司公司)；手術(shù)器械(蘇州六六醫(yī)療器械廠)；藍(lán)光LED燈管(蘇州久騰光電科技有限公司)，藍(lán)色LED燈光波峰值為430nm(半波寬為30)；CX-T02型可編程多功能電子定時器(常熟常新電子有限公司)。

1.2方法

1.2.1光照條件設(shè)定：光量子數(shù)是目前光照實驗國際通用的作用標(biāo)準(zhǔn)，選取人眼能夠接受的光量子數(shù)量來設(shè)計實驗環(huán)境，更利于后期開展臨床試驗。A、B、C、D、E、F組照射的光量子數(shù)分別為3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、12.0μmol·m-2·s-1(見圖1)。將定時器串聯(lián)在主線上，調(diào)整至12h/12h，每隔12小時自行開關(guān)，使每組接受的光照時間一致。

1.2.2光照20周后每組選取2只發(fā)育較好的豚鼠，經(jīng)水合氯醛麻醉后，迅速摘除眼球，在進口顯微鏡下，沿睫狀體平坦部剖開，緩慢去除玻璃體，仔細(xì)分離出視網(wǎng)膜組織，平鋪于濾紙上，均選取近黃斑區(qū)處，切取1. 5mm×3. 0mm長方形小塊，PBS漂洗后置于4%戊二醛中前固定4℃過夜，1%鋨酸后固定2h，乙醇-丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂618包埋劑定向包埋，半薄切片光學(xué)顯微鏡下定位，制成超薄切片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染法染色，JEM-1200EX 80KV透射電鏡觀察、攝片。

2結(jié)果

光照20周后，各組豚鼠視網(wǎng)膜組織均出現(xiàn)或多或少的超微結(jié)構(gòu)改變，光感受器細(xì)胞變性、凋亡速度加快，如萎縮、變薄、溶解、斷裂、凝固、空泡增多等。A組內(nèi)核層細(xì)胞漿水腫樣變性，核周圍間隙增寬，核內(nèi)染色質(zhì)凝聚，核仁明顯溶解，證實細(xì)胞發(fā)生了凋亡(見圖2)；B組內(nèi)網(wǎng)層細(xì)胞漿內(nèi)含有大量變性的細(xì)胞器，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞器外溢，超微結(jié)構(gòu)特征不易辨認(rèn)(見圖3)；C組外節(jié)膜盤排列清晰規(guī)則,分界明顯，局部水腫、膜盤增寬、間隙增大，失去正常的板層結(jié)構(gòu)，病變嚴(yán)重處膜盤溶解，相互融合，界限分辨不清(見圖4)；D組外核層細(xì)胞核明顯固縮，核內(nèi)染色質(zhì)凝聚，核膜消失(見圖5)；E組外節(jié)盤膜局部斷裂溶解，出現(xiàn)不規(guī)則缺損，即“蟲咬現(xiàn)象”(見圖6)；F組節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞空泡化損害，細(xì)胞膜局部凹陷、破裂，細(xì)胞核溶解，呈新月形邊集，細(xì)胞器明顯減少(見圖7)。

圖1各組光照場景。 圖2A組內(nèi)核層細(xì)胞核周圍間隙明顯增寬，細(xì)胞核溶解(×2000)。圖3B組內(nèi)網(wǎng)層細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的變性細(xì)胞(×2000)。圖4C組外節(jié)膜盤局部溶解，相互融合(×2000)。圖5D組內(nèi)核層細(xì)胞核固縮明顯，核膜消失(×2000)。圖6E組外節(jié)盤膜發(fā)生不規(guī)則缺損，即“蟲咬現(xiàn)象”(×2000)。圖7F組節(jié)細(xì)胞細(xì)胞膜局部凹陷、破裂，細(xì)胞核溶解，呈新月形邊集(×2000)。

3討論

本研究選取三色豚鼠作為研究對象，性格溫順，易于檢查，獲得數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。豚鼠為二色視動物，視網(wǎng)膜組織存在兩種視錐細(xì)胞，對藍(lán)光、綠光敏感，并含有黑色素，這些結(jié)構(gòu)與人類相似[4]。人類的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞含有3種視色素，分別對紅、綠、藍(lán)三種顏色光敏感[5]；黑色素主要分布在RPE細(xì)胞(黃斑區(qū)較多)、睫狀體、虹膜以及脈絡(luò)膜的色素細(xì)胞中。黑色素有穩(wěn)定自由基、防止高能量短波長光引起潛在光毒性、防止光化學(xué)損傷等作用。同時，選取430nm的藍(lán)光作為照射光源，與往常光損傷的實驗研究所采用廣譜藍(lán)光(400～500nm)相符[6]，具有較好的可比性。所以，實驗結(jié)果可為開展藍(lán)光抑制青少年近視發(fā)生發(fā)展的臨床試驗研究提供重要參考依據(jù)。

隨著對藍(lán)光認(rèn)識的逐漸加深，可以明確藍(lán)光在視網(wǎng)膜產(chǎn)生圖形和色覺的感知和分辨能力，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)激素分泌，治療新生兒黃疸，保持動物的晝夜節(jié)律，抑制“正視化”進程等方面都發(fā)揮著重要積極作用[7～9]。然而，伴隨藍(lán)光日益廣泛的應(yīng)用，對藍(lán)光的安全性研究顯得格外重要，光化學(xué)損傷是光輻射對視網(wǎng)膜細(xì)胞和RPE細(xì)胞的所造成的主要病變之一。雖然有多個動物實驗及體外細(xì)胞培養(yǎng)的實驗證明了暴露于高強度藍(lán)光后所引起的視網(wǎng)膜組織的光損傷[10～12]，損傷程度與以下多種因素有關(guān)，如光譜范圍、光量子數(shù)、光照持續(xù)時間、物種視網(wǎng)膜的組織結(jié)構(gòu)特點等，但長期、慢性、低強度的藍(lán)光輻照是否可對人眼的產(chǎn)生損傷及損傷程度尚未得到證明，本實驗結(jié)果可彌補這方面的不足。

本課題組已完成并報道的研究中：利用不同光量子數(shù)藍(lán)光間斷照射20周后，可明顯抑制豚鼠的“正視化”發(fā)展，觀察豚鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)改變(Tunel染色)，各組視網(wǎng)膜組織均出現(xiàn)了一定程度的細(xì)胞凋亡，光感受器細(xì)胞核凋亡數(shù)量略多。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核、雙極細(xì)胞層及光感受器細(xì)胞層均可見未染色、染色質(zhì)濃縮邊緣化、核膜裂解、凋亡小體等凋亡細(xì)胞。視網(wǎng)膜高倍鏡(×400)視野下凋亡細(xì)胞數(shù)量，平均約為(6.68±1.78)個，不同光量子數(shù)藍(lán)光照射下差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

本研究通過電鏡檢測對各組豚鼠視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)改變進行比較，可以了解藍(lán)光照射后豚鼠視網(wǎng)膜組織，尤其是黃斑區(qū)感光細(xì)胞的細(xì)微損傷，對視網(wǎng)膜HE染色檢測和Tunel細(xì)胞凋亡檢測是一個很好的補充。每組標(biāo)本通過多層面電鏡檢查，對視網(wǎng)膜內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)狀層、節(jié)細(xì)胞層、感光細(xì)胞外節(jié)膜盤等組織進行詳細(xì)觀察(圖2～7)，經(jīng)過仔細(xì)對比后發(fā)現(xiàn)，各組視網(wǎng)膜各層面均可發(fā)現(xiàn)輕微程度的病理損傷，可觀察到如細(xì)胞水腫、變性、萎縮、核周間隙增寬，外節(jié)膜盤局部溶解、融合(蟲咬現(xiàn)象)等，但并未發(fā)現(xiàn)某一組的損傷明顯重于其他組的情況，也未觀察到對藍(lán)光吸收最強的視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞損傷程度明顯高于其他層面的情況，這種損傷的存在可能與視網(wǎng)膜細(xì)胞“衰老”關(guān)系密切。由此可見，光量子數(shù)低于12μmol·m-2·s-1的藍(lán)光長期間斷照射并未給正常發(fā)育中的豚鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞(黃斑區(qū))造成過多的損傷，與前期研究結(jié)果相符。

這種損傷也可能與2W齡豚鼠視網(wǎng)膜發(fā)育不健全有關(guān), 其視網(wǎng)膜的防御機制尚未發(fā)育完全，角膜及晶狀體是抵御光視網(wǎng)膜病變的屏障作用尚未完善，視網(wǎng)膜自身抵御光毒性的防御機制尚未形成。所以，日常生活中，嬰幼兒也應(yīng)加強對于強度過高的可見光及短波長藍(lán)光的防護，在此期采取類似藍(lán)光照射的治療措施應(yīng)該慎重，并做好相應(yīng)的保護措施。同時家長應(yīng)該督促孩子避免長時間的近距離用眼，多進行遠(yuǎn)眺和參加室外活動[13]。

綜上所述，光量子數(shù)低于12μmol·m-2·s-1的藍(lán)光照射對幼年豚鼠的眼部發(fā)育是相對安全的，并未表現(xiàn)出光照強度越大損傷越重的一般性規(guī)律。依據(jù)本研究結(jié)果可提出一種假設(shè)，這種損傷的發(fā)生可能與幼齡豚鼠視網(wǎng)膜發(fā)育不健全有關(guān)，但具體情況尚需進一步的研究加以證實。

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基金項目：① 1.佳木斯大學(xué)重點課題，編號：Sz2013-007；2.黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目，編號：2013251。

作者簡介：徐志剛(1976～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。 通訊作者：王玉清(1966～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:468069508@qq.com。

中圖分類號：R774

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1008-0104(2016)04-0086-03

(收稿日期：2016-01-20)