常呂珍，楊云娟，2，張潤(rùn)美，李萬(wàn)軍，牟興玲，黃遵錫，2，唐湘華，2

（1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650500； 2.云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500）

黑曲霉F5菌株產(chǎn)高溫糖化酶的液體發(fā)酵優(yōu)化分析

常呂珍1，楊云娟1，2，張潤(rùn)美1，李萬(wàn)軍1，牟興玲1，黃遵錫1，2，唐湘華1，2

（1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650500； 2.云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500）

摘要：實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)黑曲霉F5菌株進(jìn)行了溫度、pH值、碳源、氮源、磷酸鹽的篩選及正交優(yōu)化，結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)條件為：30%馬鈴薯汁，2%蛋白胨，0.4%磷酸二氫銨，pH4.5，在30℃下發(fā)酵培養(yǎng)4 d糖化酶活力達(dá)到87.3 IU/mL；糖化酶的最適反應(yīng)溫度為65℃，pH5.0。

關(guān)鍵詞：黑曲霉； 糖化酶； 篩選； 優(yōu)化

糖化酶（Glucoamylase，EC 3.2.1.1）又名葡萄糖淀粉酶，是一種酸性糖苷水解酶，從淀粉或者淀粉類似物的非還原端按順序切開(kāi)α-1，4糖苷鍵，也能水解α-1，6糖苷鍵、α-1，3糖苷鍵，產(chǎn)生葡萄糖。一般淀粉水解程度達(dá)80%。目前，糖化酶被廣泛用于燃料乙醇、固態(tài)白酒、抗生素、有機(jī)酸、淀粉糖、飼料行業(yè)，是應(yīng)用和工業(yè)酶學(xué)領(lǐng)域使用最廣泛的酶制劑之一［1-4］。而黑曲霉則是生產(chǎn)糖化酶的重要菌株之一［5-6］。多年來(lái)，糖化酶的研究工作多集中在產(chǎn)酶能力的選育、基因分子水平的改造和發(fā)酵條件的優(yōu)化。梁新紅［7］、宋水山［8］、陳冠軍［9］等人對(duì)黑曲霉產(chǎn)糖化酶的研究中獲得不同變異菌株黑曲霉代謝分泌形成的糖化酶最適反應(yīng)溫度在40～60℃，但用于工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)多在40℃條件下進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)工作采用自行篩選的黑曲霉F5進(jìn)行產(chǎn)高溫糖化酶的研究，力圖在云南固態(tài)發(fā)酵小曲酒工藝中進(jìn)行糖化工藝的調(diào)整，采用高溫糖化酶加速原料的預(yù)處理，再接種根霉提高根霉的糖化效率，使酵母代謝途徑加速流向酒精發(fā)酵終端。

本研究針對(duì)產(chǎn)高溫糖化酶的黑曲霉F5菌株進(jìn)行了溫度、pH值、碳源、氮源、磷酸鹽［10-13］的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以期望尋找耐酸、耐高溫的糖化酶用于淀粉質(zhì)原料預(yù)處理，降低能耗，提高DE值，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝。

1　材料與方法

1.1材料及儀器

實(shí)驗(yàn)菌株：黑曲霉F5來(lái)自富士山火山口土樣，由云南師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室選育。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基［15］：MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、KCl 1 g、瓊脂20 g、pH值自然、水1000 mL。

查氏培養(yǎng)基［15］：NaNO32 g、KCl 1g、磷酸氫二鉀0.1 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、蔗糖30 g、瓊脂20 g、pH值自然、水1000 mL。

儀器設(shè)備：移液槍、磁力攪拌器、離心機(jī)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、高壓滅菌鍋、搖床、渦旋振蕩器、紫外分光光度計(jì)。

1.2黑曲霉F5種子平板制備

配制查氏培養(yǎng)基，121℃、0.1 MPa滅菌30 min，在超凈臺(tái)中倒平板，并將已純化好的F5菌株接種于該平板培養(yǎng)基中，放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，獲得黑曲霉F5的孢子平板。

1.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參考文獻(xiàn)按［14］進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作［14］。

1.4高溫糖化酶活力測(cè)定

取3支試管，分別編號(hào)為空白管、樣品管A、樣品管B，向3支管中分別加入pH5.0的1%可溶性淀粉底物1.8 mL，65℃保溫5 min；向樣品管A、B中加入一定稀釋梯度的待測(cè)酶液0.2 mL，65℃精確保溫15 min后加入3 mL DNS試劑終止反應(yīng)，混合均勻；另向空白管中補(bǔ)加待測(cè)酶液0.2 mL；將3支管放入沸水浴中煮沸5 min，流水冷卻，加入10 mL蒸餾水，渦旋振蕩器上混勻，540 nm下測(cè)定吸光度。

酶活定義：在pH5.0、65℃條件下，1 mL酶液每1 min水解1%的淀粉底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所需要的酶量為1個(gè)酶活單位，用U表示。

1.5最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值的篩選

向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入馬鈴薯汁20%、硫酸銨0.5%、磷酸氫二鉀0.1%，pH值自然，以121℃、0.1 MPa滅菌30 min，冷卻，接種培養(yǎng)3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活。

最適反應(yīng)溫度的測(cè)定：取過(guò)濾的發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)稀釋后分別在反應(yīng)溫度為20℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，按照1.4步驟進(jìn)行酶活測(cè)定。

最適反應(yīng)pH值的測(cè)定：取過(guò)濾的發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)稀釋后分別在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的1%淀粉底物中，按照1.4步驟進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.6碳源的選擇

1.6.1不同碳源的選擇

向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入馬鈴薯汁20%、小麥淀粉2%、可溶性淀粉2%、玉米淀粉2%、木薯淀粉2%、糊精2%6種選擇性碳源，在每種培養(yǎng)基中再補(bǔ)加硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，pH值自然，121℃、0.1 MPa滅菌30 min，冷卻，接種培養(yǎng)3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活。

1.6.2碳源不同濃度梯度的篩選

2組碳源培養(yǎng)基的配制：向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入馬鈴薯汁：10%、15%、20%、25%、30%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，pH值自然；小麥淀粉：0.5%、1%、2%、4%、6%；硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，pH值自然。將2組配制好的培養(yǎng)基在121℃、0.1 MPa條件下同時(shí)滅菌30 min，冷卻，接種培養(yǎng)3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活。

1.7氮源的選擇

1.7.1不同氮源的選擇

向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入蛋白胨0.5%、尿素0.5%、明膠0.5%、硝酸銨0.5%、硫酸銨0.5%、硝酸鈉0.5%；馬鈴薯汁25%，磷酸氫二鉀0.1%，pH值自然，121℃、0.1 MPa滅菌30 min，冷卻，接種培養(yǎng)3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活。

1.7.2氮源不同濃度梯度的篩選

向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入蛋白胨0.5%、1%、2%、4%、6%；馬鈴薯汁25%，磷酸氫二鉀0.1%，pH值自然，121℃、0.1 MPa滅菌30 min，冷卻，接種培養(yǎng)3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活。

1.8磷酸鹽的選擇

1.8.1不同磷酸鹽選擇

向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入磷酸氫二鉀0.1%、磷酸二氫鉀0.1%、磷酸氫二鈉0.1%、磷酸二氫銨0.1%、磷酸鈣0.1%；馬鈴薯汁25%，蛋白胨2%，pH值自然，121℃，0.1 MPa滅菌30 min，冷卻，接種培養(yǎng)3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活。

1.8.2磷酸鹽不同濃度梯度的篩選

向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入磷酸二氫銨0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、1.0%；馬鈴薯汁25%，蛋白胨2%，pH值自然，121℃、0.1 MPa滅菌30 min，冷卻，接種培養(yǎng)3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活。

1.9黑曲霉F5正交試驗(yàn)

以馬鈴薯汁、蛋白胨、磷酸二氫銨、pH值為4個(gè)因素，分別做3個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1　 因素水平表

取27個(gè)300 mL錐形瓶，按照正交表4個(gè)因素配制正交培養(yǎng)基，以121℃、0.1 MPa滅菌30 min，冷卻，接種培養(yǎng)3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活。

2　結(jié)果與討論

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（圖1）

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.002x+0.002，R2= 0.99992＞0.95，線性關(guān)系顯著，可用于后續(xù)研究工作。

2.2最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值的篩選（圖2、圖3）

圖2　最適溫度篩選結(jié)果圖

圖3　最適pH值篩選測(cè)定結(jié)果圖

由圖2、圖3可知，黑曲霉F5菌株最適溫度為65℃，低于50℃以下會(huì)導(dǎo)致酶活性不足，高于80℃則酶蛋白變性失活；最適pH值為5.0，pH值在4～6之間，酶活力能保持80%以上，比較適合與淀粉酶配合使用，用于糖化工藝。

2.3碳源的選擇

如圖4所示，馬鈴薯汁和小麥淀粉產(chǎn)生的酶活最高，可采用馬鈴薯汁和小麥淀粉作為主要的碳源；圖5表明，小麥淀粉在濃度大于2%后，隨著濃度的升高，酶活力逐漸降低，而隨著小麥淀粉濃度的升高，酶活力降低的原因可能是培養(yǎng)基濃度升高，黑曲霉生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，大量形成菌絲體，產(chǎn)酶代謝途徑受到抑制，產(chǎn)酶能力降低；而馬鈴薯汁在大于20%后，酶活力還有明顯的增加趨勢(shì)，其原因可能是因?yàn)轳R鈴薯汁中含有某些氨基酸或者維生素，促進(jìn)了黑曲霉的生長(zhǎng)，其代謝產(chǎn)物也有一定的提升，促使酶活力也呈上升趨勢(shì)。因此，在碳源的選擇上使用馬鈴薯汁作為最佳碳源是最適合的，且濃度為25%，產(chǎn)酶能力最高。

圖4　不同碳源酶活力測(cè)定結(jié)果圖

圖5　兩種碳源不同濃度梯度酶活力測(cè)定結(jié)果圖

2.4氮源的選擇（圖6）

圖6　不同氮源酶活力測(cè)定圖

由圖6所示，采用的6種氮源中蛋白胨為F5最佳氮源，這與趙林果等［16］在研究碳源和氮源對(duì)黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶的影響中蛋白胨為最佳氮源相一致。該菌株F5對(duì)尿素氮源不利用，生長(zhǎng)不佳，產(chǎn)生的糖化酶活力不高，這與張秋菊等［17］在探討固態(tài)發(fā)酵中不同碳源和氮源對(duì)黑曲霉解磷效果的影響，尿素的發(fā)酵液中有效磷含量有所減少相一致，而作為有機(jī)氮源，反而有助于F5菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。以蛋白胨為優(yōu)化氮源，蛋白胨濃度添加量為2%時(shí)酶活力較高，實(shí)驗(yàn)選擇濃度2%蛋白胨作為最佳氮源。隨著蛋白胨濃度的增加，大量的氮源用于菌絲體的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了生物量的繁殖時(shí)間，導(dǎo)致產(chǎn)酶階段延后甚至不利于產(chǎn)酶（見(jiàn)圖7）。

圖7　氮源不同濃度梯度酶活力測(cè)定圖

2.5磷酸鹽的選擇（圖8、圖9）

圖8　不同磷酸鹽酶活力測(cè)定圖

圖9　磷酸鹽不同濃度梯度酶活力測(cè)定圖

由圖8可以看出，5種磷酸鹽中，磷酸二氫銨酶活力最高，磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉酶活力相差不大，表明其對(duì)產(chǎn)酶影響不大，而磷酸鈣產(chǎn)生的酶活最低，其主要原因可能是磷酸鈣為沉淀物質(zhì)，不利于黑曲霉F5菌絲體的吸收利用，而磷酸二氫銨中可能存在著氮源，導(dǎo)致生長(zhǎng)過(guò)程中促進(jìn)產(chǎn)酶，因而酶活力最高。在以優(yōu)化磷酸二氫銨濃度中，當(dāng)磷酸二氫銨濃度為0.4%時(shí)，酶活力最高（見(jiàn)圖9）。

綜上所述，F(xiàn)5菌株最佳碳源為馬鈴薯汁，濃度為25%；最佳氮源為蛋白胨，濃度為2%；最佳磷酸鹽為磷酸二氫銨，濃度為0.4%。形成的粗酶的最適反應(yīng)溫度為65℃，最適反應(yīng)pH5.0。

2.6黑曲霉F5正交試驗(yàn)

由4因素3水平進(jìn)行了正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　L9（3）4正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2進(jìn)行直觀分析可知，根據(jù)R極值大小可看出，

RpH值＞R蛋白胨＞R磷酸二氫銨＞R馬鈴薯汁，說(shuō)明pH值對(duì)產(chǎn)酶能力影響最顯著；馬鈴薯汁影響效果最弱。從水平因子考慮，其最優(yōu)組合形成的最佳培養(yǎng)基配比為：馬鈴薯汁30%，蛋白胨2%，磷酸二氫銨0.4%，pH4.5。

2.7驗(yàn)證試驗(yàn)

取4個(gè)三角瓶分別編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)，配制4瓶培養(yǎng)基：馬鈴薯汁30%，蛋白胨2%，磷酸二氫銨0.4%，pH4.5，在121℃、0.1 MPa下滅菌30 min，冷卻，接種培養(yǎng)3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活（見(jiàn)表3）。

表3　 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)補(bǔ)充驗(yàn)證試驗(yàn)，看其生長(zhǎng)穩(wěn)定性及產(chǎn)酶穩(wěn)定性，酶活比正交試驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)高8.7%左右，3個(gè)樣品產(chǎn)生的酶活平均范圍為87.3 IU/mL±4.7 IU/mL。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)黑曲霉F5菌株進(jìn)行了溫度、pH值、碳源、氮源、磷酸鹽的篩選及正交試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果表明：發(fā)酵最佳碳源為30%馬鈴薯汁；最佳氮源為2%蛋白胨，最佳磷酸鹽為0.4%磷酸二氫銨，最適pH4.5，通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)酶以后最高酶活能達(dá)到87.3 IU/mL，發(fā)酵產(chǎn)生的糖化酶最適反應(yīng)溫度為65℃，最適pH5.0。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，最適反應(yīng)溫度為65℃的糖化酶可采用中溫蒸煮和低溫蒸煮同步進(jìn)行，用于液態(tài)白酒的生產(chǎn)。在白酒的生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)添加該糖化酶能降低能耗，縮短反應(yīng)時(shí)間，其酶穩(wěn)定性及其應(yīng)用將在后續(xù)工作中完成。

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優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-03-23；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160323.1550.010.html。

中圖分類號(hào)：TS261.1；Q93-3；TS262.3；TQ92

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）07-0032-05

DOI：10.13746/j.njkj.2016003

基金項(xiàng)目：2014年云南師范大學(xué)大學(xué)生科研訓(xùn)練基金項(xiàng)目。

收稿日期：2016-01-06

作者簡(jiǎn)介：常呂珍（1990-），女，云南鎮(zhèn)雄人，在讀本科，生物技術(shù)專業(yè)。

通訊作者：唐湘華（1973-），男，講師，從事應(yīng)用微生物發(fā)酵工程研究，E-mail：txhact@gmail.com。

Optimization of the Liquid Fermentation Conditions of Aspergillus Niger Strain F5 to Produce Thermotolerant Glucoamylase

CHANG Lvzhen1，YANG Yunjuan1，2，ZHANG Runmei1，LI Wanjun1，MOU Xingling1，HUANG Zunxi1，2and TANG Xianghua1，2
（1.School of Life Sciences，Yun'nan Normal University，Kunming，Yun'nan 650500；2.Yun'nan Provincial Key Lab for Biomass Energy and Environmental Biotechnology，Kunming，Yun'nan 650500，China）

Abstract:In this study，the factors influencing the thermotolerant glucoamylase yield of Aspergillus niger strain F5，including temperature，pH value，carbon source，nitrogen source and phosphate salt，were investigated.The optimum culture medium was composed of 30%potato juice，2%peptone，and 0.4%ammonium dihydrogen phosphate with pH 4.5.After 4 d culture at 30℃，the activity of the produced glucoamylase reached up to 87.3 IU/ml.The best reaction temperature of glucoamylase was 65℃and the best reaction pH was 5.0.

Key words:Aspergillus niger；glucoamylase；screening；optimization