梁麗文，繆禮鴻，楊團元，張明春，劉蒲臨，王　霜

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023； 2.湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北松滋434200）

濃醬兼香型白酒不同儲存期的高溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu)與發(fā)酵特征分析

梁麗文1，繆禮鴻1，楊團元2，張明春2，劉蒲臨1，王霜1

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023； 2.湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北松滋434200）

摘要：選取白云邊酒不同儲存期的高溫大曲為研究對象，從微生物數(shù)量、細菌種類、發(fā)酵力和糖化力等方面的變化規(guī)律進行分析。結(jié)果表明，在120 d的儲存期內(nèi)，隨著時間的延長高溫大曲細菌種類和數(shù)量以及霉菌的數(shù)量逐漸上升；大曲的發(fā)酵力整體呈緩慢上升的趨勢，而糖化力先增加后降低。Bacillus.methylotrophicus在大曲中分布最廣。大曲微生物數(shù)量與酒醅中乙醇、正丙醇和乙酸乙酯的含量呈一定正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：濃醬兼香型白酒高溫大曲； 儲存期； 微生物群落結(jié)構(gòu)； 發(fā)酵特征

白云邊酒高溫大曲是一種經(jīng)過自然接種、高溫發(fā)酵而制成的菌酶合一的糖化發(fā)酵劑［1］。酒曲中微生物的種類、數(shù)量、產(chǎn)酶特性在一定程度上決定著酒曲質(zhì)量及其活性指標［2］。李丹宇等［3］發(fā)現(xiàn)在制曲過程中，糖化力、液化力、蛋白分解力與真菌數(shù)量和種類呈正相關(guān)，說明真核微生物對大曲生化酶類的生成有重要作用；總酸含量、蛋白分解力與細菌多樣性呈顯著相關(guān)。高溫大曲發(fā)酵好后需經(jīng)3個月左右的儲存后才能使用。劉建文等［4］發(fā)現(xiàn)儲存3～4個月的大曲，其纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、酯化酶的活力均達到最好狀態(tài)。大曲儲存期越長，越容易導(dǎo)致曲蟲危害，增加損耗和庫存成本。因此，縮短大曲的儲存期具有重要經(jīng)濟價值。

濃醬兼香型白云邊酒大曲生產(chǎn)采用醬香型白酒高溫制曲工藝［5］。本研究對不同儲存期白云邊酒高溫大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)與發(fā)酵特征進行了分析，旨在解析高溫大曲在儲存過程中的變化規(guī)律及微生物與發(fā)酵特性之間的關(guān)系，為合理設(shè)定大曲儲存時間及進一步研究如何縮短大曲儲存期提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

樣品：不同儲存期的高溫單塊大曲，混合大曲曲粉以及高粱，均由湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司提供。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1000 mL，pH7.2～7.4，121℃滅菌30 min。

馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基［6］。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母抽提物5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水1000 mL，pH7.2～7.4，121℃滅菌30 min。

主要試劑：細菌菌株DNA提取所需酶、Marker、dNTPs、Buffer等購于生工生物上海股份有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗方法

1.2.1樣品的處理方法

取不同儲存期的高溫單塊大曲粉碎，混合均勻并過20目篩后備用。

1.2.2菌株分離及計數(shù)方法

稱取大曲曲粉樣品10.0 g，加入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，170 r/min搖床15 min，采用稀釋涂布平板法［6］依次涂布于馬丁孟加拉紅平板，牛肉膏蛋白胨平板。馬丁孟加拉紅平板置于生化培養(yǎng)箱中以30℃培養(yǎng)2 d，觀察，計數(shù)。牛肉膏蛋白胨平板置于生化培養(yǎng)箱中以37℃培養(yǎng)2 d，觀察，計數(shù)，然后從平板上挑取數(shù)量上占優(yōu)勢且形態(tài)有差異的細菌菌落，經(jīng)劃線分離純化、鏡檢，編號后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3理化指標及測定方法

水分的測定：稱取待測大曲曲粉樣品3.0 g，用快速水分測定儀測定；發(fā)酵力的測定［7］：采用CO2失重法；糖化力的測定［7］：斐林試劑法。

1.2.4實驗室模擬大曲白酒固態(tài)發(fā)酵方法

（1）燜高粱1.5 h。水溫大于90℃，每澆淋1次后燜高粱30 min，共3次，燜高粱時蓋緊鍋蓋。

（2）蒸高粱90～120 min。含水量控制在55%，然后冷卻至25℃左右。

（3）將大曲以10%（質(zhì)量比）的比例添加到攤涼的高粱中，混合均勻。

（4）將混合均勻的原料堆積后置于大塑料袋中，每個塑料袋約600 g，再置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，提高溫度至42℃培養(yǎng)12 h，再升溫至50℃培養(yǎng)12 h。分裝于菌種瓶中，裝滿后用8層保鮮袋封口，并做好標記。

（5）置于28℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵，每隔7 d后取1瓶，即為酒醅。取部分酒醅蒸餾并進行氣相色譜分析。

蒸餾方法：取50.0 g酒醅，加入150 mL的蒸餾水，蒸出100 mL的蒸餾液，過濾后采用氣相色譜測定乙醇、正丙醇及乙酸乙酯的含量。

1.2.5乙醇、正丙醇及乙酸乙酯的測定方法

采用氣相色譜測定法：氣相色譜安捷倫5890A。載氣流速25 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速400 mL/min，分流比20∶1。起始柱溫為60℃，保持5 min，然后以10℃/min程序升溫至160℃，保持5 min。

1.2.6細菌DNA的提取

將分離到的細菌菌株在牛肉膏蛋白胨平板上多次活化，并劃線純化后接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、170 r/min下?lián)u床培養(yǎng)14 h，用細菌基因組試劑盒提取基因組DNA，檢測后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7提取的細菌DNA的PCR擴增、分子測序和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

細菌DNA采取試劑盒抽提后，PCR擴增16S rDNA，細菌的16S rDNA引物為27F和1492R。反應(yīng)體系采用50 μL的反應(yīng)體系。PCR循環(huán)程序為：94℃預(yù)變性5 min，94℃50 s，54℃50 s，72℃90 s，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。擴增的細菌PCR產(chǎn)物送金唯智生物科技有限公司測序，測序長度在1400 bp左右，測序結(jié)果采用BioaEdit軟件序列圖譜人工校對拼接，拼接后的序列在NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索比對。根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，選取測試菌株關(guān)系較近的模式菌株的16S rDNA序列區(qū)序列，用MEGA軟件采取鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1　不同儲存期的高溫單塊大曲理化指標及微生物數(shù)量分析結(jié)果

2　結(jié)果和分析

2.1不同儲存期的高溫單塊大曲理化指標及微生物數(shù)量分析結(jié)果

不同儲存期的濃醬兼香型白云邊酒高溫單塊大曲理化指標及微生物數(shù)量分析結(jié)果見表1。

由表1可知，儲存時間對大曲的含水率影響不大，其都在10%上下波動。大曲糖化力先升后降，在儲存120 d時達到最大值，與此同時霉菌數(shù)量也在120 d內(nèi)逐步上升達到最高后下降，表明在120 d儲存期內(nèi)大曲的糖化力與霉菌的數(shù)量之間具有明顯的正相關(guān)性。大曲的發(fā)酵力在整個儲存期內(nèi)有所波動，但幅度不大，總體上呈緩慢上升趨勢，這與細菌和霉菌數(shù)量的變化不一致，表明高溫大曲的發(fā)酵力與細菌和霉菌數(shù)量之間沒有明顯的相關(guān)性。

由于同一儲存期的每塊大曲間存在一定波動性，因此選取了2個時間段的大曲粉碎車間的混合大曲曲粉進行進一步分析。不同儲存期的濃醬兼香型白云邊酒高溫混合大曲曲粉理化指標及微生物數(shù)量分析結(jié)果見表2。

表2　不同儲存期的高溫混合大曲曲粉理化指標及微生物數(shù)量分析結(jié)果

表2的數(shù)據(jù)顯示，細菌數(shù)和霉菌數(shù)量較高的120 d曲粉，發(fā)酵力和糖化力也高于30 d的曲粉，這與單個曲塊的測定的結(jié)果一致，表明單塊取樣雖然存在差異性，但仍可在一定程度上反映其大體變化趨勢?？傮w來說，儲存120 d的大曲發(fā)酵力和糖化力最強，適合生產(chǎn)白酒。

2.2不同儲存時間高溫單塊大曲的細菌種類分離鑒定

經(jīng)稀釋涂布平板法和劃線分離純化法，從不同儲存期的大曲曲塊中共分離得到10株優(yōu)勢細菌。其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1。這10株細菌分別與GenBank中1個屬的7種模式菌株的序列相似度均≥99%，分別為Bacillus licheniformis、Bacillus sp.、Bacillus cereus、Bacillus subtilis、Bacillus tequilensis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus methylotrophicus。不同儲存期大曲中細菌的種類見表3。

圖1　10株細菌基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

表3　不同儲存期的高溫單塊大曲中細菌的種類

表3的數(shù)據(jù)顯示，不同儲存期曲塊的細菌種類差異比較大。細菌的種類由儲存期0 d大曲的1種增加到120 d的5種又降至180 d的1種。從整體趨勢上看，隨著時間的延長，細菌種類先逐漸增加，之后趨于單一。分離得到的細菌均為芽孢桿菌屬，其中，B.methylotrophicus為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，存在于每種不同儲存期的大曲樣品中，是絕對的優(yōu)勢菌株。

2.3不同儲存期大曲的實驗室模擬固態(tài)白酒堆積發(fā)酵結(jié)果

2.3.1儲存60 d和195 d的單塊大曲實驗室模擬固態(tài)白酒發(fā)酵結(jié)果

儲存60 d和195 d的大曲實驗室模擬固態(tài)白酒發(fā)酵酒醅中酒精度和正丙醇含量結(jié)果比較見圖2—圖4。

圖2　添加60 d大曲和195 d大曲酒醅中酒精度的變化比較

圖3　添加60 d大曲和195 d大曲酒醅中正丙醇含量的變化比較

圖4　添加60 d大曲和195 d大曲酒醅中乙酸乙酯含量的變化比較

由圖2數(shù)據(jù)看出，在裝瓶發(fā)酵23 d后，添加195 d大曲的酒醅中酒精含量高于添加60 d大曲的酒醅。這一結(jié)果與2.1中對大曲的發(fā)酵力測定結(jié)果相一致。由圖3和圖4數(shù)據(jù)可知，在裝瓶發(fā)酵的不同時間段，添加195 d大曲的酒醅中正丙醇和乙酸乙酯的含量高于添加60 d大曲的酒醅。

2.3.2儲存30 d和120 d的混合大曲曲粉實驗室模擬固態(tài)白酒發(fā)酵結(jié)果

儲存30 d的混合大曲曲粉和120 d的混合大曲曲粉實驗室模擬固態(tài)白酒發(fā)酵酒醅中微生物數(shù)量比較見表4。

表4　不同儲存期的混合大曲曲粉實驗室模擬固態(tài)白酒酒醅中微生物數(shù)量比較

由表4數(shù)據(jù)可知，在堆積結(jié)束后，酒醅中已檢測到較多酵母菌，所添加的曲粉中卻未檢測到酵母菌，證實了白酒釀造過程中酵母菌來源于空氣、原料和工廠車間這一結(jié)論。堆積結(jié)束后添加120 d曲粉酒醅中，酵母菌數(shù)量略低于30 d的曲粉，細菌數(shù)較高。到發(fā)酵30 d后，120 d曲粉酒醅中酵母菌數(shù)和細菌數(shù)均高于30 d的曲粉。

儲存30 d和120 d的混合大曲曲粉實驗室模擬固態(tài)白酒發(fā)酵酒醅中酒精度、正丙醇含量和乙酸乙酯含量結(jié)果比較見圖5—圖7。

圖5　添加30 d曲粉和120 d曲粉酒醅中酒精度的變化比較

圖6　添加30 d曲粉和120 d曲粉酒醅中正丙醇含量的變化比較

上述結(jié)果表明，儲存120 d曲粉的發(fā)酵酒醅中乙醇、正丙醇和乙酸乙酯濃度均高于儲存30 d曲粉發(fā)酵的酒醅，而發(fā)酵結(jié)束后120 d曲粉的發(fā)酵酒醅中微生物數(shù)量也高于30 d曲粉發(fā)酵的酒醅，表明酒醅中酵母菌數(shù)量是出酒率和酒質(zhì)的直接體現(xiàn)，這與劉俊超等［8］的結(jié)果相一致。

圖7　添加30 d曲粉和120 d曲粉酒醅中乙酸乙酯含量的變化比較

3　討論

本研究表明，在一定的有效儲存期內(nèi)，高溫大曲細菌種類和數(shù)量及霉菌的數(shù)量不降反增，這一結(jié)果與張秀紅等［9］報道的結(jié)果相似，而與大曲儲存是減少產(chǎn)酸菌的數(shù)量的認知相反［7］。大曲的發(fā)酵力整體呈緩慢上升的趨勢，與傳統(tǒng)觀念“大曲存儲時間越長，發(fā)酵力越弱”不一致，推測可能與大曲中還存在其他未培養(yǎng)的微生物與發(fā)酵力有關(guān)。本研究從白云邊不同儲存期的各高溫大曲樣品中均能分離到B.methylotrophicus。游玲等［10］發(fā)現(xiàn)，B. methylotrophicus在釀造車間分布很廣，其耐受乙醇及乙酸能力較好，并有報道［11］表明其可分解甲醇，可能有助于降低糟醅中的甲醇含量。該菌種在傳統(tǒng)大曲酒釀造過程中的功能有待進一步研究。

本實驗結(jié)果說明白云邊高溫大曲儲存120 d的大曲在出酒率及產(chǎn)酯率方面均優(yōu)于儲存30 d的大曲，這與傳統(tǒng)大曲酒廠普遍采用儲存120 d左右的成曲進行大曲酒發(fā)酵的實踐相一致。在120 d儲存期內(nèi)，隨儲存期的延長，霉菌的數(shù)量、糖化力均明顯增加，從而提高了出酒率。這一結(jié)果與之前研究得出的白云邊混合大曲的霉菌和酵母菌數(shù)量與其酒化力成正相關(guān)的結(jié)論相一致［12］。

從白云邊高溫大曲儲存期的微生物數(shù)量及種類的結(jié)果分析來看，高溫大曲發(fā)酵存在一個明顯的后發(fā)酵期，即高溫發(fā)酵期過后，隨著大曲品溫的下降，中溫型的霉菌和細菌開始緩慢生長，導(dǎo)致糖化率明顯增加。這種微生物種類及數(shù)量的增加可能是由于大曲自身的微生物進行恢復(fù)性生長，也可能是外來的曲房環(huán)境中的微生物在大曲表面生長引起的，其機理有待深入研究。

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優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-05-12；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160512.1533.005.html【DOI】10.13746/j.njkj.2016。

中圖分類號：TQ925.7；TS261.1；TS262.3；Q93-3

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）07-0037-05

DOI：10.13746/j.njkj.2016084

基金項目：湖北省重大科技創(chuàng)新計劃項目資助（2013ABA008）。

收稿日期：2016-03-10

作者簡介：梁麗文（1991-），女，湖北仙桃市人，碩士研究生，E-mail：110liangliwen@sina.com。

通訊作者：繆禮鴻，教授。

Microbial Community Structure and Fermentation Characteristics of High-Temperature Daqu for Nongxiang-Jiangxiang Baijiu in Different Storage Periods

LIANG Liwen1，MIAO Lihong1，YANG Tuanyuan2，ZHANG Mingchun2，LIU Pulin1and WANG Shuang1
（1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan，Hubei 430023；2.Hubei Baiyunbian Distillery Co.Ltd.，Songzi，Hubei 434200，China）

Abstract:In this study，high-temperature Daqu of Baiyunbian liquor in different storage periods was used as the research object.The change rules of microbes quantity，bacteria varieties，fermenting power and saccharifying power were summed up.The results suggested that，within 120 d storage period，bacterial varieties and quantity and mold quantity in high-temperature Daqu increased gradually with the storage time，the fermenting power of Daqu increased slowly，and the saccharifying power of Daqu increased at the beginning and then dropped.Bacillus methylotrophicus had the widest distribution in Daqu.And the quantity of microbes in Daqu was positively correlated with the content of ethanol，normal propyl alcohol and ethyl acetate in fermented grains.

Key words:high-temperature Daqu for Nongxiang-Jiangxiang Baijiu；storage time；microbial community structure；fermentation characteristics