向雙全，周志剛，張志剛，黃應(yīng)予，劉麗娟，王　蕾，侯花寧，周瑩瑩（1.甘肅省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心甘肅徽縣74308； .金徽酒股份有限公司技術(shù)中心甘肅徽縣74308）

大曲蛋白酶對固態(tài)釀酒發(fā)酵的影響

向雙全1，2，周志剛1，2，張志剛1，2，黃應(yīng)予1，2，劉麗娟2，王蕾2，侯花寧2，周瑩瑩2
（1.甘肅省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心甘肅徽縣742308； 2.金徽酒股份有限公司技術(shù)中心甘肅徽縣742308）

摘要：在傳統(tǒng)濃香型固態(tài)釀酒工藝的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對影響釀酒出酒率的關(guān)鍵響應(yīng)因子進(jìn)行了研究和探討。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立了出酒率與糟醅酸度、水分、大曲蛋白酶活力組成的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，并通過分析模型方程和3D響應(yīng)圖得到本實(shí)驗(yàn)方案固態(tài)釀酒出酒率最佳條件，即糟醅酸度A為1.87度，糟醅水分B為52.77%，大曲蛋白酶活力C為14.37 U。在此最佳條件下出酒率最高達(dá)到48.1%。

關(guān)鍵詞：酸度； 水分； 大曲蛋白酶； 出酒率； 白酒

大曲蛋白酶是一種復(fù)合型蛋白酶，具有在酸性、中性、堿性條件下保持酶活力的特點(diǎn)，它是制曲過程多種微生物的代謝產(chǎn)物。在固態(tài)釀酒發(fā)酵過程中大曲蛋白酶具有促進(jìn)原料溶解，分解蛋白質(zhì)，生成氨基酸，提供氮源促進(jìn)微生物繁殖生長，降解酵母菌體，提高原料利用率，提供生香前驅(qū)物質(zhì)和風(fēng)味組分，協(xié)同其他微生物共酵，抑制大量雜醇油的生成，提高原酒產(chǎn)量和質(zhì)量等重要作用［1-10］。

在傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造過程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)原料利用率越來越低，發(fā)酵升溫幅度逐漸下降，發(fā)酵程度越來越不完全，致使發(fā)酵結(jié)束后糟醅酸度、殘?zhí)恰埖碓絹碓礁?，出酒率和質(zhì)量下降的惡性循環(huán)狀態(tài)。究其主要原因，一方面是蛋白質(zhì)對淀粉的包裹作用，阻礙大曲液化酶、糖化酶對淀粉的充分水解；另一方面是由于蛋白質(zhì)未被水解，發(fā)酵需要的氮源嚴(yán)重缺乏，影響釀酒微生物的繁殖代謝，特別是酵母菌的對氮源的需求［11］。大曲中蛋白酶活力適宜的情況下，包裹淀粉的蛋白質(zhì)層結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，使淀粉被糖化；另一方面，蛋白質(zhì)水解，增加了氮源，有利于釀酒微生物，特別是酵母菌的代謝繁殖，使糟醅的不利狀況會(huì)逐漸改善，達(dá)到正常生產(chǎn)水平。本研究通過Design Expert8.05b（Box-Behnken）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面［12-14］優(yōu)化了大曲蛋白酶在固態(tài)釀酒中的最佳酸度和水分配合發(fā)酵條件，充分發(fā)揮其在固態(tài)釀酒發(fā)酵過程中的作用，旨在使固態(tài)糟醅發(fā)酵過程中各種微生物能協(xié)調(diào)平衡代謝，提高固態(tài)白酒的產(chǎn)質(zhì)量。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

中溫大曲；酸性蛋白酶，10萬U/g；高粱；大米；糯米；玉米；小麥；稻殼。將5種糧食粉碎，糧粉過20目篩的小于20%，配比按高粱∶大米∶糯米∶小麥∶玉米比例為38% ∶22%∶20%∶12%∶8%進(jìn)行混合。大曲粉碎后曲粉過20目篩的小于36%。

試劑：蒸餾水、福林試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、酪蛋白、L-酪氨酸、氫氧化鈉、鹽酸、乳酸、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純，國藥試劑公司）。

儀器設(shè)備：T6紫外-可見分光光度計(jì)，普析通用公司；電子天平，梅特勒-托利多；生化培養(yǎng)箱；恒溫水浴鍋；粉碎機(jī)；5 L自制蒸酒設(shè)備一套。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大曲蛋白酶活力的測定［15］以及大曲蛋白酶活力的調(diào)整

由于傳統(tǒng)固態(tài)釀酒過程中，糟醅發(fā)酵始終在酸性條件下進(jìn)行，所以本實(shí)驗(yàn)在酶活力測定時(shí)選擇pH值為3.0，采用福林酚法。參照中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶活力測定法（SB/T 10317—1999）。大曲蛋白酶活定義為1 g干重大曲在40℃、pH值為3.0條件下1 min水解干酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的蛋白酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。在測得大曲蛋白酶活力的基礎(chǔ)上，根據(jù)需要調(diào)整到的大曲蛋白酶活力，計(jì)算需要添加的蛋白酶重量，最終得到需要的大曲含蛋白酶活力的曲藥。

1.2.2糟醅水分調(diào)整方法

根據(jù)蒸好的糧糟總重量以及需要調(diào)整到的水分含量，計(jì)算出該加多少數(shù)量的開水。

1.2.3糟醅酸度的測定以及酸度調(diào)整方法

糟醅酸度的定義：10 g糟醅消耗0.10 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫摩爾數(shù)，即，消耗1 mmol氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液為1度。糟醅酸度的調(diào)整是根據(jù)入窖糟醅的總重量以及需要調(diào)整到位的糟醅酸度，計(jì)算出需要加入到開水中的乳酸質(zhì)量，最后加入到蒸好的糧糟中。

1.2.4出酒率的測定

糟醅發(fā)酵10 d后，取出拌糠蒸餾，用500 mL的量筒接酒，同時(shí)在量筒中放入溫度計(jì)和酒精計(jì)，當(dāng)量筒中的酒精度降到60%vol時(shí)，停止接酒，記錄出酒數(shù)量，按60%vol折算計(jì)算出酒率。

1.2.5釀酒固態(tài)發(fā)酵步驟及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)步驟：取1 kg混合糧粉，加入600 mL溫水潤糧30 min，加入250 g熟稻殼，混勻，在蒸酒設(shè)備上大汽蒸煮70 min后出甄，出甄后加入80℃熱水。通過調(diào)整加入熱水的量來控制發(fā)酵糟醅水分；同時(shí)通過在熱水中加入不同量的乳酸來控制發(fā)酵糟醅的酸度。加入熱水燜潤15 min后，攤開糟醅冷卻，當(dāng)溫度降到20℃時(shí)加入大曲粉250 g，通過往大曲粉里添加酸性蛋白酶控制發(fā)酵大曲的蛋白酶活力。最后收堆密封，放入27℃培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵10 d，再取出發(fā)酵后糟醅，測定糟醅酸度、水分、殘?zhí)?、殘淀，并蒸餾取酒，計(jì)算出酒率。

根據(jù)濃香型白酒釀造工藝，確定了五糧比例，糟醅淀粉含量24%左右，25%的用曲比例和25%稻殼比例以及在培養(yǎng)箱中27℃恒溫發(fā)酵10 d蒸酒，根據(jù)濃香型白酒釀造工藝中糟醅入窖酸度和水分控制范圍［16］的基礎(chǔ)上，采用Design Expert8.05b軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，選取發(fā)酵糟醅的初始水分、酸度、蛋白酶活力為3個(gè)評(píng)價(jià)因素，出酒率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1　實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼

2　結(jié)果與分析

2.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和顯著性分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)利用Design Expert8.05b（Box-Behnken）軟件處理，用F（Fischer）檢驗(yàn)評(píng)價(jià)數(shù)學(xué)模型方程的顯著性，方程的擬合性由確定系數(shù)R2確定，以確立固態(tài)發(fā)酵過程中糟醅酸度、水分以及大曲蛋白酶活力的最佳配比，結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

利用Design Expert8.05b軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：Y=46.06-3.93A+ 1.84B-0.59C-0.30AB+0.35AC-0.17BC-8.87A2-3.29B2-4.34C2，用該回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著，R2= 0.9384，說明了93.84%的響應(yīng)值變化是由該模型決定的，R值為0.9732說明實(shí)驗(yàn)中出酒率與模型預(yù)測值有97.32%的一致性，由此表明該模型對實(shí)驗(yàn)結(jié)果能進(jìn)行較準(zhǔn)確的預(yù)測。模型的顯著水平P＜0.01，此時(shí)二次回歸方程是極顯著的，方程對實(shí)驗(yàn)擬合較好，因此可用此模型對響應(yīng)面進(jìn)行分析和預(yù)測。通過比較方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對值大小，可以判斷在本實(shí)驗(yàn)工藝參數(shù)中，酸度和水分達(dá)到極顯著水平，交互項(xiàng)不顯著，二次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平。由表3可知，A的P值為0.001，B的P值為0.0002，C的P值為0.0141，說明各自變量在設(shè)定的取值范圍內(nèi)單因素對出酒率的影響順序?yàn)锳＞B＞C。失擬項(xiàng)P=0.1379＞0.05，未達(dá)到顯著水平，表明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，該模型能準(zhǔn)確描述各變量因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

表3　回歸模型與方差分析

圖1　酸度和水分對出酒率影響的響應(yīng)面圖

圖2　酸度和大曲蛋白酶活力對出酒率影響的響應(yīng)面圖

圖3　水分和大曲蛋白酶活力對出酒率影響的響應(yīng)面圖

2.2響應(yīng)面的分析與優(yōu)化

通過模型方程得出的響應(yīng)面圖、等高線圖結(jié)果見圖1、圖2、圖3。由圖1—圖3可知，糟醅酸度、大曲蛋白酶活力兩因素間的交互作用大于AB以及BC之間的交互作用；其結(jié)果與擬合方程中交互項(xiàng)系數(shù)的絕對值大小關(guān)系一致。根據(jù)等高線的形狀可以判斷交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素間交互作用顯著，圓形則表示兩因素間交互作用不顯著，由圖1—圖3可以看出，等高線均呈橢圓形，說明各兩因素間的交互作用較強(qiáng)。由此可以說明在固態(tài)釀酒過程影響出酒率的因素中，大曲蛋白酶活力的影響不可忽視，在固態(tài)釀酒工藝參數(shù)范圍內(nèi)大曲蛋白酶活力僅次于糟醅酸度對出酒率的影響，且大于糟醅水分對出酒率的影響，由此實(shí)驗(yàn)可以說明大曲蛋白酶活力在固態(tài)釀酒過程中的重要作用及地位。

2.3模型驗(yàn)證

對擬合的二次多項(xiàng)式回歸方程分別求A、B、C的偏導(dǎo)數(shù)，可得各個(gè)因素的極值點(diǎn)：

A=1.87，B=52.77，C=14.37。

同時(shí)Design Expert8.05b軟件推薦的出酒率最大的最佳組合因素條件為：

A=2.0，B=52.0，C=15.0。

可以看出，兩種模式推出的工藝參數(shù)最佳組合相近，再次驗(yàn)證了該模型的可靠性。即以各因素極值為準(zhǔn)，糟醅固態(tài)發(fā)酵出酒率最高的考察因素組合為：入窖酸度A 為1.87度，入窖水分B為52.77%，大曲蛋白酶活力C為14.37 U。以上述得到的最佳因素值進(jìn)行修正再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即入窖酸度1.90度，入窖水分53.0%，大曲蛋白酶活力14 U進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4可知，出酒率的預(yù)測值為48.8%，實(shí)驗(yàn)平均值為47.27%，相對誤差為3.24%，在模型允許的誤差范圍內(nèi)，說明模型能很好地預(yù)測實(shí)際出酒率情況，該響應(yīng)面分析方法可靠。

表4　最優(yōu)條件下出酒率的預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值的比較

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)固態(tài)釀酒工藝控制要點(diǎn)的基礎(chǔ)上，固定其他工藝要素，選擇糟醅酸度、水分、大曲的蛋白酶活力3個(gè)因素，應(yīng)用響應(yīng)面法對3因素進(jìn)行優(yōu)化，借助Design Expert8.05b軟件，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立了固態(tài)釀酒出酒率與糟醅酸度、水分、大曲蛋白酶活力組成的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，并通過分析模型方程和3D響應(yīng)圖得到本實(shí)驗(yàn)方案固態(tài)釀酒出酒率最佳條件，即糟醅酸度A為1.87度，糟醅水分B為52.77%，大曲蛋白酶活力C為14.37 U。通過對模型方差分析和響應(yīng)面3D圖分析，可以看出在固態(tài)釀酒過程中糟醅酸度與大曲蛋白酶活力的交互作用強(qiáng)于糟醅酸度與糟醅水分的交互作用，根據(jù)作者多年的釀造經(jīng)驗(yàn)，曲香正的大曲，大曲蛋白酶活力較大，氨基酸含量高，由此可確定在傳統(tǒng)釀酒過程中大曲質(zhì)量的重要性和意義。

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優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-05-26；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160526.1206.010.html。

中圖分類號(hào)：TS262.3；TS261.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）07-0047-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016119

基金項(xiàng)目：甘肅省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（144JTGK220）。

收稿日期：2016-04-08

作者簡介：向雙全（1979-），男，大學(xué)本科，工程師，主要從事白酒風(fēng)味成分研究和白酒釀造工作。

Effects of Daqu Protease on Solid Fermentation of Baijiu

XIANG Shuangquan1，2，ZHOU Zhigang1，2，ZHANG Zhigang1，2，HUANG Yingyu1，2，LIU Lijuan2，WANG Lei2，HOU Huaning2and ZHOU Yingying2
（1.Gansu Engineering Technology Research Center of Solid-state Brewing，Huixian，Gansu 742308；2.Jinhui Liquor Co.Ltd.，Huixian，Gansu 742308，China）

Abstract:On the basis of traditional solid fermentation techniques of Nongxiang Baijiu，the key response factors influencing liquor yield were investigated by response surface method.Then the quadratic polynomial mathematical model of liquor yield，fermented grains acidity，fermented grains moisture content，and Daqu protease activity was set up by statistical method.And the best technical conditions were obtained through the analysis of model equation and 3D response diagram as follows:fermented grains acidity（A）=1.87，fermented grains moisture content（B）=52.77%，and Daqu protease activity（C）=14.37 U.Under above conditions，liquor yield reached up to 48.1%.（Trans.by YUE Yang）

Key words:acidity；moisture content；Daqu protease；liquor yield；Baijiu