張繼紅　王海燕　石孟瓊　劉　雄　周繼剛　談燕清　羅　濤　李浩然　田培琳

(1. 三峽大學(xué) 中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院&宜昌市中醫(yī)醫(yī)院， 湖北 宜昌　443000；2. 三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 湖北 宜昌　443002)

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珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用治療大鼠肝纖維化作用研究

張繼紅1王海燕1石孟瓊2劉雄1周繼剛1談燕清1羅濤1李浩然1田培琳1

(1. 三峽大學(xué) 中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院&宜昌市中醫(yī)醫(yī)院， 湖北 宜昌443000；2. 三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 湖北 宜昌443002)

摘要：觀察珠子參皂苷與骨髓干細(xì)胞(bone marrow stem cells, BMSCs)聯(lián)用對(duì)四氯化碳(CCl4)致大鼠肝纖維化損傷的治療作用．實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射50%CCl4(2和1 mL/kg/周)，連續(xù)8周制備大鼠肝纖維化模型，注射2周后灌胃給予珠子參皂苷(200 mg/kg)，正常組和模型組灌胃給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每天1次，共8周；在第5周，其中的珠子參皂苷組大鼠尾靜脈注射5×106/0.5 mL/只Dil標(biāo)記BMSCs，7 d后，用熒光顯微鏡檢測(cè)BMSCs向大鼠肝組織募集情況；8周后取血清，檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)移酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)水平；檢測(cè)肝組織羥脯氨酸(Hyp)水平和病理學(xué)變化，計(jì)算纖維化分級(jí)、膠原纖維和網(wǎng)狀纖維面積比．結(jié)果表明珠子參皂苷可顯著促進(jìn)BMSCs定向募集至肝臟受損部位，珠子參皂苷和其與BMSCs聯(lián)用均可明顯改善肝功能，降低血液中ALP、ALT、AST水平，增加TP、ALB水平和A/G，降低肝纖維化分級(jí)、膠原纖維和網(wǎng)狀纖維面積比及Hyp水平，改善肝臟組織形態(tài)學(xué)(P<0.05或P<0.01)，尤以珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用組效果最為顯著．本研究為珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用治療肝纖維化損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

關(guān)鍵詞：珠子參皂苷；肝纖維化；骨髓干細(xì)胞

骨髓干細(xì)胞(bone marrow stem cells, BMSCs)移植在治療肝纖維化等方面有了很大的進(jìn)展，以其費(fèi)用低廉、取材方便、不存在免疫排斥反應(yīng)等越來(lái)越受到重視．近年來(lái)，其在臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛．中藥在治療肝纖維化損傷方面有其獨(dú)到優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，但關(guān)于中醫(yī)藥對(duì)BMSCs的影響，促進(jìn)肝細(xì)胞再生方面的研究尚十分匱乏．珠子參為五加科植物RhizomaPanacismajoris的根，為土家族傳統(tǒng)的草藥．近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)珠子參皂苷對(duì)CCl4引起的大鼠肝纖維化損傷具有保護(hù)作用及可促進(jìn)BMSCs分化為肝細(xì)胞[1]．本研究在此基礎(chǔ)上，觀察珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用誘導(dǎo)BMSCs募集和對(duì)大鼠肝纖維化的治療作用，為珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)合臨床應(yīng)用治療肝纖維化提供依據(jù)．

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物

珠子參藥材購(gòu)自神農(nóng)架林區(qū)，經(jīng)三峽大學(xué)生物技術(shù)中心王玉兵博士鑒定為五加科人參屬植物珠子參的根狀莖，珠子參皂苷皂苷含量為92.65%，制備參照文獻(xiàn)[2]．

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體質(zhì)量為180～220 g的雄性Sprague-Dawley(SD)資料大鼠購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0004．

1.3主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清：美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶：美國(guó)Sigma公司；臺(tái)盼藍(lán)、氮唑溴鹽(MTT)：二甲基亞砜(DMSO)：美國(guó)Amresco公司；Dil-dye：invitrogen公司；CCl4：成都市科龍化工試劑廠；橄欖油：西班牙托雷斯和利貝雷斯公司；谷丙轉(zhuǎn)移酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、羥脯氨酸(Hyp)：南京建成生物科技有限公司；其它試劑為市售分析純．

1.4實(shí)驗(yàn)儀器

H-7500透射電子顯微鏡：日本日立公司；NIKON TE2000型熒光倒置顯微鏡：上海衡橋儀器有限公司；Olympus KX41型倒置顯微鏡、3111 CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo；ADVIA1200全自動(dòng)生化分析儀，國(guó)西門子公司．

1.5方法

1.5.1BMSCs分離與標(biāo)記

在無(wú)菌條件下處死SD大鼠，取出股骨，用細(xì)胞培養(yǎng)基(含10.0%胎牛血清)沖洗骨髓腔，收集沖洗液，離心收集沉淀后，加入預(yù)冷的NH4Cl溶液，混勻后，再次離心，收集沉淀，將其用細(xì)胞培養(yǎng)基(含10.0%胎牛血清)按2×106/mL密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后換液一次細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞單層長(zhǎng)到80%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后用5×106/0.5 mL Dil標(biāo)記的BMSCs后繼續(xù)培養(yǎng)．

1.5.2大鼠肝纖維化模型的建立及分組

將SD大鼠完全隨機(jī)分為正常組、肝纖維化模型組、BMSCs組、珠子參皂苷200 mg/kg組、BMSCs+珠子參皂苷200 mg/kg組5組．除空白組外，其余各組大鼠分別按2和1 mL/kg于周二和周五腹腔注射50%CCl4橄欖油溶液，每周2次，空白組注射同體積橄欖油．2周后，各注射CCl4溶液組大鼠飲水中加入苯巴比妥(350 mg/L)，同時(shí)各組大鼠灌胃給予對(duì)應(yīng)的藥物，正常組和模型組灌胃給予同體積的生理鹽水溶液，每天給藥1次，連續(xù)8周．在實(shí)驗(yàn)的第5周，BMSCs組和BMSCs+珠子參皂苷200 mg/kg組大鼠按5×106/0.5 mL/只尾靜脈注射Dil標(biāo)記的BMSCs，其他組注射同體積的生理鹽水，然后各組繼續(xù)給藥．

1.5.3BMSCs在肝纖維化大鼠體內(nèi)分布檢測(cè)

在尾靜脈注射Dil標(biāo)記的BMSCs 7 d后，隨機(jī)選取尾靜脈注射BMSCs的模型組和珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用組3只大鼠，處死后，迅速去除肝臟，進(jìn)行冰凍切片后，用熒光顯微鏡觀察BMSCs在肝纖維化組織中的分布情況．

1.5.4大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)的計(jì)算

分別稱重給藥前的體質(zhì)量、每周的體質(zhì)量；第8周末，實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉后腹腔主動(dòng)脈取血分離血清，取肝臟，并稱量其質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)(g/g×1 000)．

1.5.5血液指標(biāo)檢測(cè)

分離大鼠血清后，用生化分析儀測(cè)定其中的AST、ALB、ALP、ALT和TP的含量及白蛋白/球蛋白(A/G)．

1.5.6肝組織中Hyp檢測(cè)

分別取各實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行肝組織進(jìn)行勻漿，測(cè)定Hyp含量．具體方法按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行．

1.5.7肝組織形態(tài)學(xué)分析

肝組織經(jīng)切片和HE染色后，進(jìn)行肝纖維化分析．分析時(shí)按照改良Knodell評(píng)分方法進(jìn)行[3]．

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1珠子參皂苷對(duì)BMSCs向大鼠肝組織募集的影響

熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)大鼠移植經(jīng)Dil標(biāo)記

BMSCs 7 d后，模型組大鼠肝組織中僅有少量Dil標(biāo)記的BMSCs(發(fā)紅色熒光)，而用珠子參皂苷治療后，大量Dil染色標(biāo)記的BMSCs．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，珠子參皂苷可顯著促進(jìn)BMSCs定向募集至肝臟受損部位(圖1)．

圖1　珠子參皂苷對(duì)BMSCs向大鼠肝組織募集的影響

2.2珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用對(duì)大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)的影響

由表1可知，造模前和大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯差異，在用CCl4造模后，其體重增長(zhǎng)速度較正常組明顯降低(P<0.01)；用珠子參皂苷治療后，體質(zhì)量有明顯的改善；在肝重和肝臟指數(shù)方面，模型組均出現(xiàn)顯著升高；珠子參皂苷及與BMSCs聯(lián)用治療后，均出現(xiàn)了明顯的降低，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，尤以珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用組效果最為顯著．

表1　珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用對(duì)肝纖維化模型大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)的影響±s，n=8)

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.3珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用對(duì)大鼠肝功能的影響

由表2可知，模型組大鼠血液中ALT、ALP和AST含量顯著增加，ALB、TP含量和A/G值顯著降低，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；珠子參皂苷及與BMSCs聯(lián)用治療后，ALT、ALP、AST、ALB、TP含量及A/G值均得到改善，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，其中以珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用組作用效果最為顯著．

表2　珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用對(duì)大鼠肝功能的影響

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.4珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用對(duì)大鼠肝纖維化的影響

如表3和圖2所示，正常組肝索排列規(guī)則有序，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰正常；模型組肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性，肝索排列雜亂，肝小葉可見炎性浸潤(rùn)，膠原纖維、網(wǎng)狀纖維沉積異常增多；珠子參皂苷及與BMSCs聯(lián)用后，肝細(xì)胞炎性浸潤(rùn)和脂肪變性均顯著降低，膠原和網(wǎng)狀纖維樣變得到有效遏制．經(jīng)改良Knodell評(píng)分分析：模型組肝纖維化、膠原纖維面積、網(wǎng)狀纖維面積比和Hyp水平均明顯升高，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用后，上述異常改變均得到顯著的逆轉(zhuǎn)(P<0.05或P<0.01)，其中以珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用組作用效果最為明顯．

表3　珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用對(duì)大鼠肝纖維化的影響

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

A：正常組；B：模型組；C：BMSCs移植組；D：珠子參皂苷組；E：BMSCs移植+珠子參皂苷組HE染色圖2　珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用對(duì)大鼠肝纖維化的影響

3討論

干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能的原始細(xì)胞，雖然具有較強(qiáng)的分化潛能，但是在機(jī)體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境中，很難確保其較長(zhǎng)時(shí)間向單一方向分化，加之機(jī)體移植后存在成腫瘤(如畸胎瘤)的風(fēng)險(xiǎn)和倫理等諸多問(wèn)題，在一定程度上限制了其在臨床上的推廣應(yīng)用[4-5]．近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的許多科學(xué)家相繼研究發(fā)現(xiàn)BMSCs的分化能力是最為接近胚胎干細(xì)胞的成體干細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成為心、肝、腦、肌肉、軟骨、胰島等多種體細(xì)胞[6]．BMSCs因其來(lái)源豐富，自體移植可避免疫排斥反應(yīng)，不涉及倫理等諸多優(yōu)點(diǎn)而倍受關(guān)注，充分開發(fā)利用BMSCs，將為心、肝、腦等重要器官致命性疾病的治療開辟一條新的道路．

我國(guó)在20世紀(jì)80年代就開展了中藥對(duì)BMSCs的生物學(xué)影響研究，應(yīng)用中藥治療血液病、抗放化療副作用等取得了很好的臨床效果[7-8]．由于乙肝患者在我國(guó)仍擁有大量的人群，加之人們不合理的飲食、飲酒習(xí)慣，使得了肝臟疾病在我國(guó)高居不下，肝纖維化、肝硬化、肝癌和肝衰竭已成為當(dāng)前臨床防治的重點(diǎn)．干細(xì)胞移植為治療終末期肝病提供了新的希望，而BMSCs以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，得到了許多研究者的青睞．為此積極開展中藥干預(yù)BMSCs動(dòng)員、擴(kuò)增、定向分化、移植等方面的研究具有重要的重要意義和應(yīng)用價(jià)值．近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)珠子參皂苷對(duì)CCl4引起的大鼠肝纖維化損傷有較好的保護(hù)作用，證實(shí)與延緩肝細(xì)胞衰老和促進(jìn)肝細(xì)胞增殖密切相關(guān)[1]；在體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)珠子參皂苷可誘導(dǎo)BMSCs分化為肝細(xì)胞，使其具有了合成糖原、攝取低密度脂蛋白及分泌尿素的能力．在本實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)觀察珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)用對(duì)肝纖維化大鼠的治療作用發(fā)現(xiàn)，珠子參皂苷可促進(jìn)BMSCs定向募集至肝臟受損部位，降低血液中ALP、ALT、AST水平，增加TP、ALB水平和A/G比值，降低肝組織Hyp含量和肝纖維化，改善肝臟組織形態(tài)學(xué)．本研究為珠子參皂苷與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用治療肝纖維化損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

參考文獻(xiàn)：

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[責(zé)任編輯周文凱]

DOI：10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2016.03.023

收稿日期：2015-11-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81341141)；湖北省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(No. 2011JX5C21)

通信作者：石孟瓊(1971-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥藥理研究．E-mail：shmq0212@126.com

中圖分類號(hào)：R282.71

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-948X(2016)03-0104-04

Therapeutical Effect of Saponins fromRhizomaPanacisMajorisCombined with BMSCs on Hepatic Fibrosis Induced by CCl4in Rats

Zhang Jihong1Wang Haiyan1Shi Mengqiong2Liu Xiong1Zhou Jigang1Tan Yanqing1Luo Tao1Li Haoran1Tian Peilin1

(1. Traditional Chinese Medicine Clinical Hospital, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China; 2. Medical Science College, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China)

AbstractThe aim is to observe the therapeutical effect of saponins from Rhizoma Panacis Majoris combined with BMSCs on hepatic fibrosis induced by CCl4 in rats. The rat model of hepatic fibrosis was induced by intraperitoneal injection of CCl4. After the two weeks, the two groups selected were orally given saponins from Rhizoma Panacis Majoris (200mg/kg), the rest of the normal and model groups were given equal volume of 0.5% sodium carboxymethyl cellulose solution, once a day for 8 weeks. On the fifth week, the one group of two saponins treated group was injected bone marrow stem cells (BMSCs) labeled Dil by tail vein, and the floatations of BMSCs in rat liver tissued were detected by fluorescence microscope after the eighth day. Treatment with saponins from Rhizoma Panacis Majoris for eight weeks later, serum glutamic-pyruvic transaminase (ALT), glutamic-oxalacetic transaminase (AST), alkaline phosphatase (ALP), total protein (TP), albumin (ALB) were detected; Liver tissue hydroxyproline (Hyp) content and morphology, grading of liver fibrosis, ratio of collagen fiber area and reticular fiber area were evaluated by HE staining; Our study showed that saponins from Rhizoma Panacis Majoris significantly promoted the BMSCs directed recruitment to the damaged part of the liver; Saponins from Rhizoma Panacis Majoris combined with BMSCs could significantly improve liver function, decrease serum ALP, ALT, AST contents, increase TP, ALB contents and A/G ratio, decrease the liver tissue Hyp content, grading of liver fibrosis, ratio collagen fiber area and reticular fiber area, improve liver tissue morphology (P<0.05 or P<0.01, respectively), especially saponins from Rhizoma Panacis Majoris combined with BMSCs group. This study provides an experimental basis for the application of Rhizoma Panacis Majoris combined with BMSCs in the treatment of hepatic fibrosis.

KeywordsRhizoma Panacis Majoris;hepatic fibrosis;bone marrow stem cells