劉　凱　許茸茸　孫少伯　朱貝貝　高　瑛　李應(yīng)東

(蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅　蘭州　730000)

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當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾物對(duì)大鼠心肌細(xì)胞線粒體凋亡通路的影響

劉凱1許茸茸孫少伯1朱貝貝1高瑛2李應(yīng)東1

(蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000)

〔摘要〕目的探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物對(duì)大鼠心肌細(xì)胞線粒體凋亡通路的影響。方法原代培養(yǎng)Wistar大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)分正常組、阿霉素組(2.5 mg/L)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物低、中、高劑量干預(yù)組(阿霉素造模前，預(yù)先給予含30,60,120 mg/L當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h)。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率,熒光顯微鏡下各組細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察，激光共聚焦技術(shù)測(cè)定各組心肌細(xì)胞線粒體膜電位水平，蛋白印跡法測(cè)定各組Bax，Bcl-2,Caspase-3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與正常組相比，阿霉素組心肌細(xì)胞存活數(shù)明顯降低，可見細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位降低；Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，Bax、Caspase-3表達(dá)水平升高(P<0.05)；與阿霉素組比較，當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物干預(yù)組的心肌細(xì)胞存活數(shù)明顯升高，凋亡細(xì)胞數(shù)目減少，線粒體膜電位升高，Bax、Caspase-3表達(dá)水平下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論線粒體凋亡通路的激活是阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一，當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物可調(diào)控該通路發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物;心肌細(xì)胞；線粒體；凋亡

線粒體凋亡通路是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路之一。阿霉素(ADR)是一種高效廣譜的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，但其可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，有心臟毒性，使其臨床應(yīng)用受到一定限制〔1，2〕。當(dāng)歸補(bǔ)血湯為益氣補(bǔ)血名方，其當(dāng)歸與黃芪1∶5配伍，本實(shí)驗(yàn)藥物選用甘肅道地藥材多序巖黃芪與岷當(dāng)歸，經(jīng)超濾膜技術(shù)截留0～100 000分子量成分〔3〕。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示〔4～6〕：當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物對(duì)氧化損傷致心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用，對(duì)ADR造成的心肌細(xì)胞損傷有抑制作用，但線粒體凋亡通路在其中的變化情況少有研究。本文探討線粒體凋亡通路在ADR誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的變化及當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物對(duì)其影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾物由甘肅中醫(yī)學(xué)院、甘肅省膜科所、蘭州佛慈制藥廠、蘭州太保制藥有限公司聯(lián)合制備。當(dāng)歸、多序巖黃芪飲片按1∶5比例混合，水煎煮兩次，過(guò)濾雜質(zhì)后加熱濃縮，陶瓷膜微濾濃縮液(技術(shù)參數(shù)為壓力0.5 kPa/m3，流量100 L·h-1·m-2，溫度25℃)，選用中空纖維超濾膜(截留相對(duì)分子量為1×105PNA)，超濾經(jīng)微濾處理的當(dāng)歸補(bǔ)血湯濃縮液(技術(shù)參數(shù)為膜面積0.25 m2，過(guò)濾能力2～30 L/h，系統(tǒng)壓力≤5.0 bar)，將超濾液噴霧干燥成粉，相對(duì)生藥材的得率為0.89%。藥物成分多糖39.9%，皂苷3.5%，其他56.6%。高效液相檢測(cè)指紋圖譜進(jìn)行質(zhì)控。

1.2動(dòng)物新生Wistar大鼠，1～3日齡，甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(甘)2013-0001，合格證號(hào):0001018。

1.3試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、膠原酶(Ⅱ型)、胰蛋白酶：GIBCO公司產(chǎn)品；5-溴脫氧尿嘧啶、碘化丙啶(PI)、四氮唑藍(lán)(MTT)、羅丹明123(Rh123)、二甲基亞砜(DMSO)、雙苯并咪唑(Hoechst 33342)：Sigma公司產(chǎn)品；ADR：山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1103E3；兔抗鼠β-actin、Bax、Bcl-2、Caspase-3多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG：武漢博士德公司； PVDF膜：上海信然生物科技有限公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒：碧云天公司產(chǎn)品；2406-2型二氧化碳培養(yǎng)箱：美國(guó)SHELLAB產(chǎn)品 ；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(m680)：北京元業(yè)伯樂(lè)科技發(fā)展有限公司；FV1000激光共聚焦顯微鏡：日本Olympus公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)(AlPhalmager2200型)：美國(guó)AIPha公司產(chǎn)品。

1.4方法

1.4.1心肌細(xì)胞原代提取培養(yǎng)參照文獻(xiàn)〔7〕，取新生1～3 d的Wistar大鼠,麻醉處死，無(wú)菌條件迅速取出心臟，4℃PBS清洗2遍，剔除附屬物留心尖組織，將其剪成約1～3 mm3大小組織塊，加入0.04%胰蛋白酶消化，37℃水浴振蕩10 min，共2次，棄去消化液，用0.05%膠原酶(Ⅱ型)消化，37℃水浴振蕩8 min，多次消化至組織塊消化完全。收集每次消化液，加等量含15%胎牛血清完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min，離心10 min，用含15%胎牛血清完全培養(yǎng)基混懸消化下來(lái)的細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)。采用差速貼壁法與5-溴脫氧尿苷化學(xué)方法純化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度1×106個(gè)/ml，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每隔36 h換液 1 次，細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)72 h 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分5組：正常組(預(yù)先給予與藥物組含等量生理鹽水的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h后，更換培養(yǎng)基，加入與ADR等量的生理鹽水)，ADR組(預(yù)先給予與藥物組含等量生理鹽水的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h后，更換培養(yǎng)基，加入ADR，調(diào)整其終濃度為2.5 mg/L)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾物低、中、高劑量干預(yù)組(分別預(yù)先給予含300,600,1 200 mg/L歸補(bǔ)血湯超濾物超濾膜提取物完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h后，更換培養(yǎng)基，各組樣本培養(yǎng)基中加入ADR，調(diào)整其終濃度為2.5 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后行指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.3 細(xì)胞活性測(cè)定96孔板培養(yǎng)心肌細(xì)胞貼壁，加10 μl/孔MTT(5 mg/L)培養(yǎng)4 h后，加150 μl/孔DMSO，震蕩10 min，490 nm酶標(biāo)儀測(cè)各孔吸光度值(OD值)。所測(cè)OD值可定量反映活細(xì)胞數(shù)量。生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組OD值-干預(yù)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.4.4凋亡形態(tài)學(xué)觀察〔8〕用盛有蓋玻片的六孔板培養(yǎng)心肌細(xì)胞(密度1.5×105ml)，待細(xì)胞爬片，造模，PBS漂洗心肌細(xì)胞，加300 μl/孔Hoechst33342(5 mg/L)染色后，避光放置30 min，PBS漂洗2次，將細(xì)胞爬片反置于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.4.5線粒體膜電位(Δφm)檢測(cè)〔9～13〕將心肌細(xì)胞接種于共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿中(密度1.5×105ml)，造模，PBS漂洗心肌細(xì)胞，加10 μl/皿 Rh123染液(終濃度為10 mg/L)，孵育10 min，PBS漂洗2次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)Rh123的熒光強(qiáng)度變化，激發(fā)波長(zhǎng)488～505 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。每組6樣本，每樣本隨機(jī)取3個(gè)視野觀測(cè)拍照，細(xì)胞內(nèi)熒光積分光密度值/熒光區(qū)域面積(IOD/Area)應(yīng)用Image Pro-Plus 6.0軟件分析。

1.4.6蛋白檢測(cè)〔14,15〕收集各組心肌細(xì)胞，4℃PBS漂洗2遍,裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì),考馬斯亮藍(lán)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定蛋白濃度。每組各取50 μl蛋白量經(jīng)SDS PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加Bax，Bcl-2，Caspase-3，β-actin抗體4℃孵育過(guò)夜，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG于37℃孵育1 h,加ECL發(fā)光試劑孵育1 min,暗室將膜在感光膠片上曝光，加顯影液，定影液洗像。Bax 、Bcl-2、Caspase-3分子量約為22 kD、26 kD、32 kD。用Alpha Imager2200圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描,計(jì)算 Bax，Bcl-2，Caspase-3與β-actin灰度比值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1不同濃度ADR對(duì)心肌細(xì)胞活性的影響采用MTT法檢測(cè)ADR終濃度為1.25、2.50、5.0、10.0 mg/L，在12、24 h下對(duì)原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，正常組加等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)選擇ADR作用于心肌細(xì)胞12、24 h對(duì)其生長(zhǎng)均有明顯抑制作用(P<0.05)；2.5 mg/L ADR作用于心肌細(xì)胞24 h抑制率達(dá)52.17%，構(gòu)建心肌細(xì)胞凋亡模型。見表1。

2.2不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物對(duì)心肌細(xì)胞活性的影響不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物預(yù)處理心肌細(xì)胞2 h,更換不含藥物的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,于預(yù)處理2 h后及繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分別測(cè)定各組MTT值，正常組加等體積生理鹽水，結(jié)果見表2。與正常組比較，預(yù)處理2 h后各藥物組心肌細(xì)胞的OD值無(wú)明顯差異(P>0.05)；與正常組細(xì)胞比較，預(yù)處理心肌細(xì)胞2 h后,更換不含藥物的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,各藥物組心肌細(xì)胞的OD值出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，各藥物組呈現(xiàn)出一定促心肌細(xì)胞增殖作用。依據(jù)結(jié)果選定300、600、1 200 mg/L作用于心肌細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。見表2。

表1　不同濃度ADR對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡作用

與0.00 mg/L劑量組比較：1)P<0.05，下表同

2.3當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物對(duì)ADR誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的抑制作用與正常組比較，ADR組心肌細(xì)胞的OD值降低顯著(P<0.05)，說(shuō)明造模成功。與ADR組相比，各劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物干預(yù)組心肌細(xì)胞的OD值明顯上升(P<0.05)。見表3。各組細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342染色后(圖1)，與正常組比較，ADR組胞核呈高度濃染的凋亡細(xì)胞較多，與ADR組比較，當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物預(yù)處理組的凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少。

2.4各組心肌細(xì)胞Δφm與正常組比較，ADR組細(xì)胞內(nèi)Rh123 熒光明顯減弱，心肌細(xì)胞Δφm降低(P<0.05)；與ADR組比較，當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物干預(yù)組心肌細(xì)胞內(nèi)Rh123熒光增強(qiáng)，細(xì)胞Δφm 升高(P<0.05)。見表3，圖2。

表2　當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物不同濃度作用心肌細(xì)胞不同時(shí)間MTT值

表3　各組心肌細(xì)胞抑制率、線粒體膜電位Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值

與正常組比較：1)P<0.05；與ADR組比較:2)P<0.05

圖1　各組心肌細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察(×200)

圖2　線粒體膜電位圖(×400)

2.5各組心肌細(xì)胞Bax，Bcl-2，Caspase-3蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值變化與正常組相比，ADR組心肌細(xì)胞中Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，Bcl-2/Bax的比值降低(P<0.05)。與ADR組比較，高劑量和中劑量干預(yù)組細(xì)胞中Bax，Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)， Bcl-2/Bax比值有一定升高(P<0.05)。見表3、圖3。

1.正常組；2.ADR組；3.低劑量干預(yù)組；4.中劑量干預(yù)組；5.高劑量干預(yù)組高劑量干預(yù)組圖3　各組心圖3　各組心肌細(xì)胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá)情況

3討論

在線粒體凋亡通路中，損傷刺激會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞Bax發(fā)生構(gòu)象變化，通過(guò)暴露TM域易位到線粒體外膜上，同時(shí)暴露BH3域和疏水區(qū)在線粒體外膜上齊聚形成脂質(zhì)孔，脂質(zhì)孔的形成致使線粒體膜通透性增加，膜電位崩解，引起膜間隙蛋白細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞色素C、Apaf1、dATP形成凋亡小體，凋亡小體激活線粒體凋亡通路下游的Caspase家族起動(dòng)因子Caspase-9，活化的Caspase-9激活下游執(zhí)行者Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔16～19〕。在線粒體凋亡通路中，Bcl-2家族的抗凋亡與促凋亡蛋白通過(guò)形成異源二聚體并定位于線粒體外膜上發(fā)揮作用，在維持線粒體膜的完整性，維持正常的線粒體跨膜電位，抑制線粒體膜間隙蛋白細(xì)胞色素C的釋放有重要意義，Bcl-2/Bax比值降低細(xì)胞趨向凋亡，Bcl-2/Bax比值升高細(xì)胞趨向存活〔20〕。當(dāng)歸補(bǔ)血湯是益氣生血的經(jīng)典方，研究表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用確切，可以提高心肌細(xì)胞的代謝和補(bǔ)償能力〔4，21〕。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明ADR成功誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞的凋亡，線粒體凋亡通路的激活是ADR誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一，當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物可調(diào)控其通路發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。黃芪、當(dāng)歸是中醫(yī)益氣、補(bǔ)血的常用藥物。當(dāng)歸補(bǔ)血湯中重用黃芪，其具有益氣升陽(yáng),益衛(wèi)固表等功效，當(dāng)歸為血中氣藥，具有活血補(bǔ)血之功，兩藥合用補(bǔ)氣生血之力強(qiáng)，氣旺則血生，陽(yáng)生則陰長(zhǎng)。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生能量的場(chǎng)所，是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的中心，中醫(yī)氣血理論與其密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示益氣生血藥物對(duì)線粒體功能有積極調(diào)控作用，可以對(duì)抗ADR對(duì)心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)與功能的破壞。

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〔2014-03-13修回〕

(編輯苑云杰/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：甘肅省中醫(yī)藥科研課題(No.07-gzk-31)

通訊作者：李應(yīng)東(1962-)，男，醫(yī)學(xué)博士，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治內(nèi)科常見病研究。

〔中圖分類號(hào)〕R259

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)13-3115-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.010

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)2蘭州太保制藥有限公司

第一作者：劉凱(1974-)，男，在讀博士，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治內(nèi)科常見病研究。