徐建中，　王穎妤，　嚴為留，　張偉國

江南大學生物工程學院工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122

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一株產(chǎn)甲萘醌-7(MK-7)菌的分離鑒定及產(chǎn)物合成條件的初步研究

徐建中，王穎妤，嚴為留，張偉國*

江南大學生物工程學院工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122

摘要：本文從豆豉中分離出了一株高產(chǎn)MK-7的菌株并對其進行了鑒定，同時對該菌合成MK-7的條件進行了初步研究。在參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，并根據(jù)形態(tài)學特征、生理生化特性、并結合16S rDNA序列分析結果，該菌屬于解淀粉芽孢桿菌。該菌合成MK-7的最佳條件為：發(fā)酵溫度37 ℃、裝液量為30 mL/250 mL、接種量為2%和搖瓶培養(yǎng)時間為3 h。研究發(fā)現(xiàn)，菌株Y-2合成的MK-7主要存在于細胞內(nèi)。以上結果可為基于菌株Y-2選育高產(chǎn)MK-7菌株和實現(xiàn)MK-7的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

關鍵詞：中國豆豉； 甲萘醌-7； 解淀粉芽孢桿菌； 產(chǎn)物分布

豆豉(Douchi; Lobster sauce)是我國傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵制品，因其營養(yǎng)豐富、藥食兼用，而在我國四川、江蘇、山東等地區(qū)廣泛食用。根據(jù)參與發(fā)酵的優(yōu)勢微生物菌群不同，可將豆豉分為霉菌型豆豉和細菌型豆豉[1]。細菌型豆豉多是利用枯草芽孢桿菌、豆豉芽孢桿菌、乳酸菌等微生物在較高溫度下作用于蒸熟的大豆，借助微生物蛋白水解酶作用而制成的。豆豉營養(yǎng)價值高，除含有大量人體必須的氨基酸外，還含有多種維生素如維生素K1和維生素K2[2]。

維生素K2，又稱為甲萘醌，是由一個甲基萘醌母環(huán)和一條位于母環(huán)C-3位置上的異戊二烯側鏈組成的一類具有醌類結構的脂溶性化合物[3]。根據(jù)側鏈上異戊二烯單元個數(shù)不同，甲萘醌共分為14種，以MK-n表示。甲萘醌-7(MK-7)為MK-n中的一員，其側鏈上含有7個異戊二烯單元。MK-7具有較長的半衰期，在血液中很穩(wěn)定，因而是哺乳動物產(chǎn)生凝血因子II、VII、IX和X的一個非常重要的輔因子，對血液凝固是不可或缺的營養(yǎng)素[4, 5]。Kim等[6]指出，MK-7還具有降血壓的作用。此外，MK-7可以抑制成骨細胞的生長，從而刺激成骨細胞的分化，形成骨頭。有國外學者指出，每天補充一定量的MK-7能夠顯著提高老年人骨頭中的礦物質(zhì)密度(BMD)，降低老年人的髖骨骨折風險[7]，而在健康的青春期前期兒童體內(nèi)補充少量的MK-7可以提高體內(nèi)游離的MK-7含量，有利于提高骨鈣蛋白的羧化作用[8]。此外，MK-7能夠協(xié)助調(diào)控Ca2+的利用和促進Gla蛋白質(zhì)(Matrix Gla Protein，MGP)的活性，從而防止鈣質(zhì)在血管中沉淀而造成的動脈硬化[9]。因此，MK-7是國際上新興的第三代預防和治療骨質(zhì)疏松的保健食品，其安全性已得到美國FDA、中國SFDA、美國藥品研究所及歐洲議會和歐盟理事會的權威認定，其功能正在受到越來越多的關注。

傳統(tǒng)的MK-7生產(chǎn)方法是直接從發(fā)酵煮熟大豆形成的豆豉或納豆中提取，其菌種主要為能夠產(chǎn)生纖溶酶的芽孢桿菌屬。隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)纖溶酶產(chǎn)生菌在發(fā)酵過程中除了合成纖溶酶外，還能合成大量的MK-7等維生素K2[10]。因此，纖溶酶產(chǎn)生菌具有極大的合成MK-7的潛力。Wu等[11]從韓國傳統(tǒng)發(fā)酵食品Cheonggukjang中分離到了一株MK-7高產(chǎn)菌BacillusamyloliquefaciensBY01，對其發(fā)酵條件優(yōu)化后，BY01的MK-7產(chǎn)量達到了7.54 μg/g，比原產(chǎn)品含量提高了2倍。Berenjian等[12]從商品納豆中也篩選到了一株MK-7高產(chǎn)菌，利用中心復合設計對其合成MK-7的發(fā)酵條件進行優(yōu)化后MK-7產(chǎn)量達到了62.32 mg/L，是目前有報道的最高產(chǎn)量。然而，需要指出的是目前利用纖溶酶產(chǎn)生菌發(fā)酵生產(chǎn)MK-7的培養(yǎng)基成本還比較高，且MK-7產(chǎn)量還不高，因此對MK-7高產(chǎn)菌的選育工作還有待于進一步深入。本研究以我國不同區(qū)域的豆豉為研究材料，分離鑒定出一株具有淀粉水解能力的、高產(chǎn)MK-7的菌株——解淀粉芽孢桿菌Y-2(B.amyloliquefaciensY-2)，并分析了該菌大量合成MK-7的最佳條件以及發(fā)酵過程中MK-7的分布。研究結果可為基于菌株Y-2選育高產(chǎn)MK-7菌株和實現(xiàn)MK-7的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

樣品：來自我國不同省份和不同生產(chǎn)廠家的10份豆豉樣品的廠家有：T廠家(產(chǎn)地：江蘇)、H廠家(產(chǎn)地：江蘇)、S廠家(產(chǎn)地：四川)、R廠家(產(chǎn)地：重慶)、L廠家(產(chǎn)地：廣東)Q廠家(產(chǎn)地：廣東)D廠家(產(chǎn)地：江西)、J廠家(產(chǎn)地：福建)、Y廠家和W廠家(產(chǎn)地：山東)。

試劑：MK-7標準品(純度99.8%)購于美國ChromaDex公司；酵母提取物和蛋白胨購于英國Oxiod公司；甲醇、乙腈和二氯甲烷為色譜純，購于國藥集團上?；瘜W試劑廠；基因組提取試劑盒和Taq DNA聚合酶購于寶生物(大連)生物技術有限公司；引物合成、DNA 產(chǎn)物純化試劑盒購于生工生物(上海)有限公司。

1.2菌株的分離與培養(yǎng)

1.2.1培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

分離基本培養(yǎng)基(g/L)：15 葡萄糖、15 大豆蛋白胨、5 纖維蛋白、1 KH2PO4·12H2O、2.5 K2HPO4·3H2O、2.5 MgSO4·7H2O、0.5游霉素和15瓊脂，pH 7.0～7.2。種子培養(yǎng)基(g/L)：15 葡萄糖、15 蛋白胨、1 KH2PO4、2.5 K2HPO4·3H2O、2.5 MgSO4·7H2O，pH 7.0～7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：1 L 玉米粉液化液、41.52 豆粕粉，16.31 大豆蛋白胨、15.51 酵母膏、0.13 K2HPO4·3H2O、3.11 NaCl，pH 7.0～7.2。分離培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基在0.1MPa下高壓滅菌20 min，而發(fā)酵培養(yǎng)基在0.07 MPa下高壓滅菌20 min。菌體培養(yǎng)溫度為(37±1) ℃，培養(yǎng)時間為8～12 h。非特殊說明，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)時將對數(shù)生長期的種子液按2%(v/v)接種量轉接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，并以100 r/min在往復式搖床上培養(yǎng)24 h。

1.2.2操作方法

取0.5 g樣品于含有少量玻璃珠的10 mL無菌生理鹽水中，80 ℃水浴震蕩10 min。取100 μL懸浮液，用適量無菌生理鹽水稀釋，取200 μL稀釋液涂布于初篩平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h，從中挑選出能產(chǎn)生透明溶解圈的菌落并通過平板分離和劃線獲得單菌落。挑選產(chǎn)生透明溶解圈大的菌落轉接到MK-7發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心去菌體，采用薄層層析法(TLC)測定各菌落合成MK-7的能力，最終篩選出高產(chǎn)MK-7的菌株。

1.3菌株鑒定

對分離到的高產(chǎn)MK-7菌株參考《常見細菌鑒定手冊》[13]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[14]進行形態(tài)學和生理生化鑒定。16S rDNA鑒定時采用細菌基因組提取試劑盒提取菌株Y-2的全基因組并為PCR反應模板，以細菌16S rDNA通用引物(F: 5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；R: 5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)為引物，利用ExTaq DNA聚合酶進行PCR擴增反應。PCR 反應條件為: 95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃ 終延伸10 min，整個程序循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物純化后送交生工生物工程(上海)有限公司進行測序，測序結果通過在線分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，與GenBank中的16S rDNA序列進行同源性分析并采用軟件MEGA 5.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4纖溶酶活的測定方法

纖溶酶活的測定采用標準纖維蛋白平板法[15]。每次點樣20 μL，37 ℃培養(yǎng)12 h后測定透明圈的直徑，再和尿激酶標準曲線比較，得出與尿激酶酶活單位(IU/mL)相對應的豆豉纖溶酶的酶活。纖溶酶活標準曲線的制作：將稀釋的尿激酶標準品(20 IU/mL、40 IU/mL、60 IU/mL、80 IU/mL、100 IU/mL和120 IU/mL)各20 μL，點樣于標準纖維蛋白平板，37 ℃保溫12 h，測定透明圈的面積，以溶圈直徑乘積對數(shù)為橫坐標，濃度對數(shù)為縱坐標，繪制尿激酶標準曲線。

1.5MK-7的提取與檢測方法

1.5.1樣品中MK-7的提取方法

MK-7的提取參照Berenjian等[12]和嚴為留等[16]建立的方法進行，萃取劑選用2︰1(v/v)的正己烷/異丙醇。發(fā)酵結束后，發(fā)酵液經(jīng)常溫下5 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液和菌體。在萃取上清液時，按上清液/萃取液為41(v/v)加入萃取液，漩渦振蕩10 min，然后5 000 r/min離心5 min后回收有機相。在對菌體萃取時，按菌體量/萃取液為4︰1(w/v)加入萃取液，其他步驟與萃取上清液時相同。隨后，將獲得的有機相溶液于40 ℃減壓旋轉濃縮，完成MK-7的提取。在整個提取過程中盡量避光，同時增加萃取次數(shù)以提高提取效率。

1.5.2樣品中MK-7的檢測

利用TLC方法檢測MK-7時，參照Morishita等[17]建立的方法進行，其中硅膠板選用60GF254型號，展開劑為己烷-乙醚(85︰15；v/v)。層析結束后，利用UV分光光度計在254 nm下檢測MK-7含量。利用高效液相色譜法(HLPC)檢測MK-7參照嚴為留等[16]建立的方法，MK-7濃縮液溶解后采用0.22 μm微孔濾膜過濾，然后進行HLPC分析。液相色譜條件及進樣量參照嚴為留等[16]設定的參數(shù)。

2結果與討論

2.1高產(chǎn)MK-7菌株的篩選

根據(jù)纖維蛋白-瓊脂平板上所形成的透明圈的大小，挑取6株形成大透明圈的菌株，分別命名為T-26、S-33、R-5、Q-11、Y-2和W-21。經(jīng)標準纖維蛋白平板測定，它們的纖溶酶活在1 400～1 500 IU/mL之間(表1)。由于納豆和豆豉來源的纖溶酶產(chǎn)生菌在發(fā)酵過程中主要合成MK-7，因此本文對6株纖溶酶高產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)MK-7的能力進行了考察。從表1中可以看出，菌株Y-2的MK-7產(chǎn)量最高，而菌株W-21幾乎檢測不出MK-7。因此，本文選擇菌株Y-2作為后期高產(chǎn)MK-7菌株的研究。

表1　各菌株的纖溶酶活和MK-7產(chǎn)量

2.2菌株的鑒定

2.2.1菌株的形態(tài)學鑒定

高產(chǎn)MK-7的菌株Y-2在LBG平板形成的單菌落為深白色，不規(guī)則圓形，中央突起(圖1A)。在培養(yǎng)前期，菌落呈半透明狀，菌體粘稠度低；培養(yǎng)12 h后，菌落顏色逐漸發(fā)白，粘稠度增加；培養(yǎng)48 h，菌落直徑可達到1 cm以上，菌落表面褶皺、變硬，中央不規(guī)則突起，邊緣不光滑；繼續(xù)培養(yǎng)，菌落的飽滿度會下降，菌體貼在平板表面，不再生長。芽孢染色結果如圖1B所示，視野中的菌體個體微小，長約3～5 μm，寬0.6～0.9 μm，其中有芽孢的短桿菌占多數(shù)，芽孢中生或次中生，呈球形或橢圓形，不明顯膨大，多為兩端均勻染色。

2.2.2菌株的生理生化鑒定

將菌株Y-2進行搖瓶培養(yǎng)時，菌液呈現(xiàn)獨特的臭雞蛋味；搖瓶靜止培養(yǎng)時，菌體均富集在液體表面生長，表明其均為好氧菌。進一步的生理生化鑒定結果見表2，從表中可以看出，菌株Y-2能夠利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖和甘露糖，但是不能利用乳糖和半乳糖；同時菌株Y-2在生長過程中也表現(xiàn)出了較強的水解淀粉、明膠和酪蛋白的能力。

2.2.316S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

通過PCR擴增獲得菌株Y-2的16S rDNA序列，所測得到的序列長度為1 516 bp。將所測序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對分析，結果表明菌株Y-2與解淀粉芽孢桿菌有著最高的序列相似度(99%；圖2)，與芽孢桿菌屬其他種的芽孢桿菌也有較高的相似度，結合菌落形態(tài)，因此初步判斷菌株Y-2屬于解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

圖1　Y-2的菌落形態(tài)(A)和芽孢染色效果圖(B)

實驗項目實驗結果菌株Y-2菌株168實驗項目實驗結果菌株Y-2菌株168革蘭氏染色++V.P.反應++M.R.試驗++7%NaCl生長++葡萄糖++甘露糖+-阿拉伯糖+-乳糖、半乳糖-+淀粉水解++酪素水解++硝酸鹽還原++明膠水解+-石蕊牛奶還原試驗++厭氧生長試驗--硫化氫產(chǎn)生試驗--產(chǎn)生吲哚試驗--接觸酶++氧化酶++

注：“+”為陽性反應，“-”為陰性反應

2.3產(chǎn)MK-7條件的研究

2.3.1最佳培養(yǎng)溫度和裝液量

不同的培養(yǎng)溫度和溶氧量對菌體生長和目的產(chǎn)物的合成都具有重要影響作用，因此本文考察了不同溫度和裝液量對B.amyloliquefaciensY-2產(chǎn)MK-7的影響，其結果見圖3。

從圖3A中可以看出，37 ℃是合成MK-7的最適溫度，而這個溫度同時也是菌體生長和合成納豆激酶的最適宜溫度。前期研究結果發(fā)現(xiàn)[3]，菌株Y-2在靜置培養(yǎng)條件下能夠合成更多的MK-7，而隨著轉速的提高，MK-7的產(chǎn)量大幅下降。然而，菌株Y-2又是好氧菌，因此菌體在培養(yǎng)的過程中都是富集在液體表面生長，搖瓶中過高的裝液量反而導致菌體無法充分利用培養(yǎng)基組分而造成MK-7產(chǎn)量降低。因此，本文考察了裝液量對MK-7合成的影響，從圖3B中可以看出，30 mL/250 mL三角瓶則是一個比較適宜的搖瓶裝液量水平，而隨著裝液量的增加MK-7產(chǎn)量急速下降。因此，今后若是要工業(yè)放大，則可能需要參考淺盤發(fā)酵的培養(yǎng)工藝。

圖2　菌株Y-2基于16S rDNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3　溫度(A)和裝液量(B)對MK-7產(chǎn)量的影響

2.3.2接種量和搖培時間的優(yōu)化

將菌株Y-2的種子液分別按1%、2%、3%、4%和5%(v/v)的比例接種，考察不同接種量對MK-7產(chǎn)量的影響。從圖4A中可以看出，在2%的接種量下，MK-7的產(chǎn)量最高，而隨著接種量增大，MK-7產(chǎn)量反而降低，因此確定最佳的接種量為2%。此外，考慮到接種后直接靜置培養(yǎng)不利于獲得較高的菌體量，也不利于MK-7的合成，因此對接種后的搖瓶培養(yǎng)時間(即搖培時間)進行優(yōu)化也非常有必要。本文考察了接種后分別搖瓶培養(yǎng)0 h、1 h、2 h、3 h和4 h對MK-7產(chǎn)量的影響，其結果如圖4B所示。從圖4B中可以看出，搖培3 h最有利于MK-7的合成，這可能是由于此時的菌體正處于對數(shù)生長期，菌體活力最為旺盛，因此確定接種后的搖培時間為3 h。

2.3.3MK-7的分布

Yanagisawa和Sumi[18]等研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中存在大量的水溶性MK-7，并指出這是由于一部分MK-7與胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)形成了復合物，并在培養(yǎng)過程中被釋放到培養(yǎng)基內(nèi)變成“水溶性”MK-7。為了弄清楚MK-7的分布情況，本文分別測定了發(fā)酵過程中菌體和發(fā)酵液這兩部分中的MK-7含量，其結果見圖5。

圖4　接種量(A)和搖培時間(B)對MK-7產(chǎn)量的影響

圖5　MK-7的分布情況

然而，與Yanagisawa和Sumi[18]的研究結果不同，本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中確實存在部分MK-7，但含量只是菌體中的1/4～1/3(圖5)。需要指出的是，隨著發(fā)酵時間的延長，胞外MK-7含量逐漸增加，這一結果與Wu等[11]的研究結果基本一致。特別是到了第6 d，發(fā)酵液中MK-7的量出現(xiàn)了較大幅度的增長，幾乎是第5 d的兩倍，這可能是因為到了第6 d，菌體進入衰亡期，部分菌體開始裂解，導致胞內(nèi)的那部分MK-7被釋放到了胞外?？紤]到液液萃取的效率和提取成本，在今后的工業(yè)化生產(chǎn)中可以進一步縮短發(fā)酵周期，在菌體生長到穩(wěn)定期即可終止發(fā)酵，并且在提取操作時只針對菌體中的那部分進行提取，這樣可以大大減少萃取液中雜質(zhì)的含量，降低純化成本，提高生產(chǎn)效率。

3結論

本文從中國豆豉中分離出了一株具有高纖溶酶活和MK-7的菌株，經(jīng)菌體形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA分析，鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciensY-2)。隨后對該菌株合成MK-7進行了初步研究發(fā)現(xiàn)，該菌合成MK-7的最佳條件為：發(fā)酵溫度為37 ℃、裝液量為30 mL/250 mL、接種量為2%和搖培時間為3 h。此外，研究結果還指出，B.amyloliquefaciensY-2合成的MK-7主要存在于細胞內(nèi)。以上結果可為基于菌株Y-2選育高產(chǎn)MK-7菌株和實現(xiàn)MK-7的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.001

基金項目：江蘇省自然科學基金-青年基金項目(編號：BK20150149)。

作者簡介：徐建中(1984～)，男，博士，講師。E-mail：xujz126@126.com。

*通訊作者:張偉國(1963～)，男，博士，教授。

Identification and analysis of a menaquinone-7 (MK-7) producing strain

XU Jian-zhong， WANG Ying-yu， YAN Wei-liu， ZHANG Wei-guo

The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China

AbstractA high MK-7 producing strain was isolated from Chinese douchi. Moreover, the MK-7 synthesis conditions were investigated. The strain was classified into Bacillus amyloliquefaciens according to its morphology, physiological and biochemical features and 16S rDNA sequence. The results showed that the best MK-7 synthesis conditions of this strain were as follows: fermentation temperature 37 ℃, loading volume 30 mL/250 mL, inoculum size 2% and shaking culture time 3 h. In addition, MK-7 was mainly distributed in intracellular. The above-mentioned results provided a theoretical basis for constructing high MK-7 producing strains based on strain Y-2 and promoting MK-7 industrialization progress.

Key wordsChinese douche; menaquinone-7; Bacillus amyloliquefaciens; product distribution