尤　賀,　唐文竹,　孫玉梅

大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116034

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產(chǎn)生物表面活性劑的地衣芽孢桿菌種子培養(yǎng)條件研究

尤賀,唐文竹,孫玉梅*

大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116034

摘要：本文對產(chǎn)生物表面活性劑的油藏地衣芽孢桿菌種子培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。通過測定種子培養(yǎng)液中菌體濃度和發(fā)酵液的菌濃及表面張力，研究溫度、通氣量、接種齡、接種量對種子生長和發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響。確定了種子適宜培養(yǎng)條件為裝液量100 mL/250 mL，12層紗布封口，于50 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)14 h。以10%接種量接種發(fā)酵，發(fā)酵24 h的發(fā)酵液表面張力降至最低，為22.6 mN/m。在該條件下培養(yǎng)種子，可縮短種子培養(yǎng)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)提前接種發(fā)酵并高產(chǎn)生物表面活性劑。

關(guān)鍵詞：地衣芽孢桿菌； 生物表面活性劑； 種子培養(yǎng)； 表面張力

生物表面活性劑是由微生物發(fā)酵或酶催化合成的具有高表面活性的兩親性次級代謝產(chǎn)物[1]，具有很高的生物降解性、起泡性和選擇性，在極端環(huán)境條件下仍能保持活性，且毒性和刺激性較低。因此，在環(huán)境治理、石油、食品、農(nóng)藥、紡織等領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用，在一些領(lǐng)域已經(jīng)完全替代化學(xué)合成表面活性劑。但其應(yīng)用和推廣受到產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高等問題的限制[1,2]。

為了提高生物表面活性劑產(chǎn)量，目前國內(nèi)外研究大多對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，對種子培養(yǎng)條件研究較少。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的種子培養(yǎng)目的在于較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量健壯和代謝活性強(qiáng)的種子，為發(fā)酵合成產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)[3]。種子培養(yǎng)條件對獲得優(yōu)良種子至關(guān)重要，不僅影響種子生物量還影響其代謝產(chǎn)物合成能力。產(chǎn)鼠李糖脂的銅綠假單胞菌的種子培養(yǎng)優(yōu)化條件為，在pH 6～8、30 ℃培養(yǎng)，以5%接種量接種此條件培養(yǎng)的種子，可使發(fā)酵鼠李糖脂產(chǎn)量提升至13.024 g/L[4]。對BacillussubtilisSPB1的種子培養(yǎng)條件、接種齡、接種量進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后可使生物表面活性劑產(chǎn)量提高至3.3 g/L[5]。本文對產(chǎn)生物表面活性劑的地衣芽孢桿菌種子培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對發(fā)酵的接種齡和接種量進(jìn)行研究，以期獲得健壯種子，為微生物發(fā)酵生產(chǎn)提供條件。

1材料與方法

1.1菌株

菌株分離自遼河油田的原油，經(jīng)16s rDNA 鑒定為BacilluslicheniformisDGG-1-3-F，菌種用20%甘油保存于-80 ℃冰箱。

1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏 5，蛋白胨 10，NaCl 5，瓊脂 20，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏 5，蛋白胨 10，NaCl 5，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉10，KH2PO43.4，Na2HPO41.5，NaNO34.0，MgSO4·7H2O 0.2，酵母浸粉0.2，pH 7.0。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌種活化與培養(yǎng)

取在-80 ℃保存的地衣芽孢桿菌，接一環(huán)于斜面種子培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)24 h，于4 ℃保存?zhèn)溆?。取斜面菌種，接種于新的斜面種子培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)24 h，使其活化。取兩環(huán)活化的菌種，接種于種子培養(yǎng)基中，于設(shè)定的溫度和轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)一定時(shí)間，得種子液。在種子培養(yǎng)過程定期取樣測定菌體密度。

1.3.2發(fā)酵條件

將種子液以10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在裝液量20 mL/50 mL，14層紗布封口的三角瓶中于30 ℃、160 r/min的搖床發(fā)酵96 h。在發(fā)酵過程中定期取樣測定菌體濃度和表面張力。

1.3.3溫度和通氣量對種子生長和發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響

取20環(huán)活化的菌種，用20 mL生理鹽水制成均勻菌液，吸取2 mL菌液至裝液量100 mL/250 mL，14層紗布封口的三角瓶中，將三角瓶分別置于30 ℃、40 ℃、50 ℃搖床中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，定期取樣測定菌體濃度。分別取各培養(yǎng)溫度下的對數(shù)生長期末期的種子，以10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，定期取樣測定發(fā)酵液菌體濃度及表面張力。通過種子生長、發(fā)酵液菌體濃度及表面張力確定適宜種子培養(yǎng)溫度。在適宜溫度基礎(chǔ)上，按前述實(shí)驗(yàn)方法，將三角瓶分別置于140 r/min、160 r/min和180 r/min搖床中培養(yǎng)，其它條件不變，通過種子生長、發(fā)酵液菌體濃度及表面張力確定適宜種子培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速。在適宜溫度、轉(zhuǎn)速的基礎(chǔ)上，按前述實(shí)驗(yàn)方法，將種子培養(yǎng)所用三角瓶分別用12、14和16層紗布封口，其它條件不變，通過種子生長、發(fā)酵液菌體濃度及表面張力確定適宜種子培養(yǎng)封口紗布層數(shù)。

1.3.4接種齡和接種量對發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響

在適宜條件下培養(yǎng)種子，分別培養(yǎng)至對數(shù)生長期、對數(shù)生長期末期、穩(wěn)定期后分別以10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵條件同上。通過發(fā)酵液菌體濃度及表面張力，確定適宜接種齡。

將適宜條件下培養(yǎng)的種子培養(yǎng)至適宜接種齡，分別以5%、10%和15%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過發(fā)酵液菌體濃度及表面張力，確定適宜接種量。

1.3.5菌體濃度測定

采用濁度法[6]，于600 nm測定。

1.3.6表面張力測定

將發(fā)酵液于10 000 r/min離心20 min，得發(fā)酵上清液。在室溫下，采用吊環(huán)法[7]測定發(fā)酵上清液的表面張力。

所有的培養(yǎng)和測定均為三個(gè)平行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

2結(jié)果與討論

2.1溫度對種子生長和發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響

由圖1a可知，于50 ℃、40 ℃和30 ℃培養(yǎng)的種子分別在16 h、22 h和28 h達(dá)到對數(shù)生長期末期。取培養(yǎng)至該時(shí)期的種子接種發(fā)酵，結(jié)果見圖1b，隨種子培養(yǎng)溫度的升高，發(fā)酵過程中菌體生長速度和發(fā)酵液表面張力下降速度加快，接種50 ℃培養(yǎng)的種子發(fā)酵的菌體生長最快，表面張力降低最多，發(fā)酵24 h降至最低值24 mN/m，接種30 ℃培養(yǎng)的種子發(fā)酵的菌體生長最慢，表面張力降低最少，發(fā)酵48 h降至最低值28.25 mN/m。說明，溫度不僅影響種子生長，還影響其發(fā)酵過程中菌體生長和生物表面活性劑合成[8]。因此，取50 ℃為適宜種子培養(yǎng)溫度。

a：種子生長；b：發(fā)酵過程中菌濃及表面張力

2.2通氣量對種子生長和發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響

在三角瓶培養(yǎng)階段，搖床轉(zhuǎn)速和三角瓶封口的紗布層數(shù)均會(huì)影響三角瓶液體培養(yǎng)的通氣量[9]。

由圖2a可知，于180 r/min、160 r/min和140 r/min培養(yǎng)的種子分別在14 h、16 h和20 h達(dá)到對數(shù)生長期末期。取培養(yǎng)至該時(shí)期的種子接種發(fā)酵，結(jié)果見圖2b，隨種子培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速的升高，發(fā)酵過程中菌體生長速度加快，接種180 r/min培養(yǎng)的種子發(fā)酵的菌體生長最快，表面張力降低最多，發(fā)酵48 h降至最低值23.75 mN/m，接種140 r/min和160 r/min培養(yǎng)的種子發(fā)酵的表面張力相近，發(fā)酵72 h降至最低值26 mN/m和26.25 mN/m。因此，取180 r/min為適宜種子培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速。

a：種子生長；b：發(fā)酵過程中菌濃及表面張力

由圖3a可知，于16、14和12層紗布封口的三角瓶中培養(yǎng)的種子都在14 h達(dá)到對數(shù)生長期末期，說明封口三角瓶的紗布層數(shù)對種子生長快慢影響不大。取培養(yǎng)至該時(shí)期的種子接種發(fā)酵，結(jié)果見圖3b，隨封口三角瓶的紗布層數(shù)的增加，發(fā)酵過程中菌體生長速度和發(fā)酵液表面張力下降速度減慢，接種12層紗布封口的三角瓶所培養(yǎng)的種子發(fā)酵的菌體生長最快，表面張力降低最多，發(fā)酵24 h降至最低值22.75 mN/m。接種16層紗布封口的三角瓶所培養(yǎng)的種子發(fā)酵的菌體生長最慢，表面張力降低最少，發(fā)酵24 h降至最低值26.65 mN/m。因此，取12層為適宜種子培養(yǎng)封口紗布層數(shù)。由以上結(jié)果可知，通氣量不僅影響種子生長，還影響其發(fā)酵過程中菌體生長和生物表面活性劑合成，且通氣量多利于生物表面活性劑的合成[9]。在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，搖床轉(zhuǎn)速比紗布層數(shù)對種子生長的影響要大，但二者對發(fā)酵的影響差異不大。

a：種子生長；b：發(fā)酵過程中菌濃及表面張力

2.3接種齡對發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響

由圖4可知，接種培養(yǎng)14 h的種子發(fā)酵的菌體生長最快，表面張力降低最多，發(fā)酵24 h降至最低值22.7 mN/m。一般接種的種子培養(yǎng)時(shí)間以對數(shù)生長期末期即培養(yǎng)液中菌濃接近高峰時(shí)所需的時(shí)間較為適宜。 培養(yǎng)時(shí)間較短的種子接種后往往會(huì)出現(xiàn)前期生長緩慢，整個(gè)發(fā)酵周期延長，產(chǎn)物開始形成時(shí)間推遲。培養(yǎng)時(shí)間較長的種子雖然菌量較多但接種后會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降，菌體過早衰退[3]。因此，取14 h為適宜接種齡，這與彭新榜等人研究結(jié)果相同[10]。

圖4　接種齡對發(fā)酵生產(chǎn)的影響

2.4接種量對發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響

由圖5可知，接種量為10%時(shí)，發(fā)酵的菌體生長最快，表面張力降低最多，發(fā)酵24 h降至最低值22.6 mN/m。其次是接種量15%。接種量為5%時(shí)，發(fā)酵初期菌濃低，發(fā)酵液表面張力下降慢，第72 h時(shí)菌濃接近其它兩個(gè)接種量，表面張力降至最低的值也與其接近，說明接種量小只會(huì)推遲達(dá)到最大菌體量和表面張力降至最低值的時(shí)間。因此，取10%為適宜接種量，這與解舒涵等人研究結(jié)果相同[11]。

圖5　接種量對發(fā)酵生產(chǎn)的影響

3結(jié)論

本試驗(yàn)對地衣芽孢桿菌種子培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了種子適宜培養(yǎng)條件為裝液量100 mL/250 mL，12層紗布封口，于50 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)14 h。以10%接種量接種發(fā)酵，發(fā)酵24 h的發(fā)酵液表面張力降至最低，為22.6 mN/m。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，種子培養(yǎng)溫度對種子生長和發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響較大。本研究為縮短種子培養(yǎng)和發(fā)酵時(shí)間，提高BacilluslicheniformisDGG-1-3-F產(chǎn)生物表面活性劑產(chǎn)量奠定了一定的基礎(chǔ)。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.006

作者簡介：尤賀(1992～)，男，碩士研究生。 E-mail:716863212@qq.com。

*通訊作者：孫玉梅(1962～)，女，教授。

Cultivation conditions of inocula for Bacillus licheniformis producing biosurfactant

YOU He， TANG Wen-zhu， SUN Yu-mei

College of Biology Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China

AbstractBacillus licheniformis isolated from crude oil was used to produce biosurfactant. The cultivation condition of inocula was optimized in this research. By measuring the cell density in inoculum culture broth, the cell density and surface tension in fermenting broth, the effects of temperature, ventilation and time of inoculum cultivation and inoculation rate on cell growth and the surfactant production in fermentation were investigated. The results indicated that the inocula should be cultivated at 50 ℃, 180 r/min for 14 h in 100 mL/250 mL shaking flasks sealed with 12-layer gauze. And when the fermentation was conducted for 24 h with 10% of inoculation rate, the surface tension of cell-free fermenting broth lowered to the minimum 22.6 mN/m. Inocula cultivation under the optimal conditions could shorten the cultivation time of inocula and result in earlier biosurfactant production and higher yield in the fermentation.

Key wordsBacillus licheniformis; biosurfactant; inocula cultivation; surface tension

項(xiàng)目名稱：大連市科技局 (編號：2013B11NC078)。