彭　彬，　曹宏源，　潘　玲，　席貽龍

(安徽師范大學 生命科學學院，安徽 蕪湖　241000)

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鏡湖角突臂尾輪蟲種群增長參數(shù)的克隆多樣性

彭彬，曹宏源，潘玲，席貽龍

(安徽師范大學 生命科學學院，安徽 蕪湖241000)

摘要：以采自蕪湖市鏡湖水體中的11個角突臂尾輪蟲(Brachionus angularis)克隆為對象，在(25±1)℃，0.5×106、1.0×106和2.0×106個細胞/mL的斜生柵藻(Scenedemus obliquus)密度下，應用群體累積培養(yǎng)法研究了角突臂尾輪蟲種群增長參數(shù)的克隆多樣性.結果表明，輪蟲的種群增長率、最大種群密度、種群中的平均混交率和平均受精率與食物密度之間的關系具有較高的克隆多樣性，食物密度、克隆以及兩者間的交互作用對輪蟲種群增長率、最大種群密度、平均混交率和平均受精率均有極顯著性影響(P<0.01).研究角突臂尾輪蟲種群增長參數(shù)的克隆在所有的食物密度和克隆組合中，克隆2在2.0×106個細胞/mL食物密度下的種群增長率和最大種群密度均最高，克隆3在1.0×106個細胞/mL食物密度下平均混交率最高，克隆3和9在2.0×106個細胞/mL食物密度下的平均受精率最高.因此，在開展角突臂尾輪蟲的規(guī)模化培養(yǎng)時，擬首選克隆2和2.0×106個細胞/mL的斜生柵藻密度；而欲開展角突臂尾輪蟲休眠卵的批量生產(chǎn)，則擬選擇克隆3和1.0×106個細胞/mL的斜生柵藻密度.

關鍵詞：角突臂尾輪蟲；克??；食物密度；種群增長參數(shù)

輪蟲是魚類等水產(chǎn)經(jīng)濟動物幼苗的理想開口餌料，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應用始于20世紀60年代末.在使用輪蟲作為開口餌料時，人們必須關注輪蟲的大小、輪蟲在水體中的分布和密度、輪蟲的保障程度、輪蟲是否易于被消化和吸收以及輪蟲的營養(yǎng)質量等問題，其中，如何獲得大量的輪蟲以持續(xù)滿足水產(chǎn)經(jīng)濟動物苗種生產(chǎn)的需要始終是水產(chǎn)養(yǎng)殖研究人員和從業(yè)者關注的問題[1].此問題的解決涉及輪蟲種群增長速率的提高和種群密度高峰期的維持等方面.

影響特定種類的輪蟲種群增長速率的因素主要有食物種類和密度、溫度、水體pH值和輪蟲的品系或克隆等[2-6].在常規(guī)條件下開展輪蟲的規(guī)?；囵B(yǎng)時，篩選具有較高種群增長速率的輪蟲品系或克隆便成為研究工作的重點[2].角突臂尾輪蟲是淡水中常見的輪蟲種類之一，在水產(chǎn)養(yǎng)殖和環(huán)境監(jiān)測中具有重要的應用價值.作者已開展的試驗表明，與投喂奶粉相比，投喂該種輪蟲可顯著提高泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)的幼苗成活率.有關角突臂尾輪蟲的種群增長率等研究已有一些報道，胡好遠等[3,4]曾就食物密度對角突臂尾輪蟲種群增長的影響等進行專門的研究，但有關其不同克隆間種群增長速率等的差異性研究尚未見報道.本文以采自蕪湖市鏡湖中的11個角突臂尾輪蟲克隆為對象，在三種斜生柵藻密度下，應用群體累積培養(yǎng)法研究了角突臂尾輪蟲種群增長參數(shù)的克隆多樣性，旨在揭示各克隆角突臂尾輪蟲的種群增長速率等之間的差異及其與食物密度之間的關系，同時為該種輪蟲的規(guī)模化培養(yǎng)篩選適宜的克隆.

1材料與方法

1.1輪蟲的來源和培養(yǎng)

實驗所用角突臂尾輪蟲于2014年4月采自蕪湖市鏡湖.樣品采集后，顯微鏡下隨機挑取帶卵的非混交雌體于自然光照、(25±1)℃條件下進行克隆培養(yǎng)，培養(yǎng)液為新鮮配制的輪蟲培養(yǎng)液[7]，食物為HB-4培養(yǎng)基[8]培養(yǎng)的、處于指數(shù)增長期的斜生柵藻.

1.2種群增長實驗

實驗前，將每個輪蟲克隆分別置于自然光照、(25±1)℃以及0.5×106、1.0×106和2.0×106個細胞/mL等3個斜生柵藻密度下進行為期一周的預培養(yǎng).預培養(yǎng)時,以直徑為1cm、長度為12cm 的玻璃試管為容器,培養(yǎng)體積為5mL.預培養(yǎng)過程中,每天更換輪蟲培養(yǎng)液并投喂相應密度的藻類食物一次,同時通過去除一部分個體使得輪蟲種群始終處于指數(shù)增長期.

實驗開始時,從每個克隆中隨機挑取 200 個以上攜卵的非混交雌體置于試管中繼續(xù)培養(yǎng).4 h后,從各試管中挑取齡長在4h以內的幼體于玻璃杯中繼續(xù)培養(yǎng),待其產(chǎn)出第一枚非混交卵時接種至玻璃試管內開始實驗,接種密度為4個/mL,培養(yǎng)液體積為5mL.培養(yǎng)條件與預培養(yǎng)時相同.實驗過程中,每12h輕輕吹浮沉積于試管底部的藻類食物，每24h對培養(yǎng)液中輪蟲各類型雌體計數(shù)1次,并投喂餌料.待種群密度較大時,采用抽樣計數(shù),用玻璃微吸管將培養(yǎng)液輕輕攪勻后,從試管的3個不同部位于水體中部吸取(0.5-2)mL的培養(yǎng)物進行計數(shù).雌體類型的劃分和鑒定與席貽龍和黃祥飛相同[9].

1.3相關參數(shù)的定義與計算方法

輪蟲種群增長率的計算公式為r=(lnNt-lnN0)/t，式中：N0為起始輪蟲密度，即4個/mL；Nt為試驗進行到t天時的輪蟲種群密度；t為試驗天數(shù).參照Dumont等[10]的方法，從輪蟲種群指數(shù)增長期選取4-6個數(shù)據(jù)計算種群增長率并最終獲得每個重復的平均值.

最大種群密度：實驗過程中輪蟲種群密度的最大值.

混交雌體百分率：種群中的混交雌體數(shù)占總雌體數(shù)的百分比，本文使用的是試驗期間每日混交雌體百分率的平均值.

混交雌體受精率：種群中產(chǎn)休眠卵的混交雌體數(shù)占總混交雌體數(shù)的百分比，本文使用的是試驗期間每日混交雌體受精率的平均值.

1.4數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對上述數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析.對所得的各種群參數(shù)進行正態(tài)分布檢驗后，對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進行單因素和雙因素方差分析以揭示克隆和食物密度對輪蟲各種群參數(shù)的影響，應用SNK檢驗法對同一克隆下各食物密度間、同一食物密度下各克隆間有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的輪蟲各種群參數(shù)的均值作多重比較.

2結果與分析

2.1種群增長率

3個食物密度下，11個角突臂尾輪蟲克隆的種群數(shù)量動態(tài)如圖1所示.根據(jù)圖1所示的種群數(shù)量動態(tài)計算所得的種群增長率和最大種群密度列于表1和3.

0.5×106、1.0×106和2.0×106個細胞/mL食物密度下，克隆對輪蟲種群增長率都具有顯著性影響(P<0.05).0.5×106和1.0×106個細胞/mL食物密度下，克隆1和6的種群增長率均趨于最低，克隆2的種群增長率都趨于最大；2.0×106個細胞/mL食物密度下，克隆6的種群增長率最低，但克隆1、2和11的種群增長率最高(表1).

除克隆3、4、9和10的種群增長率均不受食物密度的顯著性影響外(P>0.05)，克隆1、2、5、6、7、8和11的種群增長率均受食物密度的極顯著性影響(P<0.05).其中，克隆1、2和5的種群增長率均在0.5×106和1.0×106個細胞/mL食物密度下無顯著性差異，但兩者均顯著低于2.0×106個細胞/mL食物密度下；克隆7和11的種群增長率均在0.5×106個細胞/mL食物密度下最低，在2.0×106個細胞/mL下最高；克隆6和8的種群增長率對升高的食物密度所作出的反應與其它克隆均不相同(表1).

表1　不同食物密度下11個角突臂尾輪蟲克隆的種群增長率(平均數(shù)±標準誤)

* 同行相同大寫字母表示食物密度間無顯著性差異，同列相同小寫字母表示克隆間無顯著性差異.下同.

時間Time(d)圖1　不同食物密度下11個角突臂尾輪蟲克隆的種群數(shù)量動態(tài)Fig.1　Population dynamics of eleven Brachionus angularis clones at different food levels

雙因素方差分析結果顯示，食物密度、克隆以及兩者間的交互作用對角突臂尾輪蟲種群增長率均有極顯著影響(P<0.01)(表2).在所有的食物密度和克隆組合中，克隆2在2.0×106個細胞/mL食物密度下的種群增長率最高.

表2　食物密度和克隆對角突臂尾輪蟲種群增長率、最大種群密度、平均混交率和平均受精率的影響(F值)

**P<0.01

2.2最大種群密度

0.5×106、1.0×106和2.0×106個細胞/mL食物密度下，克隆對輪蟲最大種群密度都具有極顯著性影響(P<0.01).0.5×106和2.0×106個細胞/mL食物密度下，克隆2的最大種群密度均趨于最高；1.0×106個細胞/mL食物密度下，克隆5、10和11的最大種群密度最高(表3).

所有克隆的最大種群密度均受食物密度的顯著性影響(P<0.05).克隆1、2、4、7、8和9的最大種群密度均在0.5×106和1.0×106個細胞/mL食物密度下無顯著性差異，但兩者均顯著低于2.0×106個細胞/mL食物密度下；克隆3、5和11的最大種群密度均在0.5×106個細胞/mL食物密度下最低，在2.0×106個細胞/mL下最高；克隆6的最大種群密度在1.0×106個細胞/mL食物密度下較高，在0.5×106和2.0×106個細胞/mL食物密度下較低(表3).

方差分析結果顯示，食物密度、克隆差異及其兩者間的交互作用對角突臂尾輪蟲最大種群密度均有極顯著影響(表2).在所有的食物密度和克隆組合中，克隆2在2.0×106個細胞/mL食物密度下的最大種群密度最高.

2.3平均混交率

0.5×106、1.0×106和2.0×106個細胞/mL食物密度下，克隆對輪蟲種群中的平均混交率都具有極顯著性影響(P<0.01).三個食物密度下，輪蟲種群中克隆2、3和9的平均混交率最高(表4).

表3　不同食物密度下11個角突臂尾輪蟲克隆的最大種群密度

表4　不同食物密度下11個角突臂尾輪蟲克隆的平均混交率(%)

除克隆1外，其它所有克隆的平均混交率均受食物密度的顯著性影響(P<0.05).克隆2、4、5、9和10的平均混交率均在0.5×106和2.0×106細胞/mL食物密度下無顯著性差異，但兩者均顯著低于1.0×106個細胞/mL食物密度下；克隆3的平均混交率在1.0×106個細胞/mL食物密度下高于0.5×106個細胞/mL食物密度下，但兩者均與2.0×106個細胞/mL食物密度下無顯著性差異；克隆6的平均混交率在2.0×106個細胞/mL食物密度下較高，在0.5×106和1.0×106個細胞/mL食物密度下較低；克隆7、8和11的平均混交率在0.5×106個細胞/mL食物密度下最低，在1.0×106個細胞/mL下最高(表4).

方差分析結果顯示，食物密度，克隆差異及其兩者間的交互作用對角突臂尾輪蟲平均混交率均有極顯著影響(表2).在所有的食物密度和克隆組合中，克隆3在1.0×106個細胞/mL食物密度下平均混交率最高.

2.4平均受精率

0.5×106和2.0×106個細胞/mL食物密度下，克隆對輪蟲種群中的平均受精率都具有極顯著性影響(P<0.01)；但1.0×106個細胞/mL食物密度下，克隆對輪蟲種群中的平均受精率無顯著性影響(P>0.05).0.5×106個細胞/mL食物密度下，克隆9的平均受精率最高；2.0×106個細胞/mL食物密度下，克隆3的平均受精率最高(表5).

所有克隆的平均受精率均受食物密度的顯著性影響(P<0.05).克隆1和10的平均受精率在0.5×106個細胞/mL食物密度下較低，在1.0×106和2.0×106個細胞/mL食物密度下較高；克隆2-8的平均受精率均在0.5×106和1.0×106個細胞/mL食物密度下無顯著性差異，但兩者均顯著低于2.0×106個細胞/mL食物密度下；克隆9的平均受精率在2.0×106個細胞/mL食物密度下高于1.0×106個細胞/mL食物密度下，但兩者均與0.5×106個細胞/mL食物密度下無顯著性差異；克隆11的平均受精率在2.0×106個細胞/mL食物密度下最高，在0.5×106個細胞/mL食物密度下最低(表5).

表5　不同食物密度下11個角突臂尾輪蟲克隆的平均受精率(%)

方差分析結果顯示，食物密度，克隆差異及其兩者間的交互作用對角突臂尾輪蟲平均受精率均有極顯著影響(表2).在所有的食物密度和克隆組合中，克隆3和9在2.0×106個細胞/mL食物密度下的平均受精率最高.

3討論

3.1食物密度和遺傳因素對輪蟲孤雌生殖速率的影響

已有研究結果顯示，食物密度對輪蟲種群增長率和最大種群密度的影響因輪蟲種類或品系的不同而異[3-6].25℃下，采自廣州的角突臂尾輪蟲種群增長率在8.25×106個細胞/mL的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)密度下最高[3]，褶皺臂尾輪蟲(B. plicatilis)種群增長率在20.0×106個細胞/mL的酵母密度下最高，而最大種群密度出現(xiàn)在10.0×106個細胞/mL的酵母密度下[5]；24℃下，萼花臂尾輪蟲種群增長率在1.0×106、2.0×106和4.0×106個細胞/mL的斜生柵藻密度間無顯著的差異[6].25℃下，采自廣州、蕪湖和穎上的角突臂尾輪蟲種群增長率分別在10.47×106、7.47×106和7.24×106個細胞/mL的蛋白核小球藻密度下達最大值[4].本研究結果顯示，食物密度對角突臂尾輪蟲種群增長率和最大種群密度的影響在輪蟲克隆間存在著差異，同一食物密度下角突臂尾輪蟲種群增長率和最大種群密度在輪蟲克隆間也存在著差異，此與Snell & Carrilo[2]、胡好遠等[4]和Ma等[11]有關不同地理品系褶皺臂尾輪蟲和角突臂尾輪蟲、不同地理種群的萼花臂尾輪蟲的研究結果均一致.

3.2食物密度和遺傳因素對輪蟲有性生殖幅度的影響

混交雌體的產(chǎn)生是輪蟲有性生殖的開始，受眾多的內源性和外源性因素的影響和制約.食物密度對輪蟲種群中的平均混交率和平均受精率的影響也因輪蟲種類或品系的不同而存在著差異[6,12,13].單個體培養(yǎng)條件下，萼花臂尾輪蟲在適宜的蛋白核小球藻密度(1.0-2.0×107個細胞/mL)下后代的混交率最低，高于或低于此密度后代混交率顯著提高[13]；群體培養(yǎng)狀態(tài)下，萼花臂尾輪蟲種群中的平均混交率在8.0×106個細胞/mL斜生柵藻密度下最低[12].24℃下，萼花臂尾輪蟲的平均混交率在1.0×106個細胞/mL食物密度下顯著高于2.0×106個細胞/mL食物密度下，而4.0×106個細胞/mL食物密度下的平均混交率與前兩者間均無顯著的差異[6].本研究結果顯示，食物密度對角突臂尾輪蟲種群中的平均混交率的影響在輪蟲克隆間存在著差異，同一食物密度下角突臂尾輪蟲種群中的平均混交率在輪蟲克隆間也存在著差異，此與Ma等[11]有關不同地理種群的萼花臂尾輪蟲的研究結果一致.

Snell & Carrilo[2]和Ma等[11]認為，不同地理品系的褶皺臂尾輪蟲和不同地理種群的萼花臂尾輪蟲種群增長率等參數(shù)間的差異主要是由各品系輪蟲遺傳上的差異造成的.本研究中，各克隆角突臂尾輪蟲間的遺傳差異如何有待進一步研究.

3.3輪蟲克隆間生殖差異研究的實踐意義

對輪蟲不同克隆間種群增長速率和有性生殖發(fā)生幅度的比較研究，有助于篩選具有較高種群增長速率和較高有性生殖幅度的輪蟲克隆，推動輪蟲的規(guī)?；囵B(yǎng)或其休眠卵的批量生產(chǎn)，促進輪蟲在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應用.就本研究而言，在所有的食物密度和克隆組合中，克隆2在2.0×106個細胞/mL食物密度下的種群增長率和最大種群密度均最高，克隆3在1.0×106cells/ml食物密度下平均混交率最高.因此，在開展角突臂尾輪蟲的規(guī)?；囵B(yǎng)時，擬首選克隆2和2.0×106個細胞/mL的斜生柵藻密度.而欲開展角突臂尾輪蟲休眠卵的批量生產(chǎn)，則擬選擇克隆3和1.0×106個細胞/mL的斜生柵藻密度.

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DOI：10.14182/J.cnki.1001-2443.2016.04.012

收稿日期：2015-11-15

基金項目：國家自然科學基金(31170395)；國家星火計劃重大項目(2013GA710001).

作者簡介：彭彬(1990-)，男，安徽蕪湖人，碩士研究生；通訊作者：席貽龍(1965-)，男，安徽肥東人，教授，博士.

中圖分類號：Q178.1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-2443(2016)04-0371-06

Clonal Diversity of Population Growth Parameter of Brachionus Angularis from Lake Jinghu

PENG Bin,CAO Hong-yuan,PAN Ling, XI Yi-long

(College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)

Abstract:By means of population accumulative culture and with Scenedemus obliquus as the rotifers’ food, the population growth parameters of eleven Brachionus angularis clones collected from Lake Jinghu were investigated at (25±1)℃ and three food levels (0.5×106, 1.0×106 and 2.0×106 cells/mL). The results showed that the relationships between population growth rate, maximal population density, mean mixis rate as well as mean fertilization rate and food level differed with clone. Population growth rate, maximal population density, mean mixis rate and mean fertilization rate were all affected very significantly by food density, clone and their interactions (P<0.01). Among all the combinations of food levels and clones, clone 2 cultured at 2.0×106 cells/mL of S. obliquus had the highest population growth rate and maximal population density, clone 3 cultured at 1.0×106 cells/mL of S. obliquus had the highest mean mixis rate, and clone 3 and 9 cultured at 2.0×106 cells/mL of S. obliquus had the highest mean fertilization rate. Clone 2 of B. angularis was the optimal for mass culture.

Key words:Brachionus angularis; clone; food level; population growth parameter

引用格式：彭彬，曹宏源，潘玲，等.鏡湖角突臂尾輪蟲種群增長參數(shù)的克隆多樣性[J].安徽師范大學學報：自然科學版，2016，39(4)：371-376.