周李學，李志敏，段　璋，李新建，齊振熙（.福建中醫(yī)藥大學骨傷學院，福建 福州 350；.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，福建 福州350）

·實驗研究·

補腎活血湯對激素性股骨頭缺血壞死骨材料力學的影響

周李學1，李志敏1，段璋1，李新建1，齊振熙2
（1.福建中醫(yī)藥大學骨傷學院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，福建 福州350122）

目的觀察補腎活血湯對激素性股骨頭缺血壞死（SANFH）骨材料力學的影響。方法臀肌注射醋酸潑尼松龍建立SANFH兔模型，HE染色，隨機分為治療組、模型組、空白組，治療組用補腎活血湯高劑量灌胃，空白組、模型組用等量生理鹽水灌胃，3組干預后6周、8周分別處死6只，取右側(cè)股骨頭進行材料力學指標檢測，觀察3組股骨頭彈性模量的變化。結(jié)果HE染色見空白組中骨小梁完整，排列規(guī)則；脂肪細胞較少；模型組軟骨缺損，骨髓腔內(nèi)填充大量的脂肪細胞，骨髓造血細胞減少，骨小梁稀疏。股骨頭彈性模量比較：空白組＞治療組＞模型組，模型組2個時段有差異?？展窍莞C率比較：空白組為（10.06±0.13）%，造模組為（29.68±1.23）%，二者有顯著性差異P＜0.01。結(jié)論補腎活血湯可改善骨材料力學性能，增加骨強度，有利于壞死骨組織的修復，可用于防治SANFH。

激素性股骨頭缺血壞死；補腎活血湯；彈性模量

隨著生物力學的迅速發(fā)展，其分支骨生物力學對股骨頭壞死 （avascular necrosis of femoral head，ANFH）研究的影響越來越大，也越來越多的被應用到相關研究中。骨生物力學是專門研究骨組織在外力作用下的力學特征、骨組織結(jié)構(gòu)的力學效應及其在受力后的生物學效應，也是對骨質(zhì)量進行評定的一種可靠方法［1］。中醫(yī)藥具有簡、便、廉、驗的優(yōu)點，對于股骨頭壞死有確切療效［2］。本實驗通過檢測股骨頭彈性模量（elastic modulus，EM），了解骨的材料力學性能，探討補腎活血湯對激素性股骨頭缺血壞死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）骨材料力學的影響和發(fā)病機理。

1　實驗材料

1.1實驗動物健康成年6月齡普通級新西蘭大白兔104只，體質(zhì)量（2.5±0.3）kg，雌雄各半，上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場提供，許可證號：SCXK（滬）：2012-0011。在福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心普通級實驗室飼養(yǎng)及造模，合格證編號：SYXK（閩）：2014-0006。

1.2實驗試劑及儀器補腎活血湯處方：熟地黃9 g，杜仲3 g，枸杞子3 g，補骨脂9 g，菟絲子10 g，當歸尾3 g，沒藥3 g，山茱萸3 g，紅花1.5 g，獨活3 g，肉蓯蓉3 g（酒制）。福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂提供，福建省中醫(yī)藥研究院中藥實驗室將藥物濃縮成含生藥濃度為1 g/mL的制劑，密封，4℃保存?zhèn)溆?。醋酸潑尼松龍注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司）；注射用青霉素鈉（中諾藥業(yè)石家莊有限公司）；注射用硫酸鏈霉素（深圳華藥南方制藥廠）；滅菌注射用水（福州海王福藥制藥有限公司）；氯化鈉注射液（山東圣魯制藥有限公司）；烏拉坦（國藥集團化學試劑有限公司）。青霉素鈉和硫酸鏈霉素于給藥當日用滅菌注射用水稀釋配制。

1.3實驗儀器AG-IC 20kN電子萬能材料試驗機 （島津儀器蘇州有限公司）；BH3-MJL型光學顯微鏡（日本Olympus株式會社）；RM2135切片機（德國leica公司）。

2　實驗方法

2.1分組、造模單籠單只飼養(yǎng)，自由飲水，適應性飼養(yǎng)1周。用隨機數(shù)字表法分為空白組26只，激素造模組78只，2組動物進行體質(zhì)量及性別比較，差異不顯著，無統(tǒng)計學意義。

造模造模組：采用賀氏造模法造模，醋酸潑尼松龍7.5 mg/kg。空白組：右臀肌注射等量的生理鹽水。2組右臀肌注射青霉素鈉8萬U/只，左側(cè)注射硫酸鏈霉素10萬U/只，1周2次。6周后，空白組處死2只，造模組處死2只，HE染色觀察，證明造模成功。造模過程中死亡23只，按隨機數(shù)字表法將造模組分為模型組27只，治療組26只。

2.2灌胃給藥在前期實驗［3］基礎上，治療組按補腎活血湯高劑量灌胃。造模成功后，按“人與兔子公斤體重為單位”進行劑量換算，治療組每天的用藥量是人的6倍，灌胃含生藥量5.05 g/（kg/d），每日早晚灌胃1次。空白組和模型組按相同頻次給予生理鹽水5.05 m l/（kg/d）灌胃。

2.3取材給藥后6周、8周，3組各處死6只，20%烏拉坦按8 m L/kg體質(zhì)量腹腔麻醉后，剪開髂骨處皮膚，于后肢極度內(nèi)旋位，在髂骨下緣沿著股骨大粗隆做一半圓形切口，切開關節(jié)囊，離斷圓韌帶，沿股骨頭頸連接處剪斷，取出右側(cè)股骨頭，在冰上剔除肌肉和韌帶等組織后，用4℃預冷的生理鹽水洗凈血液和兔毛，4℃生理鹽水浸沒股骨頭，保存于-20℃?zhèn)溆茫?0 d內(nèi)完成檢測。

2.4指標檢測

2.4.1HE染色9周脫鈣至刀片切、針灸針扎標本無阻力。股骨頭沿冠狀面切成3份，取中間帶圓韌帶的1份石蠟包埋，5～6μm切片，蘇木素、0.5%伊紅液染色，封片，顯微鏡觀察骨組織的病理改變，采集圖片。

2.4.2材料力學檢測-20℃取出標本，室溫解凍4 h后浸在生理鹽水中保持濕潤。檢查標本，修剪殘余股骨頸和韌帶等組織，使股骨頭下盡量不帶股骨頸。在電子萬能材料試驗機上，使用平頂加載頭，以股骨頸為底面，沿圓韌帶外上方施加壓力。設置：標定載荷2 kN，加載速度1 mm/min，標本編號后依次進行壓縮試驗，在得到第1個高峰后手動停止，記錄并保存載荷-位移曲線，計算彈性模量值。壓縮后的股骨頭，復浸在生理鹽水中，置-20℃保存。

2.5統(tǒng)計學處理用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用χ2檢驗，計量資料用±s表示，符合正態(tài)分布的多組間比較用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的用秩和檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3　結(jié)果

3.1模型鑒定結(jié)果

3.1.1股骨頭大體觀察檢測造模結(jié)果和中藥干預后6、8周取材發(fā)現(xiàn)：模型組股骨頸較脆，咬骨剪很容易剪斷；空白組股骨頸質(zhì)地堅硬，需要較大力氣才能剪斷；補腎活血湯組質(zhì)地及所用力度居于二者之間。從外觀看，空白組和治療組股骨頭軟骨面較白、較光滑；模型組股骨頭顏色略深，光澤度低，沒有見到明顯的軟骨磨損、缺損或剝脫，在圓韌帶外上方，見一深藍色圓形區(qū)域。

3.1.2光鏡觀察空白組：軟骨細胞數(shù)量正常，軟骨較厚；骨小梁完整，排列規(guī)則，形態(tài)正常；空骨陷窩較少；骨髓造血細胞豐富，脂肪細胞較少，見圖1。模型組：鏡下見軟骨細胞減少甚至消失、軟骨缺損；骨髓壞死現(xiàn)象，骨髓腔內(nèi)填充大量的脂肪細胞，脂肪細胞增大或互相融合成大泡；骨髓造血細胞減少，部分造血細胞核碎裂、核溶解，部分骨細胞固縮或消失，骨陷窩空虛；骨小梁變細、稀疏、連續(xù)性中斷、散亂，部分骨小梁出現(xiàn)壞死，見圖2。

3.1.3空骨陷窩率空白組空骨陷窩率為（10.06 ±0.13）%，造模組為（29.68±1.23）%，二者有顯著性差異P＜0.01，見表1。

3.2彈性模量比較6周、8周趨勢：空白組＞治療組＞模型組，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。6周和8周比較，模型組有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。6周時，空白組與模型組比較，有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）；模型組與治療組比較，P＜0.05。8周時，空白組與模型組比較，P＜0.05；模型組與治療組比較，P＜0.01。3組6周、8周彈性模量比較，見表2。

表1　空白組與造模組空骨陷窩率比較（±s）

表1　空白組與造模組空骨陷窩率比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.01。

組別空白組模型組空骨陷窩率/% 10.06±0.13 29.68±1.231）n 4 4視野/個10 10

4　討論

SANFH兔模型造模成功與否，組織形態(tài)學觀察是最直觀，也是最關鍵的判定標準。股骨頭組織形態(tài)學可直接用來檢測骨組織的病理和形態(tài)變化，這種評判標準也被廣大學者所接受。本實驗采用賀氏經(jīng)典造模法，大劑量激素使用后，引起股骨頭骨細胞、成骨細胞等骨組織死亡，骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨細胞活性被抑制，破骨細胞活性增強，壞死骨細胞增多，壞死骨吸收小于新骨生成，空骨陷窩率增高。孟東方等［4］認為空骨陷窩率與股骨頭內(nèi)部骨陷窩數(shù)及空骨陷窩數(shù)密切相關，一般正常的股骨頭空骨陷窩率小于13%，與本實驗空白組結(jié)果一致，造模組與空白組比較差異顯著（P＜0.01），提示實驗造模成功。

雖然現(xiàn)代醫(yī)學對SANFH的發(fā)病機理尚未達成共識，但骨質(zhì)疏松在引起SANFH方面的重要性被越來越多的人所接受。金慶平［5］認為長期應用激素最突出的副作用就是引起骨質(zhì)疏松和骨壞死。Quattrini c等［6］認為骨質(zhì)疏松所致的骨塌陷在SANFH的發(fā)病、發(fā)展中是重要的因素，導致發(fā)生病理性骨折的危險增大。本實驗造模后，兔體質(zhì)量下降、骨質(zhì)變脆，機械應力在此基礎上使軟骨下骨小梁發(fā)生微骨折等細微損傷積累，這使其對抗機械應力的能力下降，出現(xiàn)塌陷，進一步壓迫骨髓基質(zhì)細胞和微血管，最終發(fā)生SANFH。模型組松質(zhì)骨骨小梁變細，數(shù)量減少，骨皮質(zhì)多孔，變薄，均為骨質(zhì)疏松癥骨微結(jié)構(gòu)破壞的表現(xiàn)［7］，與本實驗光鏡所見一致。在骨質(zhì)疏松狀態(tài)下，骨結(jié)構(gòu)發(fā)生了類似的明顯改變，反映骨質(zhì)疏松癥敏感指標的骨承載能力和生物力學性能降低［8］。劉衍志等［9］發(fā)現(xiàn)隨著地塞米松劑量增加，骨生物力學性能下降，骨質(zhì)量降低。由于動物實驗的局限性，測量股骨頭的骨質(zhì)量比骨密度方便［10］，且骨質(zhì)量較骨密度更能代表骨骼的生物力學特性。本實驗所測彈性模量屬于骨的材料力學參數(shù)范疇，是評估材料力學特性最穩(wěn)定的指標，體現(xiàn)材料的綜合生物力學性能，表示材料在彈性變形階段的內(nèi)在硬度。長期使用GCs，無論劑量高低，激素組較正常組骨質(zhì)量下降，材料力學參數(shù)顯著降低，骨力學性能下降［11］。通過比較3組的彈性模量值，可以較為直觀的描述骨骼受力后的狀態(tài)與差異。與正常組相比，模型組的彈性模量值隨時間延長不斷下降，并無自愈傾向，表明短時間大劑量激素沖擊造成SANFH后，激素對骨髓間充質(zhì)干細胞的影響持續(xù)存在，促進破骨細胞生成，抑制成骨細胞活性，骨吸收能力提高，骨材料內(nèi)在硬度下降，組織抵抗變形的能力變小，產(chǎn)生一定應變所需的力下降，彈性模量降低。本實驗治療組所用的補腎活血湯，其立論和組方依據(jù)已有文章發(fā)表。補腎活血湯對抗了GCs對成骨細胞的抑制作用，重新調(diào)節(jié)骨的改建、生長和吸收，使骨吸收小于骨形成，使骨量逐漸增加，微骨折有一定的恢復，股骨頭的硬度增強。表現(xiàn)為治療組彈性模量高于模型組，且隨著干預時間延長不斷增高，治療組和模型組的差異也越來越大。8周時，治療組的彈性模量還低于空白組6周時的水平，表明中藥干預有一定作用，這可能是干預時間不夠，或者是壞死后雖有修復但未達到復原水平。

本實驗表明補腎活血湯可有效防治SANFH，其機制可能為調(diào)節(jié)破骨細胞與成骨細胞的失衡比例，促進骨小梁和壞死骨組織修復，增加骨強度，改善骨質(zhì)疏松狀態(tài)和骨材料力學指標，防止股骨頭變形。

表2　6周、8周彈性模量比較（±s）

表2　6周、8周彈性模量比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.01。

組別治療組模型組空白組時間/周n　6 6 6 6 8 173.7631±35.11541）2）48.9566±11.42231）220.7514±70.5051 143.5294±27.72961）73.1999±9.91591）185.9057±48.0993

5　問題與展望

髖關節(jié)為人體負重關節(jié)，股骨頭是整個股骨受到剪切應力與壓應力的密集區(qū)。目前為止，其他學者的研究，大多是利用取材工具對股骨頭劃分區(qū)域后進行分割，然后定點觀察，以明確具體的病變部位。但股骨頭大小不一，損傷位置不同，人為的劃分存在主觀上的偏見和分割取件偏差以及暴力損傷標本等不足。Wolff等［12］通過定性、定量研究證實骨小梁走向是沿著主應力的方向，承受的主要為壓力。本實驗取材是通過類似于頭下型股骨頸骨折方式取下標本，進行標本修切后，統(tǒng)一將圓韌帶朝向外上方位置安放，確保試驗機加載壓頭沿著圓韌帶外上方施壓，使壓力方向與股骨頭內(nèi)骨小梁的走行相平行，模擬股骨頭在體承重受力狀態(tài)，對整個股骨頭進行壓縮實驗，分析觀察整個股骨頭受力后的變化和骨強度的差異。

由于缺血性壞死的股骨頭軟骨下骨和松質(zhì)骨的壓縮強度和平均彈性模量存在差異［13］，骨和軟骨可產(chǎn)生滯后、蠕變和松弛現(xiàn)象［14］，軟骨可承受大于松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的剪切載荷，在一定程度上維持股骨頭外形［15］，因此本實驗中未分離軟骨、松質(zhì)骨，對實驗結(jié)果可能存在一定的影響。在后續(xù)的研究中，我們將對3組骨組織的主要成分含量進行檢測、分析，以明晰組間及不同時間段的差異，并對主要成分含量和生物力學進行對比，探索二者間是否具有某種關聯(lián)，為闡明SANFH骨質(zhì)疏松學說的發(fā)病機制以及補腎活血湯的干預機理，提供更有力的實驗支撐。

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R285.5

A

1000-338X（2016）01-0026-04

2015-12-24

國家自然科學科學基金資助課題（81473705）

周李學（1990—），男，醫(yī)學碩士，主要從事骨缺血壞死疾病的基礎與臨床研究。

齊振熙（1957—），男，教授。E-mail：zxqi@fjtcm.edu.cn