李亞敏　劉高山　周為民　趙彥杰　李玉川　沈軍　譚文杰

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所應(yīng)急技術(shù)中心(李亞敏、劉高山、周為民、趙彥杰、譚文杰)； 201102上海，復(fù)旦大學(xué)附屬兒童醫(yī)院(李玉川、沈軍)

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上海市重癥急性呼吸道感染兒童中可檢出多種型別的人腺病毒

李亞敏劉高山周為民趙彥杰李玉川沈軍譚文杰

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所應(yīng)急技術(shù)中心(李亞敏、劉高山、周為民、趙彥杰、譚文杰)； 201102上海，復(fù)旦大學(xué)附屬兒童醫(yī)院(李玉川、沈軍)

李亞敏、劉高山為共同第一作者

【摘要】目的了解上海市重癥急性呼吸道感染(SARI)兒童中人腺病毒(HAdV)的感染情況及其分型特征。方法2013年6月至2014年3月從上海復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院收集441份重癥急性呼吸道感染患兒鼻咽抽吸物(NPAs)。采用巢式PCR的方法進(jìn)行人腺病毒的檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行分型分析及基本流行病學(xué)特征分析。結(jié)果人腺病毒共檢出51例(11.6%，95%CI 8.6%～14.6%)陽(yáng)性，以0.5～1歲之間的患兒感染率較高，分型分析發(fā)現(xiàn)感染者中B組所占比例最高，共33例(64.7%)，其中HAdV-3共17例(33.3%)，HAdV-7共檢出16例(31.4%)；其次為C組共14例(27.5%)；HAdV-D (HAdV-8)與HAdV-E(HAdV-4)各1例；HAdV-F(HAdV-41)檢出2例。結(jié)論人腺病毒在上海市重癥急性呼吸道感染患兒中有較高的感染率，存在多種基因型且以HAdV-B中的HAdV-3、7型感染最為常見(jiàn)。

【主題詞】重癥急性呼吸道感染；兒童；人腺病毒；分型檢測(cè)

Fund programs: State Megaproject for Infectious Disease Research of China(2013ZX10004601，2013ZX10004-101)

人腺病毒(HAdV)是美國(guó)學(xué)者Rowe及其同事于1953年從人體的腺樣組織中分離出來(lái)[1]，該病毒屬于腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳動(dòng)物腺病毒屬(Mastadenovirus)，是無(wú)包膜的單股雙鏈線(xiàn)性DNA病毒，包含HAdV-A到HAdV-G共7個(gè)亞屬 69個(gè)基因型[2]。其中HAdV-1～ HAdV-52是根據(jù)血清中和試驗(yàn)確定的血清型[3,4]，HAdV-53～HAdV-69是根據(jù)全基因序列生物信息學(xué)分析確定的基因型[2,5]。

HAdV感染可引起多種疾病包括肺炎、支氣管炎、膀胱炎、眼結(jié)膜炎、胃腸道疾病及腦炎等[2,6]，與呼吸道感染相關(guān)的主要是HAdV-B、HAdV-C及HAdV-D亞屬，在嬰幼兒中HAdV感染可引起嚴(yán)重的甚至致命的肺炎或支氣管炎[7]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有諸多關(guān)于不同型別HAdV感染與爆發(fā)的報(bào)道，但上海市重癥急性呼吸道感染患兒中HAdV感染的病原學(xué)資料尚缺乏，為明確該地區(qū)該特殊人群中HAdV的感染特點(diǎn)，我們展開(kāi)此項(xiàng)研究，并報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1檢測(cè)樣品2013年6月至2014年3月從上海復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院收集441份重癥急性呼吸道感染患兒(使用WHO兒童疾病管理規(guī)劃的肺炎和重癥肺炎的定義[8]，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、呼吸短促或困難、咽喉痛及其他呼吸道感染癥狀)的鼻咽抽吸物。每例患兒收集約1 ml呼吸道樣品，4℃存放不超過(guò)48 h，盡快運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，每份樣品每200 μl分裝一管，存于-70℃。

1.2核酸提取與病毒檢測(cè)使用QIAamp MinElute Virus Spin Kit(QIAGEN，Germany)進(jìn)行病毒全基因提取，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，最終溶于80 μl洗脫緩沖液。選取部分六鄰體(hexon)基因作為基因分型區(qū)，使用巣式PCR的方法對(duì)HAdV進(jìn)行分型檢測(cè)與基因多態(tài)性分析[9-11]。反應(yīng)體系25 μl，1.25U FastStart Taq DNA Polymerase，10×PCR Buffer，2mmol/L MgCl2(Roche Diagnostic Systems Inc., Mannheim, Germany)，200 μmol/L dNTPs(日本，TaKaRa公司)，0.5 μmol/L引物(大連寶生物工程有限公司合成)，5 μl基因組提取液(第一輪)或2 μl的第一輪PCR產(chǎn)物(第二輪)。反應(yīng)條件同參考文獻(xiàn)[9,10]。第一輪PCR產(chǎn)物大小為1 004 bp，第二輪為956 bp。

1.3分型分析對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性的內(nèi)側(cè)PCR產(chǎn)物使用QIAquick? Gel Extraction Kit(QIAGEN，Germany)進(jìn)行切膠回收，按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行回收純化，回收產(chǎn)物由上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。應(yīng)用Sequin向基因庫(kù)提交序列(序列號(hào)為：KR025751～ KR025768，KR025770～ KR025782，KR025784～ KR025788，KR025790～ KR025804)，使用Clustal X軟件將結(jié)果與GenBank上公布的與呼吸道感染相關(guān)的HAdV序列進(jìn)行比對(duì)，經(jīng)Bioedit軟件裁齊序列后，使用MEGA 5.0軟件進(jìn)行進(jìn)化分型分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析系統(tǒng)SAS9.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，基本的流行病學(xué)特征使用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1患兒基本特征441例SARI患兒中男性281例(63.7%)，女性160例(36.3%)，男女比為1.8∶1。中位年齡為1Y(0.3M～14Y)，按年齡大小將患兒分為(≤6M、7M～≤1Y、2～≤5Y、>5Y)四組，各組分別有139人、125人、120人及57人。

2.2流行病學(xué)特征共檢出51例HAdV感染者，陽(yáng)性檢出率為11.6%(51/441，95%CI8.6%～14.6%)，男性患兒檢出率為12.5%(35/281)，女性患兒檢出率為10.0%(16/160)，不同性別患兒HAdV的檢出情況差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。年齡≤6M組感染者8例，陽(yáng)性率為5.8%(8/139)；7M～≤1Y組陽(yáng)性率為15.2%(19/125)；2～≤5Y組陽(yáng)性率為16.7% (20/120)；>5Y組陽(yáng)性率為7.0%(4/57)，以6M～5Y患兒陽(yáng)性率較高(P<0.05)。除夏季外其余三個(gè)季節(jié)HadV均有較高檢出率，尤以冬春季檢出率較高，除12月份外各個(gè)月份均有檢出，且各個(gè)月份陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(結(jié)果未示)。

2.3分型分布特征根據(jù)感染HAdV陽(yáng)性樣本靶序列與各型別參考株核苷酸序列在進(jìn)化樹(shù)中的距離(圖1)，確定所感染HAdV所屬型別(表1)。

2.4臨床表現(xiàn)51例HAdV感染者中有48例診斷為肺炎，2例診斷為上呼吸道感染，1例為支氣管炎?；純褐饕憩F(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、喘息偶有腹瀉癥狀，且這些癥狀在感染者與非感染者中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

HAdV-A～ HAdV-G七個(gè)亞屬中，與急性呼吸道感染相關(guān)主要是HAdV-B(HAdV-3、-7、-11、-14及-21)與HAdV-E(HAdV-4)[12-15]，對(duì)HAdV的快速分型檢測(cè)有助于指導(dǎo)應(yīng)急反應(yīng)，并有助于指導(dǎo)治療。不同地區(qū)急性呼吸道感染患兒中HAdV的檢出率不盡相同[16-20]，本研究SARI患兒中HAdV感染率為11.6%，與相關(guān)研究的結(jié)果一致，且HAdV的感染在季節(jié)分布上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與相關(guān)報(bào)道一致[21]。

圖1　根據(jù)HAdV部分六鄰體基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(前綴“S”代表來(lái)自上海的樣品.□，HAdV-A參考株； ●， HAdV-B參考株；■，HAdV-C參考株；▲， HAdV-D參考株；△，HAdV-E參考株； ◆，HAdV-F參考株)Fig.1　Phylogenetic analysis of HAdV based on the partial hexon gene.(Prefix-S:samples from Shanghai; □，sequences of reference strains of HAdV-A；●，sequences of reference strains of HAdV-B；■，sequences of reference strains of HAdV-C；▲，sequences of reference strains of HAdV-D；△，sequences of reference strains of HAdV-E；◆，sequences of reference strains of HAdV-F)

分組Group型別Type陽(yáng)性數(shù)Positive陽(yáng)性比率Ratioofpositive(%)B(N=33)HAdV-31733.3HAdV-71631.4C(N=14)HAdV-123.9HAdV-247.8HAdV-547.8HAdV-612.0HAdV-2/623.9未定型untyped12.0D(N=1)HAdV-812.0E(N=1)HAdV-412.0F(N=2)HAdV-4123.9

本研究發(fā)現(xiàn)上海市SARI患兒中HAdV感染以HAdV-B組為主，主要是HAdV-3與HAdV-7(占64.7%)，其次為HAdV-C組(14/51，占27.45%)，與北京、廣州等地的研究結(jié)果較一致[22-23]，但與同屬華東地區(qū)的浙江溫嶺的流行株分布(以HAdVC組1，2，5型為主)不同[11,22]，可能是研究時(shí)間、地區(qū)、樣品形式或患兒疾病狀態(tài)不同所致。另外，本研究發(fā)現(xiàn)在HAdV-C中，有一例未定型，進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)其不屬于HAdV-C中的任何一個(gè)型別而獨(dú)立存在，很可能是HAdV-C中的新型別，不過(guò)，由于本研究中我們只針對(duì)部分六鄰體基因進(jìn)行分型檢測(cè)，根據(jù)部分片段來(lái)確定新型別說(shuō)服力尚顯不足，有待于對(duì)該病毒全基因進(jìn)行擴(kuò)增，從全基因水平進(jìn)行進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析來(lái)確定其準(zhǔn)確的型別。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)上海市重癥急性呼吸道感染患兒中HAdV存在較高的檢出率(11.6%)，存在多種基因型。要明確該地區(qū)的流行株特征及進(jìn)化規(guī)律還有待于長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)地針對(duì)更大范圍人群進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。

4參考文獻(xiàn)

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通信作者：譚文杰，Email：tanwj28@163.com；沈軍, Email：echoshen11@163.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.003

基金項(xiàng)目：傳染病防治重大專(zhuān)項(xiàng)(2013ZX10004601，2013ZX10004-101)

(收稿日期：2015-12-31)

Prevalence of multiple types of human adenovirus infection among children with severe acute respiratory infection in Shanghai

LiYamin，LiuGaoshan，ZhouWeimin，ZhaoYanjie，LiYuchuan，ShenJun，TanWenjie

KeyLaboratoryofMedicalVirology，MinistryofHealth；NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention，ChinaCDC，Beijing102206，China(LiYM,LiuGS,ZhouWM,ZhaoYJ,TanWJ);ShanghaiPediatricsHospitalAffiliatedFudanUniversity,Shanghai201102,China(LiYC,ShenJ)LiYaminandLiuGaoshanarethefirstauthorswhocontributedeaquallytothearticleCorrespondingauthor:TanWenjie，Email：Tanwj28@163.com；ShenJun，Email：echoshen11@163.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the typing profiles of human adenovirus infection among children with severe acute respiratory infection(SARI) in Shanghai. MethodsA total of 441 nasopharyngeal aspirates (NPAs) were collected from hospitalized children with SARI in Shanghai Pediatrics Hospital Affiliated Fudan University from June 2013 to March 2014. Human adenovirus was detected by nested PCR followed molecular typing by sequencing. Then the phylogenetic and epidemiological analysis was conducted. ResultsFrom 441 hospitalized children with SARI, 51 of samples (11.6%, 95%CI: 8.6%～14.6%) were detected as HAdV infection. Most of the SARI children with HAdV infection were distributed between 0.5 to 5 years old. Typing data shown that HAdV-B (17 of HAdV-3, 16 of HAdV-7) was most dominant as 64.7% (33/51),followed by HAdV-C as 27.5% (14/51); either HAdV-D (HAdV-8) or HAdV-E (HAdV-4) contained only one case, and HAdV-F (HAdV-41) found in two cases. ConclusionMultiple species(B-F)of HAdVs were circulated among children with SARI in Shanghai, and HAdV-B (HAdV-3, HAdV-7) was the most predominant species of circulation.

【Key words】Severe acute respiratory infection； Children；Human adenovirus；Typing detection