劉敏婕，劉朋飛，趙　雷

(1.暨南大學第二臨床醫(yī)學院·深圳市人民醫(yī)院 手術室，廣東 深圳518020；2.吉林大學藥學院 再生醫(yī)學系，吉林 長春130021；3.暨南大學第二臨床醫(yī)學院·深圳市人民醫(yī)院 麻醉科，廣東 深圳518020)

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麝香酮對人源骨髓間充質干細胞成骨分化的促進作用研究

劉敏婕1，劉朋飛2*，趙雷3*

(1.暨南大學第二臨床醫(yī)學院·深圳市人民醫(yī)院 手術室，廣東 深圳518020；2.吉林大學藥學院 再生醫(yī)學系，吉林 長春130021；3.暨南大學第二臨床醫(yī)學院·深圳市人民醫(yī)院 麻醉科，廣東 深圳518020)

摘要：目的分析麝香酮對人源骨髓間充質干細胞成骨分化的促進作用，明確骨髓間充質干細胞聯合麝香酮在骨損傷治療方面的應用優(yōu)勢。方法通過密度梯度離心法，從健康志愿者骨髓中分離間充質干細胞，并采用CCK-8檢測法以及流式細胞術對骨髓間充質干細胞的增殖能力和表面特異標記進行鑒定，進一步通過實時定量PCR，檢測麝香酮處理后的細胞中成骨基因的表達變化，通過堿性磷酸酶染色，評價麝香酮對人源骨髓間充質干細胞成骨分化的促進作用。結果人源骨髓間充質干細胞可在體外正常增殖，同時，骨髓間充質干細胞表面CD44、CD73、CD90的表達均呈陽性，而CD34的表達為陰性，符合正常間充質干細胞的表型，實時定量PCR結果表明，麝香酮處理后，骨髓間充質干細胞中的成骨相關基因ALP、Collagen I、Runx2、Osterix均有一定的上調，而且，在成骨分化過程中，麝香酮也會使細胞堿性磷酸酶染色的程度加深。結論麝香酮對人源骨髓間充質干細胞的成骨分化具有一定的促進作用，骨髓間充質干細胞聯合麝香酮的治療模式，在骨損傷治療方面具有一定的應用優(yōu)勢。

關鍵詞：骨髓間充質干細胞；麝香酮；成骨分化

(ChinJLabDiagn,2016,20:1049)

麝香酮，學名為3-甲基環(huán)十五烷酮，是中藥麝香的主要香味成分，具有消腫止痛、通經活絡等作用，該藥物小劑量對中樞神經有興奮作用，而大劑量則有抑制作用。目前，麝香酮在臨床上主要用于治療冠心病心絞痛、血管性頭痛等。近年來，麝香酮在國內外均已合成生產，人工合成品的藥理作用與天然麝香酮的作用相似。早在1990年，Ford等[1]首次證實麝香酮與傳統(tǒng)藿香相比，在毒性作用方面有著顯著的改善，以75 mg/kg的劑量，連續(xù)給藥90天，動物臟器組織未見明顯病理學變化。近些年來，關于麝香酮的應用范圍有了諸多方面的研究，Wei等[2]研究表明麝香酮可以通過抑制Fas信號通路，從而在一定程度上起到神經保護作用，對中風具有一定的治療效果；Wu等[3]的實驗研究表明：麝香酮可以通過移植氧化應激反應和抑制細胞凋亡的途徑，改善缺血再灌注過程中心肌細胞的損傷；同時，Sun等[4]的研究也證明：麝香酮可以通過移植細胞內鈣超載和維持線粒體功能，從而實現其抗凋亡的作用。

近年來，隨著干細胞技術的發(fā)展，細胞治療模式已逐漸受到研究人員的關注，特別是骨髓間充質干細胞(Bone marrow derived Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)，基于其在體外培養(yǎng)、自體移植等多方面的優(yōu)勢，在多種疾病的治療方面均有著重要的應用前景[5-10]。在麝香酮對BMSCs的影響方面，國內外也有了一定的初步研究。肖慶忠等[11]發(fā)現：用麝香酮含藥血清對鼠源BMSCs進行處理后，細胞的增殖率、鈣鹽沉積量、骨鈣素分泌量、鈣化結節(jié)量均高于空白對照組；謝興文等[12]在構建顱骨損傷的大鼠模型后，同時給以BMSCs和麝香酮進行治療，結果顯示：在麝香酮的作用下，大鼠BMSCs向損傷部位的遷移能力，明顯優(yōu)于未處理組。但是，含藥動物血清的模式顯然不適用與臨床研究，同時，應用鼠源BMSCs在指導臨床方面也缺乏一定的說服力，所以，本課題以人源BMSCs為研究對象，探索麝香酮對人源BMSCs成骨分化的影響，從而明確BMSCs聯合麝香酮在骨損傷治療方面的可應用價值。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器

α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司，Percoll 分離液購自Pharmacia公司，CCK-8增殖檢測試劑盒購自Dojindo公司，人源CD34-FITC、CD44-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC單克隆抗體購自BD公司，麝香酮購自Santa公司，Trizol、RNA反轉錄試劑盒、SYBR熒光定量PCR試劑盒均購自Takara公司，實驗用引物均由上海生工生物股份有限公司合成，堿性磷酸酶染色試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

IX-70倒置相差顯微鏡購自Olympus公司，CFX96實時定量PCR儀購自BIO-RAD公司，FACSCalibur 流式細胞儀購自BD公司，EXL-808酶標檢測儀購自BioTek公司。

1.2人源BMSCs的分離培養(yǎng)和鑒定

采集健康志愿者骨髓，用α-MEM培養(yǎng)基等比例稀釋，1 500 rpm離心10 min，去掉脂肪層，用α-MEM培養(yǎng)液重懸細胞，緩慢加入預先含有等體積的1.073 g/mL Percoll分離液的離心管內，3 000 rpm離心20 min，吸取中間的單個核細胞層， PBS清洗2次后，于37℃、5% CO2條件下，用含有10% FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。此時的人源BMSCs記為第1代。BMSCs隔日換液1次，培養(yǎng)4-5天后可進行首次傳代。

收集第3代的BMSCs進行后續(xù)的檢測和評價。在增殖能力檢測方面，將BMSCs以1×103cells/孔的數量接種到96孔板中，采用CCK-8試劑盒檢測細胞在不同時間點(24 h、48 h、72 h和96 h)的增殖水平，評價其增殖能力，用僅含培養(yǎng)基的組作為背景組，采用絕對吸光度評價細胞的增殖能力，實驗組絕對吸光度值=實驗組吸光度值-空白組吸光度值，每組設4個復孔，具體操作按CCK-8試劑盒說明書進行。在表面特異標記檢測方面，將1×106BMSCs懸浮于0.1 ml PBS中，人源CD34-FITC、CD44-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC單克隆抗體均按1∶50的稀釋比例與BMSCs混合，室溫孵育30 min后，用PBS清洗兩次，并通過流式細胞儀檢測細胞表面標記。

1.3麝香酮對人源BMSCs成骨基因的表達影響分析

將麝香酮(1.0 mg/L)加入到BMSCs的培養(yǎng)基中，持續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集BMSCs，用Trizol裂解，提取細胞RNA，并進一步通過反轉錄試劑盒獲得細胞基因組cDNA，采用實時定量PCR儀，檢測BMSCs中成骨基因ALP、Collagen I、RunX2、Osterix的表達程度(以未經過麝香酮處理過的BMSCs為對照組)，具體操作按照試劑盒說明書進行。在檢測中，以β-actin作為內參，將未用麝香酮處理的BMSCs作為空白對照組，并將成骨基因在空白對照組的表達水平作為“1”，通過等比例比較麝香酮處理后的基因表達水平。實時定量PCR所用引物如下：

ALP forward (F) 5’-AAATACGAGATCCACCGAGACTCCA-3’

reverse (R) 5’-GATGCGACCACCCTCCACGAAG-3’

Collagen I forward (F) 5’-TGGTGGTTATGACTTTGGTTACGAT-3’

reverse (R) 5’-TGTGCGAGCTGGGTTCTTTCTA-3’

Runx2 forward (F) 5’-CCTCAGGCATGTCCCTCGGTAT-3’

reverse (R) 5’-TGGCTTCCATCAGCGTCAACAC-3’

Osterix forward (F) 5’-GCTCCTCCTGCGACTGCCCTAA-3’

reverse (R) 5’-GCTCATCCGAACGAGTGAACCTC-3’

β-actin forward (F) 5’-CCCAGAGCAAGAGAGG-3’

reverse (R) 5’-GTCCAGACGCAGGATG-3’

1.4麝香酮對BMSCs成骨分化過程中堿性磷酸酶的影響

在BMSCs的培養(yǎng)基中，附加地塞米松1×10-4mM、維生素C 50 mg/L、β-甘油磷酸鈉10 mM，配制間充質細胞的成骨分化培養(yǎng)基。在成骨分化培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L的麝香酮，用以培養(yǎng)BMSCs，在分化誘導第7天，對細胞進行堿性磷酸酶(ALP)染色，對比檢測麝香酮作用組與正常對照組(正常分化，無麝香酮作用)在堿性磷酸酶染色方面的差異，并通過Motic Image Advanced 3.2軟件分析各組染色灰度值。

1.5統(tǒng)計學分析

2結果

2.1人源BMSCs的分離和鑒定結果

在體外培養(yǎng)的條件下，從志愿者骨髓中分離的BMSCs主要呈長梭形貼壁生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，可見細胞的生長密度逐漸加大，在貼壁培養(yǎng)96h后，可見細胞生長的較為密集(圖1A)；同時，通過CCK-8檢測法，對培養(yǎng)24h、48h、72h和96h的BMSCs的增殖能力評價，結果顯示：本課題中的人源BMSCs具有正常的體外增殖能力，在一定的時間內，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞的數量也逐漸增多(圖1B)。

在對人源BMSCs的表面標記鑒定方面，流式細胞儀檢測的結果表明：人源BMSCs表達CD44、CD73和CD90(表達效率分別為：94.2 %、91.9 %和95.6 %，圖2)，基本不表達CD34(表達效率為：4.81%，圖2)，這種表面標記特征與正常的骨髓間充質干細胞相符合，滿足課題的研究需要。

A.人源BMSCs的形態(tài)特征；B.人源BMSCs的體外增殖結果

圖2　人源BMSCs的表面標記鑒定結果

2.2麝香酮對人源BMSCs成骨基因的表達影響

本課題主要通過實時定量PCR檢測BMSCs成骨相關基因的表達情況，通過結果分析可見：在麝香酮的作用下，與未用麝香酮處理的BMSCs相比， 處理后BMSCs的成骨基因ALP、CollagenI、RunX2和Osterix均有一定程度的上調，且通過統(tǒng)計學分析顯示P<0.05(圖3)。所以，麝香酮對于正常人源BMSCs的成骨相關基因的表達有一定的上調功能。

2.3麝香酮對人源BMSCs成骨分化過程中堿性磷酸酶的影響分析結果

在成骨培養(yǎng)基的誘導分化7天后，正常的BMSCs(未經過麝香酮處理)經過ALP染色后，可將部分細胞被染成紫黑色，但是，在分化的過程中經過麝香酮處理的BMSCs，可在ALP染色后體現更深的顏色，同時，陽性的細胞數量也明顯增多(圖4A)。每組隨機選擇4個視野，通過MoticImageAdvanced3.2軟件分析各組染色灰度值，結果也表明：分化培養(yǎng)基中含有麝香酮的情況下，人源BMSCs在ALP染色后灰度值顯著上調(以正常對照組的染色深度為“1”進行比較，P<0.05)。所以，麝香酮對人源BMSCs的成骨分化具有一定的促進作用。

圖3　麝香酮作用下人源BMSCs成骨基因的表達變化(*：P<0.05)

A.BMSCs成骨分化過程中ALP染色結果；B.ALP染色深度的灰度值分析結果(*：P<0.05)

3討論

本課題以人源BMSCs為研究對象，通過對相關基因和細胞的檢測分析，初步證明了麝香酮對人源BMSCs的成骨分化過程具有一定的促進作用，與其他課題組報道的實驗結論具有一定的一致性，進一步明確了BMSCs聯合麝香酮在骨損傷治療方面的應用優(yōu)勢。

在以前的研究中，課題組還發(fā)現：麝香酮可以再一定程度上上調細胞CXCR4和CXCR7的表達水平，從而提升了BMSCs的遷移能力，同時對細胞的增殖和多種因子的分泌能力也有一定的促進，這可能與本課題中麝香酮促進BMSCs成骨分化具有一定的相關性[8]。但是，從基因調控的角度分析，CXCR4和CXCR7的下游基因較多，相關聯的生物學功能也不僅限于成骨分化功能，麝香酮對BMSCs其它生物學特性的影響仍需要進一步的探索和研究。

參考文獻：

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[12]謝興文,侯費祎,李寧,等.不同濃度麝香酮對外源性骨髓間充質干細胞在體內遷移的影響[J].中國中西醫(yī)結合雜志,2012,32(7):980.

基金項目：深圳市知識創(chuàng)新計劃 (JCYJ20140416122812052)，深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研項目 (201401010)

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)07-1049-05

中圖分類號：Q813

文獻標識碼：A

(收稿日期：2014-10-20)

Study on the promotion effect of muscone on human bone marrow-derived mesenchymal stem cells osteogenic differentiation

LIUMin-jie1,LIUPeng-fei2*,ZHAOLei3*．

(1.OperatingTheatre,SecondClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,ShenzhenPeople’sHospital,Shenzhen518020,China;2.DepartmentofRegenerationMedicine,SchoolofPharmaceuticalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China; 3.DepartmentofAnesthesiology,SecondClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,ShenzhenPeople’sHospital,Shenzhen518020,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the promotion effect of muscone on human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) osteogenic differentiation and confirm the application advantage of combination of BMSCs and muscone in the therapy of bone injury.MethodsHuman BMSCs were isolated from healthy volunteer bone marrow with density gradient centrifugation,and cell proliferation ability and characteristics on cell surface were confirmed with CCK-8 method and FACS respectively.The osteogenic genes in BMSCs with the treatment of muscone were further analyzed using real-time quantitative PCR (qPCR).Finally,the promotion effect of muscone on human BMSCs osteogenic differentiation was evaluated though alkaline phosphatase (ALP) staining.ResultsHuman BMSCs could proliferate normally in vitro,and showed a positive expression of CD44,CD73 and CD90,as well as a negative expression of CD34,which coincided with the normal phenotype.The qPCR results indicated that the expression of osteogenic genes,including ALP,Collagen I,Runx2 and Osterix,could be up-regulated in BMSCs with the treatment of muscone,and the treatment also could deepen the ALP staining during osteogenic differentiation.ConclusionMuscone holds the promotion effect on human BMSCs osteogenic differentiation,and the combination of BMSCs and muscone holds the application advantage in the therapy of bone injury.

Key words:bone marrow-derived mesenchymal stem cells,muscone,osteogenic differentiation