吳　勇　張?zhí)煊ⅰ∷螢g偉　夏寧邵　袁　權

(廈門大學分子疫苗學與分子診斷學國家重點實驗室，國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，公共衛(wèi)生學院，廈門361102)

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抗PD-L1單抗的研制及其對乙型肝炎病毒的抑制效果初步研究①

吳勇張?zhí)煊ⅱ谒螢g偉③夏寧邵袁權

(廈門大學分子疫苗學與分子診斷學國家重點實驗室，國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，公共衛(wèi)生學院，廈門361102)

[摘要]目的：獲得具有阻斷PD-1/PD-L1結合活性的Anti-PD-L1單克隆抗體，并在體內和體外模型中初步探索其應用于慢性HBV感染治療的潛力。方法：利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)和離子交換柱層析純化手段，表達純化獲得具有體外結合活性的人源和鼠源的PD-1/PD-L1蛋白，采用純化后的人PD-L1蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠，制備小鼠抗人PD-L1的單克隆抗體雜交瘤細胞株，基于間接化學發(fā)光免疫法評估了這些抗體與人源和鼠源重組蛋白的結合活性，并定量評估它們對PD-L1體外相互作用的阻斷活性。利用慢乙肝病人PBMC體外刺激方法評估其對T細胞功能的促進作用，在HBV轉基因小鼠中評估其抑制HBV的效果。結果：本研究獲得了8株穩(wěn)定分泌Anti-PD-L1的單克隆抗體雜交瘤細胞株，其中Anti-PD-L1 Ab5和Ab6兩株單抗與人和小鼠的PD-L1具有較強的交叉反應性，且均可阻斷人和小鼠的PD-1/PD-L1結合活性。在慢乙肝病人PBMC刺激培養(yǎng)實驗中，Ab5和Ab6可促進γ干擾素水平升高；在HBV轉基因小鼠中單劑注射Ab6，48 h后血清HBV DNA水平降低20倍，血清HBsAg水平降低至基線水平的30%。結論：獲得了2株具有阻斷人和小鼠PD-1/PD-L1結合活性的單克隆抗體，其在PBMC體外刺激培養(yǎng)系統(tǒng)中可促進慢乙肝病人的T細胞功能，在HBV轉基因小鼠中具有顯著的抗病毒效果，具備一定的治療應用潛力。

[關鍵詞]程序性細胞死亡蛋白配體1；治療性單克隆抗體；乙型肝炎病毒；免疫治療

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染會導致急性或慢性的肝臟炎癥，其中慢性肝炎可能會進一步進展為肝硬化或肝癌，目前全球仍有超過2.4億慢性HBV感染者[1]。在慢性感染期間，病毒復制與宿主免疫應答的動態(tài)平衡關系對于疾病的進展至關重要。多數(shù)學者認為獲得性免疫應答，尤其是細胞免疫應答介導了HBV的清除[2,3]。然而，慢乙肝病人體內的HBV特異性T細胞的功能是有缺陷的，表現(xiàn)為抗病毒細胞因子分泌水平較低，細胞毒性T細胞(CTL)活性較弱以及持續(xù)的病毒血癥[4]。但是目前對于慢乙肝感染后T細胞功能缺陷的機制并不清楚。

程序性細胞死亡受體-1 (Programed cell death l,PD-1)，最初是在凋亡的T細胞雜交瘤中利用削減雜交的方法得到的，由于其和細胞凋亡相關而得名，其N 端酪氨酸殘基參與構成一個免疫受體酪氨酸抑制基序[5]。PD-1/PD-L1通路已被廣泛報道在T細胞激活和增殖以及細胞因子分泌過程中起負向調節(jié)作用[6,7]。已有證據(jù)表明PD-1信號通路在抑制慢性病毒性感染病人體內的病毒特異CD8+T細胞過程中起重要作用，包括HIV感染、HCV感染和HBV感染[8-10]。最近的研究通過誘導T細胞失活、在外周T淋巴細胞上高表達PD-1分子、阻斷PD-1介導的通路表明PD-1/PD-L1負調控信號是導致T細胞耗竭的重要因素[11-13]。

目前用于HBV治療的藥物包括干擾素類(IFN)和核苷類似物類(NAs)，治療策略相對有限，治療效果不理想[14,15]，針對慢性HBV感染者發(fā)展創(chuàng)新的、能促進逆轉免疫耐受的創(chuàng)新治療藥物和方法是迫切且必要的。近期研究表明慢性HBV感染與PD-1/PD-L1信號通路密切相關，通過抗體阻斷該通路可以刺激特異的T細胞增殖，從而促進病毒的清除[16,17]。因此，篩選具有阻斷活性的Anti-PD-L1單克隆抗體有望為慢性乙型肝炎病毒感染等免疫耐受性疾病的治療提供新策略。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株E.coli DH5α由本中心保存；E.coli ER2566購自New England Biolabs公司。

1.1.2載體和質粒pMD18-T購自TaKaRa公司；pTO-T7載體由本實驗室自行構建。

1.1.3細胞小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0細胞由廈門萬泰公司饋贈，培養(yǎng)于含10% 胎牛血清、50 μg/ml青霉素/鏈霉素的1640HT培養(yǎng)基(pH7.2)中，5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。

1.1.4實驗動物BALB/c品系小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，HBV轉基因小鼠由臺灣大學陳培哲教授惠贈，飼養(yǎng)于分子疫苗學與分子診斷學國家重點實驗室SPF級動物房內，本實驗遵循《實驗動物保護條例》。

1.1.5主要試劑生化藥品為進口或國產分析純；質粒小量提取試劑盒、微量膠回收試劑盒均購自Tiangen公司；HBsAg檢測試劑盒、HBV DNA熒光定量PCR試劑盒、人干擾素定量檢測試劑盒均購自北京萬泰生物公司；DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司；考馬斯亮藍染色試劑(SDS-PAGE)購自HyClone公司；SYBR Green DNA熒光染料購自Clare Chemical公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司。

1.2方法

1.2.1質粒構建從Genbank獲得人和小鼠的PD-1/PD-L1基因全長序列，本研究設計表達了人PD-1/PD-L1和小鼠PD-1/PD-L1的膜外區(qū)域，分別為：Human PD-1-aa21-aa170、Human PD-L1-aa20-aa238、Mouse PD-1-aa1-a167、Mouse PD-L1-aa20-aa240(以下簡稱hPD-1、hPD-L1、mPD-1、mPD-L1)，引物設計如表1所示；以人PD-1和人PD-L1的cDNA為模板擴增出hPD-1、hPD-L1目的片段，提取C57BL/6小鼠的脾臟細胞的mRNA作為模板，反轉錄后擴增出mPD-1、mPD-L1目的片段。

將擴增獲得的DNA片段分別與pMD18-T載體連接，得到以下四種質粒：T-hPD-1、T-hPD-L1、T-mPD-1、T-mPD-L1經測序鑒定正確后用BglⅡ和EcoRⅠ進行雙酶切后與pTO-T7載體連接并轉入E.coli菌株ER2566挑克隆，經BglⅡ/EcoRⅠ雙酶切及DNA測序鑒定獲得重組表達質粒pT-hPD-1、pT-hPD-L1、pT-mPD-1、pT-mPD-L1。

表1人和小鼠PD-L1 PCR擴增正反向引物序列

Tab.1Upper and lower primers of human and mouse PD-L1

PrimernamePrimersequenceHumanPD-1(21-170)FTTTAGATCTATGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCHumanPD-1(21-170)RTTTGAATTCTCACCAGGGTTTGGAACTGGCCHumanPD-L1(20-238)FTTTAGATCTATGACTGTCACGGTTCCCAAGGACCTHumanPD-L1(20-238)RTTTGAATTCTTACCTTTCATTTGGAGGATGTGCCAMousePD1(1-167)FTTTAGATCTA6TGTGGGTCCGGCAGGTACCCTGGTCAMousePD1(1-167)RTTTGAATTCTTATTGAAACCGGCCTTCTGGTTTGGGCGAMousePD-L1(20-240)FTTTAGATCTATGACTATCACGGCTCCAAAGGACMousePD-L1(20-240)RTTTGAATTCTTACCAGTGAGTCCTGTTCTGTGGAGGAT

1.2.2蛋白表達純化將鑒定正確的單克隆表達菌株于37℃大量培養(yǎng)至菌液OD600=0.5左右，加入IPTG至終濃度1 mmol/L， 37℃誘導表達5 h，經鑒定，4種蛋白均表達在包涵體。hPD-1和mPD-1純化步驟一致，以hPD-1為例詳述純化步驟，超聲破碎表達菌體后高速離心后棄上清，以含有2% Triton X-100的PBS緩沖液洗滌兩次，每次在室溫條件下攪拌洗滌1 h，完成洗滌后以20 mmol/L PBS洗一次，不溶解的沉淀部分以適量的2 mol/L Urea+10 mmol/L DTT的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)，4 mol/L Urea+10 mmol/L DTT的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)及8 mol/L Urea+10 mmol/L DTT的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)逐級溶解；經過包涵體洗滌后溶解于4 mol/L Urea+10 mmol/L DTT的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液的蛋白進一步進行陰離子交換層析(GE公司DEAE-FF-Sepharose、Q-FF-Sepharose層析柱)純化。純化后將蛋白透析至20 mmol/L MES緩沖液pH5.5中，于-20℃保存。hPD-L1和mPD-L1的純化步驟一致，其蛋白包涵體洗滌、溶解、柱層析純化過程與hPD-1基本相同，差別之處在于其復性過程相對簡單，DEAE柱層析純化后的hPD-L1蛋白處于4 mol/L Urea+10 mmol/L DTT的20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液中，采用Sephadex G25脫鹽柱將緩沖液置換為20 mmol/L TB8.0(pH8.0)緩沖液中，于-20℃保存。

1.2.3Anti-PD-L1單抗制備初次免疫選取6周齡BABL/c雌性小鼠皮下多點注射弗氏完全佐劑乳化后的免疫原h(huán)PD-L1，劑量為100 μg/只，同時經眼球采集空白陰性血。2周后以相同途徑、相同劑量的抗原與弗氏不完全佐劑乳化后皮下加強免疫，加強2次后小鼠血清抗體滴度達到平臺期，脾臟沖擊免疫20 μg，進行融合實驗。每次免疫前眼底采血，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱30 min，12 000 r/min高速離心 10 min后，取血清-80 ℃保存，利用間接法 ELISA檢測血清Anti-PD-L1抗體滴度。

融合前三天進行脾臟免疫加強，無菌條件下取小鼠脾臟制備脾細胞懸液，使用PEG 1500促進脾細胞與骨髓瘤細胞融合；用hPD-L1蛋白包板，通過常規(guī)間接ELISA差異篩選特異性陽性融合株，有限稀釋法進行克隆化，獲得的穩(wěn)定細胞株擴增、腹腔注射BALB/c小鼠，1周后收集腹水，硫酸銨沉淀法、Protein A柱純化得到單克隆抗體。抗體進行12%的SDS-PAGE分析，觀察樣品純度。

1.2.4單抗阻斷hPD-1/hPD-L1、mPD-1/mPD-L1結合活性檢測實驗分別將mPD-1和hPD-1蛋白包被于聚苯乙烯微孔板中作為固相受體，100 ng/孔，再將生物素標記的PD-L1蛋白和Anti-PD-L1單抗混合樣品于微孔板中孵育，待其充分反應之后將樣品中未結合的游離蛋白洗去，然后加入辣根過氧化物酶標記的親和素進行反應，將未結合的酶標記親和素洗去，最終加入化學發(fā)光顯色底物，通過酶標儀讀取數(shù)值判斷反應強弱，進而分析待檢測的Anti-PD-L1單抗的阻斷活性。

1.2.5單抗功能評價體外刺激T細胞功能實驗：分離慢乙肝患者的外周血單核細胞(PBMC)進行體外刺激培養(yǎng)，方法參考文獻[18]。在培養(yǎng)基中加入去類毒素的HBV核心蛋白(10 μg/ml)刺激HBV-core 特異的T細胞活性，分別加入不同劑量的待測抗體或對照抗體(0、1、5、20 μg/ml)，刺激培養(yǎng)48 h后檢測其分泌的γ干擾素水平以反應其T細胞應答的水平。

體內抗病毒效果評估實驗：以20 mg/kg的劑量單劑尾靜脈注射的方式注入HBV轉基因小鼠體內，每組4只HBV轉基因小鼠。通過眼眶后靜脈叢取血的方式監(jiān)測小鼠血清中的HBsAg水平和HBV DNA水平的變化。HBsAg化學發(fā)光檢測及HBV DNA定量檢測按照試劑盒說明書操作。

2結果

2.1PD-1與PD-L1蛋白的表達、純化與鑒定

2.1.1PD-1與PD-L1蛋白的表達、純化本研究成功構建了hPD-1、hPD-L1、mPD-1和mPD-L1四種原核重組表達質粒，通過大腸桿菌系統(tǒng)表達并純化了這四種蛋白。純化最終得到蛋白純度均在85%以上，如圖1A所示。

2.1.2PD-1與PD-L1蛋白的生物活性鑒定利用化學發(fā)光免疫法分析本研究制備的PD-1和PD-L1之間的相互作用活性，人和小鼠的PD-1/PD-L1進行同種屬及種屬間的相互配對檢測，結果如圖1B所示，hPD-1與mPD-L1的結合力最強，hPD-1與hPD-L1、mPD-1與mPD-L1兩者結合力都較強且強度相當，mPD-1與hPD-L1的結合力最弱。此結果表明，重組表達的4種蛋白具備很好的生物活性，可作為免疫原用于制備特異的Anti-PD-L1小鼠抗體，并為后續(xù)的抗體性質評估提供基礎。

2.2Anti-PD-L1單克隆抗體性質鑒定

2.2.1Anti-PD-L1單抗與重組抗原反應性鑒定本研究共計制備了8株穩(wěn)定分泌鼠Anti-PD-L1的單克隆抗體雜交瘤細胞株(Ab1-Ab8)，分別將重組蛋白hPD-L1和mPD-L1包被于96孔化學發(fā)光板，將抗體濃度稀釋至0.1 μg/ml，利用間接法CLEIA鑒定這8株單抗的反應性，結果如圖2A所示，與無關對照單抗相比，8株單抗均具有特異的反應活性，其中Ab5和Ab6兩株單抗與人和小鼠的PD-L1具有較強的交叉反應活性。

2.2.2Anti-PD-L1單抗阻斷hPD-1/hPD-L1、mPD-1/mPD-L1結合的活性鑒定基于1.2.4所述方法，通過摸索生物素標記的PD-L1-biotin的濃度，使其在未加入阻斷抗體時最終讀值為log10(RLU)=6.3，該讀值處于儀器設備線性讀值范圍的中間區(qū)域；經過條件優(yōu)化，最終確定反應條件如下：hPD-1或mPD-1稀釋于50 mmol/L 碳酸鹽緩沖液至2 μg/ml，100 μl/孔，于4℃過夜包被至96孔化學發(fā)光板中； hPD-L1-biotin或mPD-L1-biotin使用20%牛血清稀釋至終濃度為2 μg/ml作為工作液，抗PD-1或抗PD-L1單抗初始濃度為20 μg/ml，3倍梯度稀釋，檢測稀釋的抗體對人和小鼠的PD-1/PD-L1的阻斷效果。

對8株Anti-PD-L1單抗的阻斷活性進行評估，結果如圖2B所示，5株抗體人和小鼠PD-1/PD-L1均顯示出不同程度的阻斷效果，其中Ab5與Ab6株單抗對人和小鼠PD-1/PD-L1的相互作用均顯示出較為顯著的阻斷效果。

2.3Anti-PD-L1抗體的體內外功能初步研究挑選對人和小鼠PD-1/PD-L1阻斷活性較強的Ab5與Ab6兩株抗體進行體內外功能評估。本實驗基于慢乙肝患者的PBMC體外刺激培養(yǎng)系統(tǒng)，評估Ab5和Ab6對其γ干擾素分泌的影響，該刺激系統(tǒng)中同時在培養(yǎng)基中加入去類毒素的HBV核心蛋白可刺激HBV-core 特異的T細胞活性，檢測其分泌的γ干擾素水平以反映其T細胞應答的水平。每組中的單抗劑量分別為0、1、5、20 μg/ml，以無關單抗作為對照，結果如圖3A所示，在刺激培養(yǎng)體系中加入Ab5或Ab6可以刺激慢乙肝患者外周血細胞的γ干擾素分泌，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，γ干擾素分泌水平隨抗體劑量的升高而上升，提示Ab5和Ab6可增強HBV特異的T細胞的活性，對于逆轉慢乙肝患者的HBV免疫耐受狀態(tài)具有一定的潛力。

圖1　人和小鼠PD-1/PD-L1蛋白純度與結合活性鑒定Fig.1　Purity and interaction activity of human and mouse PD-1/PD-L1 Note: A.SDS-PAGE analysis of human and mouse recombinant PD-1/PD-L1；M.Protein ladder;1.hPD-1;2.hPD-L1;3.mPD-1;4.mPD-L1；B.The cross interaction between PD-1/PD-L1.

由于Ab5和Ab6可阻斷mPD-1/mPD-L1結合，因此可以利用HBV攜帶小鼠評估其體內的抗病毒活性。本實驗所用的模型是基于C57BL/6的HBV轉基因小鼠，Anti-PD-L1單抗Ab5和Ab6通過尾靜脈，以20 mg/kg的劑量給藥后，HBV轉基因小鼠血清中的HBsAg和HBV DNA水平均顯著下降，其中Ab5治療效果較優(yōu)，抗體治療后48 h，小鼠血清中HBsAg平均水平從7 000 U/ml降至2 000 U/ml，HBV DNA水平從106.60 U/ml降至105.30 U/ml(見圖3)。結果顯示該抗體在HBV轉基因小鼠中具有顯著的抗病毒效果，具備一定的治療應用潛力。

圖2　Anti-PD-L1單抗性質鑒定Fig.2　Properties of Anti-PD-L1 mAbNote: A.Analysis of Anti-PD-1 mAb reactivity;B.Blockade efficiency of Anti-PD-L1 mAbs against human and mouse PD1/PD-L1.

圖3　Anti-PD-L1單抗治療后HBV轉基因小鼠體內γ干擾素水平和HBsAg水平變化Fig.3　Change of interferon-gamma level and HBV level post Anti-PD-L1 mAbs treatment in HBV transgenic miceNote: A.Change of interferon-gamma level;B.Change of HBsAg level.

3討論

在持續(xù)性病毒感染動物模型中的研究顯示，長期暴露于高濃度的抗原會造成不同程度的抗病毒T細胞功能的缺陷，甚至是功能性缺失。慢性HBV感染的病人血清中存在大量的病毒抗原，有研究顯示HBV特異的T細胞功能與病毒學水平呈負相關，T細胞耗竭的機制可能在慢乙肝疾病進展中扮演重要角色[8,19,20]。因此，通過抗體阻斷PD-1/PD-L1共抑制信號通路，從而增強抗病毒特異的T細胞功能，促進免疫耐受的逆轉，可能為慢性乙型肝炎的治療提供新途徑。

本研究采用大腸桿菌表達的人PD-L1蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠，獲得8株穩(wěn)定分泌Anti-PD-L1的單克隆抗體雜交瘤細胞株，部分抗體與小鼠PD-L1也具有較強的反應活性，其中交叉結合活性最強的兩株抗體是Ab5和Ab6，且均可阻斷人和小鼠的PD-1/PD-L1結合活性，提示這部分單抗所識別的表位可能在PD-L1蛋白中是種屬間保守的，這些交叉反應性抗體的存在，為進一步利用小鼠動物模型評估Anti-PD-L1單抗的治療作用奠定基礎。

Ab5和Ab6在PBMC體外刺激培養(yǎng)系統(tǒng)中可促進慢乙肝病人的T細胞功能，在HBV轉基因小鼠中具有顯著的抗病毒效果，具備一定的治療應用潛力。目前的慢性HBV感染治療藥物，如干擾素和核苷類似物，能對HBV相關疾病的發(fā)展起一定的控制作用，但它們并不能完全清除病毒感染。抗PD-1/PD-L1類免疫調節(jié)單抗的治療原理，與上述兩類藥物完全不同，并可能存在互補性，本研究獲得的Ab5和Ab6可能為慢乙肝藥物的研發(fā)提供新的候選分子。

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[收稿2016-03-07]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.016

作者簡介：吳勇(1989年-)，男，在讀碩士，主要從事乙肝基因型方面研究，E-mail:uncleyong@163.com。 通訊作者及指導教師：袁權(1982年-)，男，博士，副教授，主要從事乙型肝炎病毒感染機制方面研究，E-mail:yuanquan@xmu.edu.cn。

中圖分類號R392

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-1004-06

Development of monoclonal antibodies against PD-L1 and preliminary investigation on potential application in treatment of chronic hepatitis B virus infection

WU Yong,ZHANG Tian-Ying,SONG Liu-Wei,XIA Ning-Shao,YUAN Quan.

State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics,School of Public Health,National Institute of Diagnostics and Vaccine Development of Infectious Diseases,Xiamen University,Xiamen 361102,China

[Abstract]Objective:To get specific monoclonal antibodies (mAbs) against PD-L1 which can block PD-1/PD-L1 binding,and explore the feasibility of its application on the treatment of chronic HBV infection preliminarily by in vitro and in vivo model.Methods: E.coli expression and series chromatography purification system were employed to get human and mouse PD-1/PD-L1 that had binding activity in vitro.By immunizing BALB/c mouse with purified recombination proteins of PD-L1,mAb hybridoma cell lines against PD-L1 were obtained.The reactivity with human/mice PD-L1 of individual antibody and the interaction blocking activity of the mAbs to PD-1/PD-L1 in vitro were examined by indirect chemiluminescence immune assay.Results: 8 cell lines against PD-L1 were obtained and 2 Anti-PDL1 mAbs (Ab5 & Ab6) performed strong immune activity to human/mice PD-L1 and blocking activity to PD-1/PD-L1.In the PBMC stimulation experiment of chronic HBV patient,Ab5 and Ab6 could promote the γ-IFN levels.With HBV infecting mice model,intravenous injections of these mAbs induced dramatically decrease of HBV DNA copies about 20 times,HBsAg levels in serum reduced to 30% of the baseline level.Conclusion: We obtained 2 PD-L1 mAbs with the reactivity to human/mice PD-L1 and blocking activity to PD-1/PD-L1.The 2 mAbs can promote T cell function in PBMC stimulation culture of chronic HBV patient,have significant antiviral effect in HBV transgenic mice and can be candidates for immunotherapy applications.

[Key words]PD-L1;Therapeutic monoclonal antibodies;HBV;Immunotherapy

·免疫學技術與方法·

①本文為國家級科技重大專項(No.2013ZX10002002-001)。

②廈門大學生命科學學院，廈門361102。

③廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司，廈門361000。