王 媛，吳 芳，李曉鳳，洪 艷，丁正霞，許 奇，張 瑾，薛 天，鮑 進，王烈成

基礎(chǔ)醫(yī)學研究

光通過自主感光視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞調(diào)節(jié)睡眠活動

王 媛1，吳 芳1，李曉鳳1，洪 艷1，丁正霞1，許 奇1，張 瑾1，薛 天2，鮑 進2，王烈成1

目的 利用不同基因型小鼠，探討有無自主感光視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（ipRGCs）的小鼠在光的調(diào)節(jié)下對睡眠-覺醒活動的影響。方法 四種不同基因型小鼠，分別為野生型（C57BL/6，WT），ipRGCs不感光型（MKO），僅保留 ipRGCs型（MO）和視桿、視錐細胞缺失且ipRGCs不感光型（TKO）。記錄小鼠在12 h∶12 h明暗交替下24 h睡眠量和覺醒量以及在關(guān)燈后1 h（即21：00）給予3 h光照，觀察其在光照期間（21：00～24：00）睡眠量和覺醒量的變化。結(jié)果 在12 h∶12 h明暗交替下，WT、MKO和MO小鼠的覺醒、快動眼睡眠（REM）、非快動眼睡眠（NREM）有明顯的晝夜節(jié)律，并且這3種時相的分布時間差異無統(tǒng)計學意義；而TKO小鼠的3種時相無穩(wěn)定相位，表現(xiàn)為自由運轉(zhuǎn)。與12 h ∶12 h明暗交替的相應(yīng)時段比較，在3 h光照期間，WT小鼠覺醒總量減少（P＜0.01），REM總量增加（P＜0.01），NREM總量增加（P＜0.01）以及總睡眠時間（TST）增加（P＜0.01）；MO小鼠覺醒總量減少（P＜0.01），REM總量增加（P ＜0.05），NREM總量增加（P＜0.05）以及TST總量增加（P ＜0.01）；MKO和TKO小鼠的3種時相均無顯著變化。結(jié)論 表達視黑素的ipRGCs在小鼠光誘導睡眠的過程中起重要作用。

自主感光視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞；光照；生物節(jié)律；睡眠

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-3-8 8：29：00 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.002.htm l

在哺乳動物中，眼睛是唯一具有成像和非成像視覺功能的感光器官，視網(wǎng)膜中負責感光的細胞有3種，分別是視桿細胞、視錐細胞以及自主感光視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（intrinsically photosensitive retinal ganglion cells，ipRGCs）。ipRGCs能夠合成感光蛋白—視黑素，由Opn4基因編碼，參與調(diào)控晝夜節(jié)律、瞳孔對光反射等非成像視覺功能［1］。眾所周知，睡眠受內(nèi)穩(wěn)態(tài)和生物節(jié)律的雙重調(diào)控，最佳的睡眠狀態(tài)是內(nèi)穩(wěn)態(tài)和生物節(jié)律的同步化［2］。光可以影響睡眠，也可以影響覺醒，表明光在睡眠覺醒狀態(tài)中可能扮演直接角色［3］。在嚙齒類動物中，部分ipRGCs提供形態(tài)學證據(jù)證明光可能通過視網(wǎng)膜到睡眠中樞腹外側(cè)視前區(qū)（ventrolateral preoptic area，VLPO）的這一直接途徑調(diào)節(jié)睡眠［4-5］。該實驗通過構(gòu)建不同基因型小鼠的睡眠模型，觀察并記錄在12 h∶12 h明暗交替下以及關(guān)燈后給予光照對小鼠睡眠覺醒的影響，進一步探討ipRGCs在睡眠活動中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性8周齡小鼠共34只，25～28 g。均由中國科學技術(shù)大學生命科學學院腦功能與腦疾病重點實驗室薛天研究組提供，按不同基因類型分為四組：野生型（WT）即C57BL/6小鼠，有視錐、視桿細胞和ipRGCs（n=10）；ipRGCs不感光型（MKO）小鼠有視錐、視桿細胞（n=8）；僅保留ipRGCs型（MO）小鼠無視錐、視桿細胞（n=8）；視桿、視錐細胞缺失且ipRGCs不感光型（TKO）小鼠（n=8）。實驗小鼠置于動物房的獨立通風籠盒內(nèi)飼養(yǎng)，光照8：00～20：00，溫度適宜，能夠自由攝食飲水。

1.2 主要試劑與儀器 68030型小鼠腦立體定位適配器、高速顱骨鉆（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；MP150多導生理信號記錄分析系統(tǒng)（美國Biopac公司）；Sleepsign睡眠分析軟件（日本Kissei Comtec株式會社）；PCR相關(guān)試劑（日本TaKaRa公司）；電極用銀絲（美國Cooner Wire公司）；造牙粉、義齒基托樹脂（上海二醫(yī)張江生物材料有限公司）；記錄排線（東莞市耀博電子有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 基因鑒定 取出生兩周后小鼠腳趾組織放入EP管中，加入50 mmol/L NaOH 80μl，金屬浴99℃、35 min后加1 mmol/L Tris-Hcl 40μl，于4℃保存樣品。各基因分別取1μl樣品進行PCR，反應(yīng)條件：94℃、5 min；94℃、30 s，58℃、30 s，72℃、45 s共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。新生小鼠除WT外，都需要基因鑒定確定基因型后方可飼養(yǎng)實驗。

1.3.2 動物手術(shù) 小鼠經(jīng)Avertin（30 m l/kg）行腹腔麻醉后固定于小鼠腦立體定位適配器上，將小鼠頭頂毛剪去，酒精消毒皮膚并剪開，血管夾夾緊切口兩側(cè)皮膚，分離皮下組織，用生理鹽水洗凈后使顱骨完全暴露，分別位于前囟前1.0 mm、旁開1.5 mm和后囟前1.0 mm、旁開1.5 mm處用顱骨鉆鉆通顱骨，但不弄破硬腦膜，將腦電電極埋入，兩根肌電電極分別插入兩側(cè)的頸部肌肉內(nèi)。用牙科水泥將電極固定于顱骨上，腹腔注射青霉素，縫合傷口，將小鼠側(cè)臥位放入屏蔽箱恢復籠內(nèi)。

1.3.3 記錄方法 小鼠手術(shù)后放入恢復籠內(nèi)恢復7 d，第8天將小鼠頭部電極通過所焊的記錄排線與多通道萬向輪連接，適應(yīng)3 d后，正式記錄。屏蔽箱內(nèi)光照8：00～20：00，記錄從早8：00（記為ZT 0）開始，用Acqknowledge 4.2軟件記錄小鼠的腦電肌電活動，記錄過程中小鼠能夠自由飲食和攝水，活動不受限制。在正式記錄第1天和第2天，觀察12 h∶12 h明暗交替下小鼠的睡眠覺醒活動。第3天和第4天在關(guān)燈后1 h（21：00）給予3 h（21：00～24：00，ZT 13～ZT 15）的光照。以4 s為一分段時間，將睡眠覺醒周期分為覺醒，以低幅快波腦電和明顯肌電活動為特征；非快動眼睡眠（non-rapid eye movement，NREM），以高幅慢波腦電和肌電活動明顯減少為特征；快動眼睡眠（rapid eyemovement，REM），以低幅慢波腦電和肌電安靜為特征?？偹邥r間（total sleep time，TST）是REM和NREM時間之和。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，組間樣本比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 12 h∶12 h明暗交替的光信號對WT、MKO以及MO小鼠的睡眠覺醒節(jié)律的影響 在12 h∶12 h明暗交替中，WT、MKO和MO小鼠的覺醒、REM睡眠以及NREM睡眠時間呈晝夜節(jié)律變化，三者之間差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1 WT、M KO及　MO小鼠在12 h∶12 h明暗交替24 h中各時相的分布A：覺醒；B：REM睡眠；C：NREM睡眠

2.2 WT小鼠在21∶00給予3 h光照時睡眠變化

與WT小鼠12 h∶12 h明暗交替的相應(yīng)時段比較，在給予3 h光照（ZT 13～ZT 15）的時段內(nèi)，WT小鼠覺醒總量減少（t=12.99，P＜0.01），REM睡眠總量增加（t=-11.74，P＜0.01），NREM睡眠總量增加（t=-12.37，P＜0.01）以及TST總量增加（t= -12.99，P＜0.01）。見圖2。

2.3 MKO小鼠在21∶00給予3 h光照時睡眠變化

與MKO小鼠12 h∶12 h明暗交替的相應(yīng)時段比較，給予3 h的光照，其覺醒總量、REM睡眠、NREM睡眠以及TST總量無明顯的改變。見圖3。

2.4 MO小鼠在21∶00給予3 h光照時睡眠變化

與MO小鼠12 h∶12 h明暗交替的相應(yīng)時段比較，給予3 h光照，MO小鼠覺醒總量減少（t=3.15，P＜0.01），REM睡眠總量增加（t=-2.69，P＜0.05）、NREM睡眠總量增加（t=-2.72，P＜0.05）以及TST總量增加（t=-3.15，P＜0.01）。見圖4。

2.5 TKO小鼠在12 h∶12 h明暗交替以及關(guān)燈后給予光照睡眠覺醒的變化 在12 h∶12 h明暗交替中，TKO小鼠覺醒、REM睡眠及NREM睡眠周期無法與光照周期相位匹配，給予3 h光照后無改變。

3 討論

在生物進化過程中，行為活動和生理功能需要適應(yīng)外部環(huán)境的各種環(huán)境因素，在這些因素中，光被認為是最為普遍和有效的［6］。光可誘導生物節(jié)律的時相位移，調(diào)節(jié)日?；顒?、睡眠-覺醒周期以及激素分泌等。非視覺的光反應(yīng)被認為主要由感光蛋白視黑素介導［7］。ipRGCs表達視黑素，與其他類型的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞不同，ipRGCs除了能夠接受來源于視錐視桿光感受器的信號輸入，還能通過自身表達的感光蛋白直接對光產(chǎn)生反應(yīng)［8］。視桿細胞、視錐細胞以及以視黑素為感光蛋白的ipRGCs都是調(diào)節(jié)光作用于睡眠狀態(tài)所必須的。視桿細胞和視錐細胞通過ipRGCs傳遞睡眠和覺醒的信號以及缺少視黑素會改變睡眠的內(nèi)穩(wěn)態(tài)都表明ipRGCs介導了光感受對晝夜節(jié)律的影響［9］，ipRGCs加工感光信息在光誘導睡眠中同樣扮演重要的角色［10］。

圖2 W T小鼠給予3 h光照（ZT 13～ZT 15）睡眠覺醒總量的變化1：對照組；2：3 h光照組；A：覺醒總量；B：REM睡眠總量；C：NREM睡眠總量；D：TST總量；與對照組比較：**P＜0.01

圖3 MKO小鼠給予3 h光照（ZT 13～ZT 15）睡眠覺醒總量的變化1：對照組；2：3 h光照組；A：覺醒總量；B：REM睡眠總量；C：NREM睡眠總量；D：TST總量

圖4 MO小鼠給予3 h光照（ZT 13～ZT 15）睡眠覺醒總量的變化1：對照組；2：3 h光照組；A：覺醒總量；B：REM睡眠總量；C：NREM睡眠總量；D：TST總量；與對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

本研究結(jié)果顯示，在12 h∶12 h明暗交替中，MKO小鼠、MO小鼠與WT小鼠一樣，擁有與光照周期同步的睡眠覺醒節(jié)律，而TKO小鼠的睡眠-覺醒時間無法與光照周期同步，且無固定相位，表現(xiàn)為自由運轉(zhuǎn)。這說明單一的視桿/視錐細胞或者ipRGCs能夠提供光的信號使內(nèi)部節(jié)律與外部時間同步，而視黑素的存在能夠補償視桿細胞和視錐細胞的缺失。夜行性動物的睡眠主要取決于明時相中光的輸入，在暗時相開始1 h后給予3 h光照，WT小鼠和MO小鼠能夠迅速誘導睡眠，降低覺醒，然而MKO小鼠在光照期間任何時段都沒有應(yīng)答，沒有產(chǎn)生這樣的誘導效應(yīng)，說明表達視黑素的ipRGCs在光誘導睡眠中起到至關(guān)重要的作用。TKO小鼠因無法感知外部光照的周期變化，喪失光授時的途徑，睡眠和覺醒機制在給予光照時也無響應(yīng)。

［1］ Hattar S，Lucas R J，Mrosovsky N，et al.Melanopsin and rodcone photoreceptive systems account for allmajor accessory visual functions in mice［J］.Nature，2003，424（6944）：76-81.

［2］ Borbély A A.A two processmodel of sleep regulation［J］.Hum Neurobiol，1982，1（3）：195-204.

［3］ Lockley SW，Evans E E，Scheer F A，et al.Short-wavelength sensitivity for the directeffects of light on alertness，vigilance，and the waking electroencephalogram in humans［J］.Sleep，2006，29 （2）：161-8.

［4］ Gooley JJ，Lu J，F(xiàn)ischer D，et al.A broad role formelanopsin in nonvisual photoreception［J］.JNeurosci，2003，23（18）：7093-106.

［5］ Hattar S，KumarM，Park A，etal.Central projectionsofmelanopsin-expressing retinal ganglion cells in the mouse［J］.J Comp Neurol，2006，497（3）：326-49.

［6］ Kawaguchi C，Isojima Y，Shintani N，et al.PACAP-deficient mice exhibit light parameter-dependent abnormalities on nonvisual photoreception and early activity onset［J］.PLoSOne，2010，5 （2）：e9286.

［7］ Xue T，Do M T，Riccio A，et al.Melanopsin signalling in mammalian iris and retina［J］.Nature，2011，479（7371）：67-73.

［8］ Hubbard J，Ruppert E，Gropp C M，et al.Non-circadian direct effects of light on sleep and alertness：lessons from transgenic mousemodels［J］.Sleep Med Rev，2013，17（6）：445-52.

［9］ Tsai JW，Hannibal J，Hagiwara G，et al.Melanopsin as a sleep modulator：circadian gating of the directeffect of light on sleep and altered sleep homeostasis in Opn4（-/-）mice［J］.PLoSBiol，2009，7（6）：e1000125.

［10］Jagannath A，Hughes S，Abdelgany A，et al.Isoforms ofmelanopsin mediate different behavioral responses to light［J］.Curr Biol，2015，25（18）：2430-4.

Light induced sleep ismediated by intrinsically photosensitive retinal ganglion cells

Wang Yuan，Wu Fang，Li Xiaofeng，et al
（Dept of Physiology，School of Basic Medical Science，AnhuiMedical University，Hefei 230032）

Objective To investigate whether the lightmodulates sleep and wakefulness of rodents through intrinsically photosensitive retinal ganglion cells（ipRGCs）.Methods Mice were divided into four groups，including C57BL/6（WT），melanopsin knock out（MKO），melanopsin only（MO）and coneless，rodless and melanopsin knock out（TKO）.The normal12 h∶12 h light dark cycle and 3 h light pulse administered at1 h after the turning off of light（21：00）were used to detect the variation of sleep activity.Results In the normal 12 h∶12 h light dark cycle，WT，MKO and MOmice had a regular day-night rhythm and no significant difference in wakefulness，rapid eye movement（REM）and non-rapid eyemovement（NREM）.However，TKO mice could not be entrained according to the light-dark cycle and exhibited free-running rhythm.During 3 h light pulse，the amount ofwakefulness in WTmice decreased（P＜0.01）along with an increase of REM（P＜0.01），NREM（P＜0.01）and total sleep time（TST）（P＜0.01）compared with the corresponding time of the normal 12 h∶12 h light dark cycle. MO mice exhibited a similar effectwith a decrease ofwakefulness（P＜0.01）and an increase of REM，NREM and TST（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01，respectively）.Both MKO and TKOmice had no significant changes for all stages during the light pulse.Conclusion Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells play an important role in light induced sleep ofmice.

intrinsically photosensitive retinal ganglion cells；light；circadian rhythm；sleep

R 338.6

A

1000-1492（2016）04-0463-05

2015-12-25接收

國家自然科學基金資助項目（編號：81071075、81401100、81371066、31322024）；中國科學院腦功能與腦疾病重點實驗室開放課題（編號：2013-1）；安徽省教育廳自然科學基金重點項目（編號：KJ2014A116）

1安徽醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學教研室，合肥 2300322中國科學技術(shù)大學生命科學學院腦功能與腦疾病重點實驗室，合肥 230027

王 媛，女，碩士研究生；王烈成，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：wangliecheng@ahmu.edu.cn