張 強(qiáng)，劉繼剛，楊國海，劉 江，劉 昊

胰腺癌缺失基因DPC4在牙齦癌中的表達(dá)

張 強(qiáng)1，劉繼剛2，楊國海3，劉 江4，劉 昊5

應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)和Real-time PCR法檢測33例牙齦癌（高分化15例，中分化10例，低分化8例）和8例正常牙齦組織中DPC4蛋白和mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，牙齦癌組織DPC4陽性細(xì)胞百分比顯著低于正常牙齦組織，高分化、中分化、低分化牙齦癌和牙齦組織的DPC4蛋白相對表達(dá)、mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示牙齦癌DPC4表達(dá)降低，可能與牙齦癌的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。關(guān)鍵詞胰腺癌缺失基因4；牙齦癌；免疫組織化學(xué)；Realtime PCR

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-3-8 8：29：02 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.066.htm l

牙齦癌有較高的發(fā)病、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率，絕大多數(shù)為高分化的鱗狀上皮細(xì)胞癌［1］。研究與牙齦癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)將有助于合理應(yīng)用綜合性治療方法，提高患者的生存率及生存質(zhì)量。胰腺癌缺失基因4（deleted in pancreatic cancer 4，DPC-4）是最近幾年在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)的一種新型腫瘤抑制基因，其主要作用為調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡［2-4］。研究DPC-4基因和蛋白在牙齦癌不同類型中表達(dá)、分布及變化情況，有助于為臨床檢測牙齦癌進(jìn)行早期確診和制定合理的治療方案提供參考和借鑒的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料 牙齦癌組織石蠟標(biāo)本來自華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科，共33例，其中高分化15例，中分化10例，低分化8例。所有病例經(jīng)病理學(xué)確診，術(shù)前未進(jìn)行放療化療。正常牙齦組織8例，為隨機(jī)從癌旁牙齦組織中獲取。鼠抗DPC4抗體和PCR相關(guān)試劑購自武漢博士德生物工程有限公司；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2溶液室溫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，抗原熱修復(fù)和5%BSA封閉后，一抗4℃孵育過夜（一抗?jié)舛葹?∶150），DAB顯色。DPC4以細(xì)胞胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。高倍鏡下，隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占視野總細(xì)胞數(shù)的平均百分比。同時(shí)應(yīng)用Image-Proplus6.0軟件分析系統(tǒng)對其陽性細(xì)胞表達(dá)的光密度進(jìn)行定量分析，測定其積分光密度（integral optical density，IOD）值。

1.2.2 Real-time PCR法檢測 提取石蠟組織DNA，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。DPC-4上游引物5′-AGGCTAACTCATCTGGATCG-3′，下 游引 物：5′-GCCACTTCCGCATTACCTG-3′。PCR擴(kuò)增條件：94℃、4 min；94℃、30 s；55℃、30 s；72℃、25 s；35個(gè)循環(huán)。按照公式ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（管家基因）、ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對照組），計(jì)算2-ΔΔCt（mRNA表達(dá)水平）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析，DPC4蛋白和mRNA表達(dá)比較采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。

圖1 牙齦癌及牙齦組織　DPC-4的表達(dá) SP×400A：正常牙齦組；B：高分化組；C：中分化組；D：低分化組

2 結(jié)果

2.1 DPC4在正常牙齦組織和牙齦癌組織中的表達(dá) DPC4基因編碼的蛋白在正常牙齦組織和牙齦癌組織中主要定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，呈棕黃色、彌散分布，見圖1、表1。經(jīng)方差分析和組間兩兩比較顯示，DPC4在各組間的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常牙齦組織中表達(dá)最高，牙齦癌組織分化程度越低，DPC4表達(dá)越低。見表2。

表1 牙齦癌及正常牙齦組織　DPC4陽性細(xì)胞百分比的比較（%，±s）

表1 牙齦癌及正常牙齦組織　DPC4陽性細(xì)胞百分比的比較（%，±s）

與正常牙齦組比較：*P＜0.05；與高分化組比較：#P＜0.05；與中分化組比較：△P＜0.05

組別　n　陽性細(xì)胞百分比（%）正常牙齦91.25±10.33高分化　15　64.63±7.18*中分化　10　47.02±5.62*#低分化　8　25.28±4.88*#△8

2.2 DPC4 m RNA在正常牙齦組織和牙齦癌組織中的表達(dá) 正常牙齦組織、高分化、中分化和低分化組牙齦癌組DPC4 mRNA相對表達(dá)量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。牙齦癌組織DPC4 mRNA表達(dá)明顯低于正常牙齦組織（P＜0.05），中分化組和低分化組均低于高分化組（P＜0.05）。見表2。

3 討論

牙齦癌是常見的口腔頜面部惡性腫瘤之一，絕大多數(shù)為高分化的鱗狀上皮細(xì)胞癌，目前其分子生物學(xué)行為機(jī)制還不是很清楚。對于牙齦癌的治療目前以手術(shù)切除為主。但手術(shù)治療會(huì)造成患者顏面部的缺損和畸形，給患者生理和心理上帶來極大的痛苦。因此研究與牙齦癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)將有助于合理應(yīng)用綜合性治療方法，提高患者的生存率及生存質(zhì)量。

表2 不同分化類型牙齦癌組織中　DPC4蛋白和　mRNA表達(dá)（±s）

表2 不同分化類型牙齦癌組織中　DPC4蛋白和　mRNA表達(dá)（±s）

與正常牙齦組比較：*P＜0.05；與高分化組比較：#P＜0.05；與中分化組比較：△P＜0.05

組別　n　蛋白mRNA正常牙齦8　21.64±3.17　1.00±0.00高分化　15　13.47±1.25*　0.74±0.10*中分化　10　9.33±1.00*#　0.51±0.03*#低分化　8　2.42±0.42*#△　0.33±0.02*#△

研究［5］顯示腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡和增殖失衡，腫瘤組織增殖較快，細(xì)胞凋亡減少。DPC4首次發(fā)現(xiàn)于胰腺癌［6-7］，其編碼的蛋白Smad-4是轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)傳導(dǎo)途徑的中心分子［8］，能調(diào)控細(xì)胞凋亡［9］。DPC4被認(rèn)為是一種重要的腫瘤抑制基因，在胰腺、膽道、結(jié)腸、子宮等部位腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［10-11］。但其在口腔鱗狀上皮癌中的表達(dá)改變目前報(bào)道不多。在口腔鱗狀上皮癌抑制基因中，標(biāo)記物很多，如p53、p16、PTEN等［12］。DPC4屬于Smad基因家族，所編碼的Smad蛋白可將TGF-β信號(hào)傳給轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，從而激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。DPC4基因失活可使TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路中斷，消除了TGF-β對細(xì)胞增殖的抑制，從而導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。目前，DPC4研究較多地集中于胰腺癌，在肺癌、白血病等亦有表達(dá)改變。

為探討DPC4在牙齦癌中的表達(dá)及與牙齦癌的關(guān)系，本研究將不同分化類型的牙齦癌作為研究對象，觀察DPC4在各型牙齦癌中的定性和定量表達(dá)情況。結(jié)果表明，DPC4蛋白在牙齦組織中的陽性細(xì)胞百分比明顯高于各種不同分化類型的牙齦癌組織，定量結(jié)果也表明DPC4在牙齦癌組織中表達(dá)降低。隨著分化程度降低，DPC4的表達(dá)率也隨之降低。分化程度越低，DPC4陽性細(xì)胞百分比越低，提示DPC4突變可能在牙齦癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本研究提示DPC4蛋白低表達(dá)可能和牙齦癌癌變有密切的關(guān)系，其機(jī)制可能是由于DPC4基因缺失或者突變失去了對TGF-β的調(diào)控作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡程序紊亂進(jìn)而發(fā)生腫瘤。

綜上所述，在臨床診療過程中，可以通過免疫組織化學(xué)法對牙齦組織中DPC4的表達(dá)進(jìn)行檢測，其結(jié)果可作為診斷牙齦癌的一項(xiàng)指標(biāo)。

［1］ 萬 艷，尚政軍.牙齦癌的流行病學(xué)危險(xiǎn)因素研究［J］.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（7）：402-4.

［2］ 李贊濱，孫大偉，邱法波，等.胰腺癌組織中MUC1和hTER 及DPC4的表達(dá)及意義［J］.中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2013，16 （11）：850-4.

［3］ 張 強(qiáng)，李金源.Bcl-2和DPC4與口腔癌關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2013，20（16）：28-9.

［4］ 孫大偉.MUC1、DPC4基因及端粒酶基因在胰腺癌中的表達(dá)及臨床意義［D］.青島大學(xué)，2013.

［5］ Bortner C D，Cidlowski JA.Ion channel and apoptosis in cancer ［J］.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2014，369（1638）：20130104.

［6］ Mullany L K，F(xiàn)an H Y，Liu Z，et al.Molecular and functional characteristics of ovarian surface epithelial cells transformed by KrasG12D and loss of Pten in amousemodel in vivo［J］.Oncogene，2011，30（32）：3522-36.

［7］ Shearn C T，Smathers R L，Stewart B J，et al.Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10（PTEN）inhibition by 4-hydroxynonenal leads to increased akt Activation in hepatocytes ［J］.Mol Pharmacol，2011，79（6）：941-52.

［8］ Chen H，Wang JW，Liu L X，et al.Expression and significance of transforming growth factor-βreceptor type II and DPC4/Smad4 in non-small cell lung cancer［J］.Exp Ther Med，2015，9（1）：227-31.

［9］ Martis R J，Krishnan M M，Chakraborty C，et al.Automated screening of arrhythmia using wavelet based machine learing techniques［J］.JMed Syst，2012，36（2）：677-88.

［10］Liu L，Nie J，Chen L，et al.The oncogenic role ofmicroRNA-130a/301a/454 in human colorectal cancer via targeting smad4 expression［J］.PLoSOne，2013，8（2）：e55532.

［11］陳晶晶，陳 柯，王曉秋，等.子宮內(nèi)膜樣腺癌中Id-1、Smad4和p21WAF1/CIP1蛋白及RNA的表達(dá)［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（1）：39-42.

［12］殷 操，黃榮彩，紀(jì)煥中，等.口腔癌及癌前病變中PTEN與CXCR4的蛋白表達(dá)及相關(guān)性研究［J］.廣東牙病防治，2015，23（2）：61-5.

Expression of deleted in pancreatic cancer 4 in gingival cancer

Zhang Qiang1，Liu Jigang2，Yang Guohai3，et al
（1Dept of Dentist，Affiliated Hospital of North China University of Sciences and Technology，Tangshan 063000；2Dept of Dentist，Zunhua People’s Hospital，Zunhua 064200；3Dept of Dentist，Branch of Tangshan Worker Hospital，Tangshan 063000）

To observe the expression of DPC4 in gingival cancer tissue，the expression of protein andmRNA in 33 cases of gingival cancer and 8 cases of normal gum tissuewere investigated by immunohistochemistry and Real-time PCR.Results showed that the positive cell rate of DPC4 in gingival cancer was lower than that in normal gum tissue.The expression of DPC4 and the expression ofmRNA protein showed significant differences in well-differentiated，moderately differentiated，poorly differentiated gingival cancer and normal gum tissue（P＜0.05）.The expression of DPC4 in normal gum tissue is significantly higher than that in various differentiation types of gingival cancer tissue.

DPC4；gingival cancer；immunohistochemistry；Real-time PCR

R 780.2

A

1000-1492（2016）04-0598-03

2016-01-18接收

河北省2015年度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：20150087）

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院1口腔科、5神經(jīng)內(nèi)科，唐山063000
2遵化市人民醫(yī)院口腔科，遵化 0642003唐山工人醫(yī)院分院口腔科，唐山 0630004華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，唐山 063000

張 強(qiáng)，男，碩士，副主任醫(yī)師；
劉 昊，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：liuhao938@163.com