李光耀，莢衛(wèi)東，程 亞，盛須仁

CNTN-1表達在肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)中的預(yù)測價值

李光耀，莢衛(wèi)東，程 亞，盛須仁

目的 探討神經(jīng)黏附分子接觸蛋白-1（CNTN-1）在原發(fā)性肝細胞性肝癌（肝癌）根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)中的預(yù)測價值。方法 應(yīng)用免疫組化法研究90例肝癌組織和癌旁組組中CNTN-1的表達。分析CNTN-1與肝癌臨床病理特征及術(shù)后早期復(fù)發(fā)的關(guān)系。結(jié)果 CNTN-1在肝癌組織中表達明顯高于癌旁組織（P＜0.01）。CNTN-1表達與腫瘤直徑、有無完整包膜和TNM分期相關(guān)（P＜0.05）。單因素Logistic回歸分析表明CNTN-1、腫瘤大小、有無完整包膜、微血管侵犯、甲胎蛋白（AFP）、Edmondson分級和TNM分期與肝癌根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)密切相關(guān)；多因素Logistic回歸分析表明CNTN-1高表達是肝癌根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)的獨立危險因素。結(jié)論 CNTN-1的高表達是肝癌根治術(shù)后早期復(fù)發(fā)的潛在預(yù)測因子。

肝癌；CNTN-1；早期復(fù)發(fā)

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-3-8 8：29：02 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.060.htm l

原發(fā)性肝細胞性肝癌（簡稱肝癌）是世界范圍內(nèi)第五大常見惡性腫瘤，其死亡率在癌癥相關(guān)死因中位列第三，5年生存率僅為10%［1-2］。雖然肝切除是目前治療早中期肝癌最有效的手段，但術(shù)后約50%的患者2年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者長期生存率較低［3］。因此尋找特異性腫瘤標志物對預(yù)測肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)和改善患者預(yù)后具有重要價值。神經(jīng)黏附分子接觸蛋白-1（contactin 1，CNTN-1）是免疫球蛋白超家族成員之一，在調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突生長、突觸形成等方面發(fā)揮重要作用［4-5］。但CNTN-1在肝癌組織中的表達情況及其與臨床意義尚不清楚。該研究采用免疫組化法檢測CNTN-1在肝癌組織和癌旁組織中的表達，分析CNTN-1與肝癌臨床病理特征、術(shù)后早期復(fù)發(fā)的關(guān)系。為肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)高危患者的鑒別提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病理標本 肝癌標本均取自2006年1月～2010年12月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院肝臟外科收治經(jīng)術(shù)后病理證實為肝癌組織及相應(yīng)的癌旁組織（距離癌組織＞2cm的肝臟組織）的石蠟標本90例，隨訪截止至2013年12月，所有患者術(shù)前術(shù)后未行放療、化療、介入等抗癌治療。肝癌根治術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)的為早期復(fù)發(fā)，2年以上未復(fù)發(fā)為非早期復(fù)發(fā)［6］。其中男83例，女17例；年齡19～74（54.30 ±10.90）歲，＜60歲56例，≥60歲34例；腫瘤?＜5 cm 28例，≥5 cm 62例；病理學(xué)組織學(xué)分型：高分化44例，中低分化46例。腫瘤分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）TNM分期手冊第七版［7］。

1.2 主要試劑 鼠抗人CNTN-1單克隆抗體購自英國Abcam公司；相應(yīng)二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法 采用免疫組化法檢測CNTN-1蛋白的表達。連續(xù)組織切片（4μm）經(jīng)二甲苯脫蠟、枸櫞酸鹽（pH 6.0）微波抗原修復(fù)后3%去離子過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加一抗CNTN-1（濃度1∶500），4℃過夜。復(fù)溫后滴加二抗，DAB顯色。最后蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。由兩位未參與實驗、經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師對切片進行半定量評分，評分標準：每張切片在400倍顯微鏡下隨機選取5個視野，每個視野記數(shù)200個細胞，根據(jù)染色細胞所占百分率評分：無明顯細胞著色為0分；1%～10%細胞著色為1分；10%～30%細胞著色為2分；＞30%細胞著色為3分。再根據(jù)染色強度評分：未顯色或顯色不清為0分；淺黃色為l分；棕黃色為2分；深褐色為3分。每張切片最終得分為染色百分率和染色強度平均分數(shù)的乘積，得分≥3分者即定為高表達，得分＜3分者即定為低表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行分析，連續(xù)資料以±s表示。分類變量采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。單因素和多因素的Logistic回歸分析用于尋找影響肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的因素。將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入到多因素分析。在Logistic回歸基礎(chǔ)上使用受試者工作特征曲線（ROC）分析判斷各種危險因子預(yù)測肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織及癌旁組織中CNTN-1的表達 免疫組化結(jié)果顯示CNTN-1主要定位于細胞質(zhì)，見圖1。CNTN-1在90例肝癌和癌旁組織中的高表達率分別為54.4%（49/90）和12.2% （11/90），兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.718，P=0.01）。

圖1 CNTN-1在肝癌和癌旁組織中的表達 DAB染色A：CNTN-1在肝癌組織中的陽性表達；B：CNTN-1在癌旁組織中的陰性表達；1：×100；2：×400

2.2 CNTN-1的表達與肝癌臨床病理參數(shù)及早期復(fù)發(fā)的關(guān)系 CNTN-1在肝癌組織中的高表達與更大的腫瘤直徑（P=0.004）、無完整包膜（P＜0.001）、更晚的TNM分期（P＜0.001）和術(shù)后早期復(fù)發(fā)（P＜0.000）顯著相關(guān)。而CNTN-1的表達與年齡、性別、腫瘤分化程度、微血管侵犯、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、乙肝表面抗原、肝硬化及Child分級均無關(guān)。見表1。

2.3 早期復(fù)發(fā)相關(guān)因素的logistic回歸分析 為了尋找肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的影響因素，本研究對相關(guān)因素進行了Logistic回歸分析。在單因素分析中，較大的腫瘤直徑、無完整包膜、微血管侵犯、更高的AFP水平、更高的Edmondson分級、更晚的TNM分期、CNTN-1的高表達是肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的危險因子。見表2。在多因素分析中，微血管侵犯、更晚的TNM分期及CNTN-1的高表達是肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的獨立危險因子。見表3。

2.4 早期復(fù)發(fā)相關(guān)因素的ROC曲線分析 分別對肝癌患者各個臨床病例特征和CNTN-1表達做ROC曲線分析，結(jié)果表明腫瘤大小、有無完整包膜、微血管侵犯、AFP、Edmondson分級、TNM分期、CNTN-1表達的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.637、0.721、0.645、0.622、0.616、0.749、0.715。接著將各個臨床病理特征聯(lián)合做ROC曲線分析，AUC為0.849。最后將所有臨床病理特征與CNTN-1表達聯(lián)合做ROC曲線分析，AUC為0.870。見表4、圖2。

表1 CNTN-1表達與肝癌臨床病理特征及術(shù)后早期復(fù)發(fā)的相關(guān)性（n）

3 討論

本研究通過免疫組化法檢測了CNTN-1蛋白在90例原發(fā)性肝癌患者癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達情況，結(jié)果表明CNTN-1在肝癌組織中呈高表達，并且在肝癌組織中的表達與腫瘤直徑、有無完整包膜和TNM分期顯著相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤分化程度、微血管侵犯、AFP、乙肝表面抗原、肝硬化及Child分級均無關(guān)。重要的是 CNTN-1的高表達與肝癌患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)密切相關(guān)，并且是肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的獨立危險因子。該研究結(jié)果提示CNTN-1與肝癌的侵襲能力及術(shù)后早期復(fù)發(fā)存在一定的相關(guān)性，可能成為預(yù)測肝癌患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)和評估預(yù)后的有效指標。

研究［8］顯示CNTN-1在胃癌中的mRNA和蛋白水平均明顯增高，其高表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴管侵犯密切相關(guān)。與胃癌中研究結(jié)果一致，Liu etal［9］發(fā)現(xiàn)CNTN-1在食管癌組織中mRNA和蛋白表達水平均明顯高于癌旁組織。并且，CNTN-1的高表達與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴管侵犯密切相關(guān)。研究［10-11］顯示CNTN-1在肺癌組織中呈高表達狀態(tài)，并且與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究也顯示CNTN-1蛋白在肝癌組織中呈高表達狀態(tài)，并且與腫瘤的侵襲性臨床病理特征如無完整包膜、更大的腫塊直徑、更晚的TNM分期顯著相關(guān)，表明其在肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色。

表2 肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)相關(guān)因子的單因素Logistic回歸分析

表3 肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)相關(guān)因子的多因素Logistic回歸分析

表4 肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)相關(guān)因子的　ROC曲線分析

圖2 Logistic回歸分析基礎(chǔ)上使用　ROC曲線比較CNTN-1與臨床病理危險因素預(yù)測肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的準確性

研究［12］表明，CNTN-1在口腔鱗癌的表達與患者術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。然而CNTN-1的表達與肝癌復(fù)發(fā)的關(guān)系國內(nèi)外尚未見報道，因此，本研究采用了Logistic回歸分析來判斷CNTN-1表達與肝癌患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)的關(guān)系。單因素分析表明更大的腫瘤直徑、無完整包膜、微血管侵犯、更高的AFP水平、更高的Edmondson分級、更晚的TNM分期、高表達的CNTN-1是肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的危險因子。多因素分析進一步表明微血管侵犯、更晚的TNM分期及CNTN-1的高表達是肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的獨立危險因子。為進一步證實CNTN-1預(yù)測肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的可靠性，在Logistic回歸基礎(chǔ)上使用ROC曲線構(gòu)建了包括CNTN-1表達、單個臨床病理特征、各臨床病理特征聯(lián)合及臨床病理特征聯(lián)合CNTN-1表達在內(nèi)的9個模型。結(jié)果顯示CNTN-1表達聯(lián)合所有臨床病理特征有更大的AUC，表明此模型在預(yù)測肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)中可靠性更強。CNTN-1與肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)密切相關(guān)，進一步揭示了CNTN-1基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。本研究為肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的預(yù)測及早期干預(yù)治療提供了新的思路。然而，CNTN-1促進肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的具體機制尚不清楚，需要進一步深入研究。

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stage.Multivariate analysis identified CNTN-1 was an independent risk factor for early recurrence of HCC after hepatectomy.Conclusion High expression of CNTN-1 is a potentialpredictive factor for early recurrence of HCC after hepatectomy.
Key wordshepatocellular carcinoma；CNTN-1；early recurrence

Predictive value of CNTN-1 expression in early recurrence of hepatocellular carcinoma after hepatectom y

LiGuangyao，JiaWeidong，Cheng Ya，et al
（Dept of General Surgery，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

Objective To investigate the predictive value of CNTN-1 expression in early recurrence of hepatocellular carcinoma（HCC）after hepatectomy.Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of CNTN-1 in tumor tissues and adjacent non-tumor tissues from 90 HCC patients.The relationships of CNTN-1 expression with clinicopathological parameters and early postoperative recurrence were evaluated.Resu lts CNTN-1 expression was significantly higher in tumor tissues than that in adjacentnon-tumor tissues（P＜0.01）.Besides，CNTN-1 expression was significantly associated with tumor size，tumor capsula，and tumor-node-metastasis（TNM）stage.Univariate logistic regression analysis indicated that early postoperative recurrence of HCC was significantly correlated with CNTN-1，tumor size，tumor capsula，vascular invasion，serum AFP，Edmondson grade，and TNM

R 735.7

A

1000-1492（2016）04-0587-05

2016-01-08接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81172364）；安徽省科技攻關(guān)項目（編號：1301042199）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普外科，合肥 230001

李光耀，男，碩士研究生；
莢衛(wèi)東，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：jwd2013@126.com