宮阿娟，李素梅，王 維

日本血吸蟲感染對小鼠胰島素抵抗作用的研究

宮阿娟1，李素梅1，王 維2

目的 探討日本血吸蟲感染對高脂飲食小鼠肝臟組織胰島素抵抗的作用及其機制研究。方法 36只雄性C57BL/6J小鼠，隨機均等分為正常對照組（NC組）、高脂飲食組（HF組）及高脂飲食復(fù)合日本血吸蟲感染組（HSJ組）。分別在高脂飼養(yǎng)第6、12周末檢測空腹血糖（FBG）、空腹血漿胰島素（FINS）水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）；ELISA法檢測血清干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）水平變化，免疫組化法檢測肝臟組織信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子-4 （STAT4）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子-6（STAT6）蛋白表達情況。結(jié)果 感染第6、12周末，HF組HOMA-IR高于NC組（P＜0.01）；感染第12周末，HSJ組HOMA-IR明顯低于 HF組（P＜0.05）；感染第6、12周末，HSJ組IL-4高于NC組及HF組（P＜0.05）；感染第12周末，HSJ組STAT6高于HF組（P＜0.05）；感染第6、12周末，HF組STAT4高于NC組（P ＜0.05）。結(jié)論 血吸蟲慢性感染可改善肥胖小鼠胰島素抵抗，可能與誘導(dǎo)肝臟組織高度表達STAT6及分泌IL-4有關(guān)，為防治糖尿病提供新思路。

日本血吸蟲；胰島素抵抗；STAT4；STAT6

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-3-8 8：29：01 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.004.htm l

慢性炎癥是肥胖、2型糖尿病及其并發(fā)癥共同發(fā)病的基礎(chǔ)［1］。內(nèi)臟脂肪組織中的免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在炎癥早期階段起著關(guān)鍵作用，其可調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞進入內(nèi)臟脂肪組織中，進而調(diào)節(jié)胰島素敏感性的變化［2］。輔助性T細(xì)胞（T helper cells，Th細(xì)胞）在不同的環(huán)境刺激下可主要分化為兩大極化類型：Th1和Th2。Th1細(xì)胞及Th1分泌的細(xì)胞因子干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的降低，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Th2及其分泌因子白介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-10、IL-13的增加可改善肥胖個體的胰島素敏感性［3］。同時信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（singaltransductor and activator of transcription，STAT）調(diào)節(jié)Th細(xì)胞的分化。轉(zhuǎn)錄因子STAT4的活化有促炎作用、誘導(dǎo)、促使 IFN-γ的轉(zhuǎn)錄和表達的作用，轉(zhuǎn)錄因子STAT6有抗炎及誘導(dǎo)IL-4的轉(zhuǎn)錄及表達作用［4］。而慢性血吸蟲感染可促使組織Th細(xì)胞向Th2細(xì)胞方向分化，抑制炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)出對機體的保護作用。該研究通過建立高脂飲食的肥胖小鼠，觀察血吸蟲感染急性期和慢性期對小鼠肝組織IL-4、IFN-γ和STAT4、STAT6表達的影響，探討血吸蟲感染急性期和慢性期對肥胖小鼠肝臟胰島素抵抗影響的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組 3周齡C57BL/6J雄性小鼠36只，清潔級，10.2～15.2 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。所有動物經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組（NC組）12只，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料；高脂飲食組（HF組）12只，給予高脂飼料（基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上添加15%蔗糖、15%熟豬油、2%膽固醇、0.3%膽鹽，安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心動物房提供）；高脂飲食復(fù)合日本血吸蟲感染組（HSJ組）12只，由安徽醫(yī)科大學(xué)病原教研室提供的日本血吸蟲尾蚴感染小鼠腹部皮膚，同時給予高脂飼料。

1.1.2 標(biāo)本的收集建模 第6、12周，采用10%的水合氯醛（0.003 5 ml/g）腹腔注射麻醉，眼球摘除法收集血液，斷頸后解剖小鼠腹部取其肝臟組織，部分于4%多聚甲醛溶液固定，其余肝組織放凍存管中于-80℃冰箱保存。

1.1.3 主要試劑及儀器 血糖儀（德國羅氏公司）；血漿胰島素（fasting plasma insulin，F(xiàn)INS）試劑盒（北京北方研究所）；IFN-γ、IL-4檢測試劑盒、STAT4及STAT6兔抗小鼠一抗、檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司）；二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 檢測指標(biāo)及方法 測定空腹血糖（fasting peripheral blood glucose，F(xiàn)BG）及FINS并計算胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，HOMA-IR）。小鼠隔夜禁食不禁水，剪尾，測FBG；眼球摘除法收集的血液，常溫下在離心管中3 500 r/min離心10 min，收集血清，放射免疫法檢測空腹胰島素，并計算HOMA-IR。HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS （μIU/m l）/22.5［5］；ELISA法測定IL-4、IFN-γ，采用酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光度值；免疫組化法測定肝臟組織STAT4和STAT6的表達，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，3～5μm組織切片，一抗孵育過夜（STAT4、STAT6一抗，抗體濃度均為1∶100），DAB顯色。每張切片，在鏡下（×400）隨機選 5個不同視野，拍照，采用Image-Pro Plus 6軟件對圖像進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，計量資料采用±s表示。兩組間比較采用獨立樣本的t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況 感染第6周末，隨機從每組小鼠選取6只，其中HSJ組1只小鼠感染未成功，淘汰出組；在第7周，NC組小鼠死亡1只；第10周，HSJ組小鼠死亡1只。故12周末時，NC組5只小鼠，HF組6只小鼠，HSJ組5只小鼠。

2.2 各組小鼠體重、FBG、FINS、HOM A-IR的水平變化 第6周末：HF組及HSJ組小鼠體重較NC組增加20%，肥胖小鼠模型造模成功；HF組體重（t =5.169，P＜0.01）、HOMA-IR（t=5.963，P＜0.01）及FINS（t=15.421，P＜0.01）較NC組升高；HSJ組體重（t=3.278，P＜0.05）、HOMA-IR（t=5.856，P ＜0.01）及FINS（t=15.421，P＜0.01）較NC組升高；第12周末：HF組體重（t=7.538，P＜0.01）、FINS（t=8.216，P＜0.01）、HOMA-IR（t=5.132，P ＜0.01）均較同期NC組明顯升高；HSJ組體重（t= -4.169，P＜0.01）、FINS（t=-4.696，P＜0.01）、FBG（t=-3.486，P＜0.05）、HOMA-IR（t=-2.889，P＜0.05）較同期HF組明顯下降。見表1。

2.3 各組小鼠血清IL-4、IFN-γ、IFN-γ/IL-4 第6周末：HSJ組IL-4（t=8.776，P＜0.01）、IFN-γ（t= 12.009，P＜0.01）較NC組升高；HF組IFN-γ（t= 11.940，P＜0.01）較NC組升高；HSJ組IL-4（t= 6.467，P＜0.01）較HF組升高；第6周末，NC組及HSJ組傾向于Th2方向免疫應(yīng)答，HF組傾向于Th1方向免疫應(yīng)答。第12周末：HF組IFN-γ（t= 10.241，P＜0.01）、IL-4（t=5.285，P＜0.05）均較NC組升高；HSJ組IFN-γ（t=13.111，P＜0.01）、IL-4（t=12.788，P＜0.01）均較NC組升高；HSJ組IL-4 （t=6.780，P＜0.01）較HF組升高。見表2。

2.4 各組小鼠肝組織STAT4、STAT6蛋白表達

第6周末：HF組STAT4蛋白表達（t=10.729，P＜0.01）、STAT6蛋白表達（t=11.436，P＜0.01）均高于NC組；HSJ組STAT4蛋白表達（t=7.317，P＜0.01）、STAT6蛋白表達（t=9.933，P＜0.01）均高于NC組；HF組STAT4蛋白表達較HSJ組STAT4蛋白表達升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；HSJ組STAT6蛋白表達較HF組升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

第12周末：HF組STAT4（t=4.355，P＜0.05）、STAT6蛋白表達（t=9.296，P＜0.01）較NC組升高；HSJ組STAT4（t=5.292，P＜0.01）、STAT6蛋白表達（t=7.680，P＜0.01）較NC組升高；HF組STAT4蛋白表達較HSJ組STAT4蛋白表達升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；HSJ組STAT6蛋白表達（t= 2.822，P＜0.05）較HF組升高；HSJ組STAT6蛋白表達較第6周末STAT6蛋白表達升高（t=2.700，P ＜0.05）。見表3、圖2。

表1 第6、12周末各組小鼠體重、FBG、FINS及　HOMA-IR的比較（n=6±s）

表1 第6、12周末各組小鼠體重、FBG、FINS及　HOMA-IR的比較（n=6±s）

與同期　NC組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與同期HF組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與第6周末各組之間比較：△P＜0.05，△△P＜0.01

組別　第6 第12 HOMA-IR NC　20.05±2.31　8.23±1.04　10.20±2.54　2.98±1.11　25.30±2.01△　7.23±1.19　10.87±3.58　3.78±1.29周末體重（g）　FBG（mmol/L）FINS（μIU/ml）HOMA-IR周末體重（g）　FBG（mmol/L）　FINS（μIU/ml）HF　25.98±1.60**9.02±1.65　28.05±1.26**9.55±2.46**　34.29±2.12**△△　9.87±1.68*　44.86±9.48**△△15.86±5.62**HSJ　24.99±2.88*　8.93±1.29　22.35±6.05**7.27±1.41*　27.94±3.07##　7.02±1.09#△　23.78±5.57*##　8.68±2.34*#

表2 3組小鼠IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4動態(tài)比較（±s）

表2 3組小鼠IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4動態(tài)比較（±s）

與同期　NC組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與同期　HF組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與第6周末各組之間比較：△P＜0.05

組別　第6 第12 24　63.06±4.78　0.95±0.24 HF　76.61±3.99**　70.73±4.91*　1.10±0.07　86.76±5.12**△　79.23±5.26**△　1.06±0.13 HSJ　87.05±6.46**#　93.24±6.97*##　0.93±0.20　92.32±4.98**　101.42±5.58**##/IL-4 NC　51.53±3.28　55.31±8.02　0.91±0.16　57.31±4.周末IFN-γ　IL-4　IFN-γ/IL-4周末IFN-γ　IL-4　IFN-γ 0.91±0.17

表3 各組小鼠　STAT4、STAT6動態(tài)比較（±s）

表3 各組小鼠　STAT4、STAT6動態(tài)比較（±s）

與同期NC組比較：*P＜0.05；與同期　HF組比較：#P＜0.05；與第6周末各組之間比較：△P＜0.05

組別STAT4 第6周末　第12周末STAT6 第6周末　第12周末NC　0.41±0.04　0.40±0.03　0.39±0.03　0.40±0.04 HF　1.09±0.15*　1.28±0.32*　1.15±0.16*　1.17±0.18*HSJ　0.99±0.19*　1.09±0.29*　1.17±0.19*　1.63±0.35*#△

圖1 第6周末免疫組化法檢測小鼠肝組織STAT4、STAT6蛋白表達 ×400A：陰性對照組；B：NC組；C：HF組；D：HSJ組；1：STAT4蛋白表達；2：STAT6蛋白表達；Ⅰ：HE染色；Ⅱ：DAB染色

圖2 第12周末免疫組化法檢測小鼠肝組織STAT4、STAT6蛋白表達 ×400A：陰性對照組；B：NC組；C：HF組；D：HSJ組；1：STAT4蛋白表達；2：STAT6蛋白表達；Ⅰ：HE染色；Ⅱ：DAB染色

3 討論

Th細(xì)胞大致可分為兩大細(xì)胞亞群：促炎癥性細(xì)胞（Th1和Th17）及抗炎癥性細(xì)胞（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th2細(xì)胞）［6］。T細(xì)胞在維持機體內(nèi)環(huán)境平衡及避免炎癥性疾病發(fā)病中起著重要作用。2型糖尿病出現(xiàn)炎癥狀態(tài)主要由于T細(xì)胞亞群的失衡造成的，表現(xiàn)為機體內(nèi)Th1及Th17細(xì)胞的數(shù)量增加，Th細(xì)胞及Th2細(xì)胞數(shù)量減少，從而促進機體慢性炎癥及胰島素抵抗的發(fā)展［7］。2型糖尿病患者體內(nèi)產(chǎn)生大量的IFN-γ及少量的IL-4，同時顯示患者體內(nèi)的促炎性T細(xì)胞是增加的，而抗炎性T細(xì)胞是減少的［8］。肥胖伴胰島素抵抗模型的2型糖尿病鼠體內(nèi)的T細(xì)胞失衡，表現(xiàn)為脂肪組織的Th細(xì)胞及Th2細(xì)胞與正常鼠比較數(shù)量大量減少，同時肥胖鼠脂肪組織中的IFN-γ是升高的，IL-4降低［9］。本研究顯示，第6、12周末HF組IFN-γ、HOMA-IR較NC組升高。第6、12周末HF組IFN-γ/IL-4較NC組升高。以上研究表明2型糖尿病肥胖小鼠內(nèi)高度表達促炎因子且傾向于Th1免疫應(yīng)答，從而促進胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。

小鼠感染曼氏血吸蟲后，其肝臟傾向于Th2免疫應(yīng)答并分泌大量的Th2細(xì)胞因子，從而顯著減少由PPARα介導(dǎo)的檸檬酸循環(huán)、氧化磷酸化及脂肪酸氧化蛋白的生成［10］。哺乳動物感染蠕蟲后，在慢性感染期趨向于Th2免疫軸應(yīng)答，并通過驅(qū)動Th細(xì)胞產(chǎn)生IL-10及TGF-β抑制Th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答［11］。糖尿病小鼠感染日本血吸蟲后，其胰島素抵抗得到改善，其機制可能是通過升高IL-4及降低IFN-γ，調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫軸偏移，使其傾向于Th2免疫軸偏移有關(guān)［12］。STAT蛋白的激活調(diào)控T細(xì)胞的分化，JAK酪氨酸酶通過細(xì)胞因子或生長因子的作用使STAT蛋白磷酸化，磷酸化的STAT轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合DNA及激活轉(zhuǎn)錄二聚體，從而誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄［13］，從而具有誘導(dǎo)增殖、生長、細(xì)胞分化、凋亡、炎癥、細(xì)胞免疫等作用。IL-12可以通過STAT4途徑刺激Th1細(xì)胞分泌IFN-γ，IL-4通過STAT6途徑誘導(dǎo)Th2細(xì)胞的分化［14］。STAT4的活化具有促炎作用，STAT4決定Th0向Th1轉(zhuǎn)化，進而誘導(dǎo)、促使IFN-γ的轉(zhuǎn)錄和表達［15］。STAT6的活化有免疫調(diào)節(jié)、抑制免疫的作用，STAT6決定Th2細(xì)胞的極化，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子IL-4的表達［16］。本研究顯示第12周末HSJ組HOMA-IR較同期HF組降低。第6、12周末，HSJ組IL-4均較HF組及NC組升高；且第12周末HSJ組STAT6蛋白表達較HF組升高，并且本研究顯示在感染的12周末HSJ組的免疫應(yīng)答傾向于Th2軸。因此本研究與以上文獻均表明慢性血吸蟲感染期可能與誘導(dǎo)分泌IL-4的表達及促進肝臟組織表達STAT6蛋白有關(guān)，進而促進Th2細(xì)胞的分化來改善肥胖小鼠肝臟胰島素抵抗。

綜上所述，胰島素抵抗肥胖小鼠體內(nèi)Th細(xì)胞處于失衡狀態(tài)，血吸蟲感染急性期可能發(fā)揮促炎作用，而在血吸蟲感染慢性期Th細(xì)胞傾向于Th2免疫應(yīng)答，從而改善機體胰島素抵抗。STAT4及STAT6蛋白可調(diào)控 Th1/Th2的極化。血吸蟲感染慢性期可以通過誘導(dǎo)Th2分化、分泌IL-4及促進肝臟組織STAT6蛋白的表達進而改善機體胰島素抵抗及減輕小鼠體重，為開發(fā)改善胰島素抵抗的藥物提供新思路。

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Methods 36 male C57BL/6J mice were randomly assigned into three equal groups：normal control group（NC group），high-fat diet group（HF group）and high-fat diet with Schistosoma japonicum infected group（HSJ group）. Specimen was collected 6 and 12 weeks after high-fat diet，separately.The levels of fasting blood glucose（FBG），fasting plasma insulin resistance index（FINS）and insulin（HOMA-IR）were detected.Interferon-γ（IFN-γ），interleukin-4（IL-4）and singal transductor and activator of transcription-4（STAT4）singal transductor and activator of transcription-6（STAT6）were detected by ELISA and immunohistochemical method.Results The mice from HF group showed higher levels of HOMA-IR than those from NC groups by the end of 6 and 12 weeks after infection（P ＜0.01）；the levels of HOMA-IR in mice from HSJ group were lower than NC group and HF group by the end of 12 weeks（P＜0.05）；the levels of IL-4 in mice from HSJ group were higher than NC group and HSJ group by the end of 6 and 12 weeks after infection（P＜0.05）；the levels of STAT6 in mice from HSJ group were higher than HF group by the end of 12 weeks after infection（P＜0.05）；the levels of STAT4 in mice from HF group were higher than NC group by the end of 6 and 12 weeks after infection.Conclusion Schistosome japonicum chronic infection may improve insulin resistance in obese mice with induced STAT6 protein expressed in liver tissue and secrete IL-4，providing new ideas for the prevention and treatment of diabetes.

Schistosoma japonicum infection in obesemouse insulin resistance

Gong Ajuan1，Li Sumei1，Wang Wei2
（1Deptof Endocrinology，The Affiliated Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230001；2Dept of Parasitology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To investigate Schistosoma japonicum infection on mice high-fat diet of insulin resistance.

Schistosoma japonicum；insulin resistance；STAT4；STAT6

R 383.2

A

1000-1492（2016）04-0468-05

2015-11-21接收

安徽省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研基金（編號：13zc017）

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230001
2安徽醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室，合肥 230032

宮阿娟，女，碩士研究生；
李素梅，女，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mali：Lisumei0808@126.com