王文艷，徐彤彤，戴春光，白 準

瘦素預處理經(jīng)線粒體通路對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

王文艷1，2，徐彤彤2，戴春光3，白 準4

目的 探討在SD大鼠心肌缺血再灌注損傷（MIRI）中瘦素預處理經(jīng)線粒體信號通路對機體的影響及相關(guān)機制。方法 選取健康雄性成年SD大鼠50只，隨機分為缺血再灌注（IR）模型對照組（模型組，線栓法制作大鼠IR模型）、假手術(shù)組（僅開胸不作血管結(jié)扎）、IR瘦素預處理低、中、高劑量（20、50、100μg/kg）共5組，每組10只。各組大鼠經(jīng)缺血半小時再灌注24 h，觀察心肌HE染色病理形態(tài)學變化；ELISA法檢測血清中白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的含量；Western blot法檢測凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）、凋亡相關(guān)基因（Bax）的表達。結(jié)果 與模型組比較，假手術(shù)組及瘦素預處理組心肌病理學表現(xiàn)減輕，IL-6、TNF-α、mPTP及Bax表達顯著降低（P＜0.05），Bcl-2在瘦素預處理組中表達顯著增高，且在瘦素高劑量組中表達最高（P＜0.05），均無明顯劑量依賴性。結(jié)論 瘦素可緩解MIRI的炎癥反應(yīng)及mPTP的開放，并促進線粒體通路相關(guān)蛋白Bcl-2上調(diào)，使Bax蛋白的表達下調(diào)，從而保護心肌細胞減輕損傷。

瘦素預處理；心肌缺血再灌注損傷；線粒體通路

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-3-8 8：29：01 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.010.htm l

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）時所釋放的損傷因子對線粒體產(chǎn)生破壞，促使線粒體變形、破損、基質(zhì)外流，導致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的開放增多及相關(guān)凋亡蛋白如B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、凋亡相關(guān)基因（Bax）等的釋放，從而對機體造成損傷［1］。近年來mPTP與MIRI之間的關(guān)系已成為各學者的研究熱點。瘦素已被證實與MIRI之間存在著重要的聯(lián)系，但瘦素在MIRI中對線粒體通路的影響尚需要進一步研究［2］。該研究旨在建立大鼠心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）模型，并術(shù)前予以不同劑量瘦素進行處理，觀察心肌組織病理情況，并測定血清白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及mPTP的變化及心肌Bcl-2、Bax的表達，為改善MIRI提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 SD成年雄性大鼠50只，約250 g，購自桂林醫(yī)學院實驗動物房。將50只大鼠隨機分為IR模型對照（模型組）、假手術(shù)組、IR瘦素低劑量預處理（低劑量組）、IR瘦素中劑量預處理（中劑量組）、IR瘦素高劑量預處理（高劑量組），每組各10只。

1.2 主要試劑和儀器 重組大鼠瘦素（美國R&D Systems公司）；IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒（北京奧博森生物科技有限公司）；mPTP酶聯(lián)免疫試劑盒（上海銘睿生物科技有限公司）；Bcl-2、Bax及GAPDH抗體（中國萬類生物公司）。儀器包括低溫及高速離心機、小動物專用呼吸機、動物心電圖儀、超低溫冰箱、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、Leica正置顯微鏡、酶標儀等。

1.3 方法

1.3.1 MIRI模型的制備 各組大鼠術(shù)前禁食禁飲12 h，MIRI模型的制備采用線扎大鼠的冠狀動脈左前降支。瘦素預處理組在術(shù)前30 min按濃度分組進行腹腔注射重組大鼠瘦素，予以濃度3 mg/kg水合氯醛腹腔注射進行麻醉后將大鼠固定于手術(shù)臺上，四肢接動物心電圖儀，觀察術(shù)前心電圖Ⅱ?qū)?lián)變化。取頸部及胸前區(qū)進行備皮，作頸部豎切口，鈍性分離頸部肌肉暴露氣管，用蝶形靜脈留置針刺入氣管并拔出針芯后接小動物專用呼吸機（呼吸頻率60 次/min，呼吸比2∶1，潮氣量約16 m l），監(jiān)測心電圖穩(wěn)定后進行開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支。胸部作胸骨左緣豎形切口，鈍性分離胸前區(qū)肌肉及第2～3肋骨間隙，暴露心臟。使用眼科鑷提起心包膜，剪破心包膜并使用小拉鉤分離心包膜于切口兩側(cè)，用濕棉簽輕壓心臟向前右旋轉(zhuǎn)至可見左心耳。于左心耳下約2 mm處使用無創(chuàng)小圓針在左前降支血管處進針，深度約1 mm，留置硅膠管后留線結(jié)扎。心肌缺血模型成功標志：肉眼可見所扎血管心肌部分顏色改變?yōu)榘导t、蒼白或腫脹，心電圖Ⅱ?qū)?lián)可見心率較前減慢或出現(xiàn)心律失常，并可見ST段較前明顯抬高。缺血30 min后，拔出硅膠管，留線縫合胸壁及胸前皮膚。假手術(shù)組僅穿針過冠狀動脈左前降支留線不進行結(jié)扎。

1.3.2 心肌組織病理切片 取部分左心室肌，用冰生理鹽水沖洗后于10%多聚甲醛溶液固定，并石蠟包埋、切片、HE染色，最后于Leica正置顯微鏡下觀察各組心肌的病理學變化。

1.3.3 ELISA法檢測血清中IL-6、TNF-α及mPTP的表達 再灌注后取各組大鼠股動脈血約5 m l于肝素抗凝管中，置低溫離心機中以3 000 r/min離心5 min，分離血清于EP管中，并置于-80℃冰箱保存待測，各組檢測均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 Western blot法檢測心肌中Bcl-2和Bax蛋白表達的變化 取超低溫冰箱下凍存心肌60 mg搗碎后提取每組心肌組織總蛋白，應(yīng)用BCA法進行蛋白定量，以每泳道20μg上樣量進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)上PVDF膜，常溫下封閉1 h，加Bcl-2和Bax（1∶1 000稀釋）一抗，4℃孵育過夜后使用TBST洗膜，按1∶10 000稀釋相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h再使用TBST洗膜后，用化學發(fā)光法顯影檢測目的蛋白的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行分析，計量資料以±s表示。多組間比較使用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織HE染色 假手術(shù)組HE染色顯示心肌纖維排列規(guī)整，呈束狀，無紅細胞滲出及炎癥細胞浸潤；模型組再灌注后可見心肌纖維排列紊亂，部分胞核消失，出現(xiàn)大量泡沫細胞及紅細胞滲出，有炎癥細胞浸潤現(xiàn)象；瘦素處理組與模型組比較，可見泡沫細胞減少，心肌纖維排列紊亂減輕，組織間質(zhì)增寬，但紅細胞滲出少。見圖1。

2.2 血清IL-6、TNF-a及m PTP的表達 與假手術(shù)組比較，余4組IL-6、TNF-α、mPTP水平均表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，瘦素預處理組IL-6、TNF-α、mPTP水平均降低（P＜0.05），無劑量依賴性表現(xiàn)。見表1。

圖1 心肌染色結(jié)果 HE×200A：模型組；B：假手術(shù)組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組

表1 血清 IL-6、TNF-α、m PTP水平改變（n=10，±s）

表1 血清 IL-6、TNF-α、m PTP水平改變（n=10，±s）

與模型組比較：*P＜0.05；與假手術(shù)組比較：#P＜0.05

組別　IL-6（pg/m l）　TNF-α（pg/ml）　mPTP（pg/m l）模型　74.53±3.39#　81.43±3.49#　0.54±0.05#假手術(shù)　20.13±1.96　6.71±0.80　0.070±0.006低劑量　46.77±2.27*#　44.93±5.09*#　0.32±0.02*#中劑量　54.77±4.05*#　62.17±3.68*#　0.38±0.02*#高劑量　40.10±1.48*#　31.67±3.07*#　0.24±0.05*#F值152.48　198.68　78.51

2.3 心肌組織中Bcl-2和Bax的表達 與假手術(shù)組比較，低劑量組及高劑量組Bcl-2表達上調(diào)（P＜0.05），Bax在模型組及瘦素處理組中表達均上調(diào)；與模型組比較，Bcl-2在瘦素處理組中表達顯著上調(diào)，且在瘦素高劑量組中表達最高（P＜0.05）；Bax在瘦素預處理中表達顯著下調(diào)，且在瘦素高劑量組中表達最低（P＜0.05），均無明顯劑量依賴性。見圖2。

3 討論

研究［3-4］表明MIRI與細胞凋亡有重要的聯(lián)系，并發(fā)現(xiàn)線粒體功能的改變與細胞凋亡緊密相關(guān)，如線粒體釋放相關(guān)凋亡蛋白、氧自由基產(chǎn)生過多、胞質(zhì)鈣離子失衡等。在再灌注期會發(fā)生大量mPTP開放，因而在MIRI中mPTP對相關(guān)凋亡蛋白等因子的釋放起著關(guān)鍵作用［5］。線粒體通路引發(fā)的凋亡主要與Bcl-2和Bax蛋白有關(guān)，Bax是Bcl-2的同源二聚體，兩者均表達于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜。正常狀態(tài)下，當機體出現(xiàn)損傷時，Bcl-2可介導聚集核內(nèi)谷胱甘肽，抵消氧自由基的產(chǎn)生，并阻斷鈣離子通道對細胞進行保護，相反，Bax表達增高可促進細胞 凋 亡［6-7］。

瘦素與大鼠或小鼠MIRI存在密切聯(lián)系，在MIRI中，經(jīng)瘦素處理后影響超氧化物歧化酶1 （SOD1）、丙二醛（MDA）、IL-6、TNF-α等因子，通過減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷對機體進行保護［8-9］。研究［10］顯示磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸（蘇氨酸）蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路參與MIRI的調(diào)控，而Bcl-2/Bax是PI3K/Akt的下游信號蛋白，均參與線粒體通路，瘦素也被證實與PI3K/Akt信號通路有著密切聯(lián)系。

本研究在制作大鼠MIRI模型的前提下探討瘦素預處理經(jīng)線粒體通路對大鼠 MIRI的影響，結(jié)果顯示瘦素預處理組心肌病理學表現(xiàn)較模型組緩解，血清中炎性因子IL-6、TNF-α及mPTP表達降低，表明瘦素減輕了炎癥反應(yīng)并阻止了mPTP的開放，且促凋亡蛋白Bax表達下調(diào)，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達上調(diào)，從而顯示瘦素可能經(jīng)線粒體通路對大鼠MIRI起到了保護作用，但其相關(guān)機制的信號蛋白仍需進一步探究。

圖2 各組大鼠心肌組織中　Bcl-2、Bax蛋白的表達水平（n=10，±s）1：模型組；2：假手術(shù)組；3：低劑量組；4：中劑量組；5：高劑量組；與模型組比較：*P＜0.05；與假手術(shù)組比較：#P＜0.05

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Effects of leptin pretreatm ent via m itochondrial pathway on m yocardial ischem ia reperfusion injury in rats

Wang Wenyan1，2，Xu Tongtong2，Dai Chunguang3，et al
（1Grauate School of Guilin Medical University，GuiLin 541004；
2SpecialWards，3ICU，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，GuiLin 541001）

Objective To investigate the effect and relevantmechanism of leptin pretreatment via mitochondrialsignaling pathway on myocardial ischemia-reperfusion injury in SD rats.Methods 50 healthymale adult SD rats were randomly divided into 5 groups，model group（tomake ischemia-reperfusion model by suturemethod），sham group（thoracotomy without vascular ligation），the low，medium and high dose leptin pretreatment groups（20，50，100μg/kg，n=10）.After ischemia for 30 minutes and reperfusion for 24 hours，then to observe the pathological changes of cardiac HE staining in rats；using ELISA to test serum interleukin-6（IL-6），tumor-stimulating factorα（TNF-α）and mitochondrial permeability transition pore（mPTP）；to test the expression of Bcl-2 and Bax apoptotic proteins by Western blotmethod.Resu lts Compared with the model group，pathological characteristics of sham group and leptin preconditioning groups were improved；IL-6，TNF-α，mPTP and Bax expression was significantly decreased（P＜0.05）；in leptin pretreatmentgroups，Bcl-2 expression was significantly increased，especially in high dose leptin group（P＜0.05），and there was no obvious dose-dependence.Conclusion Leptin relieve inflammation and inhibitemPTP，up-regulate the expression of Bcl-2 and down-regulate the Bax，thereby protecte cardiomyocytes and mitigate damage on MIRI.

leptin pretreatment；myocardial ischemia reperfusion injury；mitochondrial pathway

R 541.4

A

1000-1492（2016）04-0481-04

2015-12-21接收

桂林市科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃課題（編號：20130120-1）；廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)研究與開發(fā)課題（編號：S201316-03）；廣西科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（編號：桂科能1598025-29）

1桂林醫(yī)學院研究生院，桂林 541004桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院2特需病區(qū)3重癥醫(yī)學科，桂林541001
4株洲市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科，株洲 412000

王文艷，女，碩士研究生；
徐彤彤，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：xutongtongguilin@163.com