高利芬 　夏志輝 　張繼　王道文　翟文學(xué)

(1江漢大學(xué) 系統(tǒng)生物學(xué)研究院， 武漢 430056； 2中國(guó)科學(xué)院 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所， 北京 100101；3海南大學(xué) 生命科學(xué)研究院， ?？?570228；*通訊聯(lián)系人， E-mail: wxzhai@genetics.ac.cn)

?

轉(zhuǎn)磷酸甘露糖變位酶基因提高水稻維生素C含量

高利芬1,2夏志輝2,3張繼1王道文2翟文學(xué)2,*

(1江漢大學(xué) 系統(tǒng)生物學(xué)研究院， 武漢 430056；2中國(guó)科學(xué)院 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所， 北京 100101；3海南大學(xué) 生命科學(xué)研究院， ?？?570228；*通訊聯(lián)系人，E-mail:wxzhai@genetics.ac.cn)

GAO Lifen, XIA Zhihui, ZHANG Ji, et al. Transgenosis of the phosphomannomutase transgene increases vitamin C content in rice. Chin J Rice Sci, 2016, 30(4): 441-446.

高利芬, 夏志輝, 張繼, 等. 轉(zhuǎn)磷酸甘露糖變位酶基因提高水稻維生素C含量. 中國(guó)水稻科學(xué)， 2016， 30(4)： 441-446.

摘要:維生素C (VC) 是人體健康所必需的營(yíng)養(yǎng)元素。人類(lèi)由于缺乏VC合成途徑中的最后一種酶(L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶)，自身不能合成VC。水稻是重要的糧食作物，增加水稻種子中VC含量，能夠提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。磷酸甘露糖變位酶(PMM)是VC合成通路中一種重要的酶，催化甘露糖-6-磷酸到甘露糖-1-磷酸的轉(zhuǎn)變。將水稻PMM基因(OsPMM)構(gòu)建在雙右邊界雙元載體pMNDRBBin6上，并用種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子BX14驅(qū)動(dòng)其表達(dá)。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，OsPMM基因被轉(zhuǎn)入粳型三系恢復(fù)系C418中。通過(guò)分子檢測(cè)，在T2代篩選到了無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)OsPMM基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)OsPMM基因在轉(zhuǎn)基因水稻種子內(nèi)的表達(dá)水平明顯提高，相應(yīng)地，轉(zhuǎn)基因系種子中的VC含量也提高了25%～50%。

關(guān)鍵詞:維生素C； 磷酸甘露糖變位酶； 雙右邊界雙元載體系統(tǒng)； 無(wú)選擇標(biāo)記； 轉(zhuǎn)基因系

維生素C(VC)又名抗壞血酸(L-ascorbic acid, AsA)，是動(dòng)植物體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，參與了人體的心血管功能、免疫細(xì)胞發(fā)育、結(jié)締組織和鐵離子的利用等生理進(jìn)程。植物和大多數(shù)動(dòng)物可以合成VC, 人類(lèi)由于缺乏VC合成途徑中的最后一種酶L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶(L-gulonolactone oxidase)，自身不能合成VC，加上VC不能在體內(nèi)長(zhǎng)期貯存，人類(lèi)必須每天從膳食中獲取足夠VC。

水稻是重要的糧食作物，增加水稻種子中VC含量，能夠提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。到目前為止，已經(jīng)在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多條VC生物合成途徑和一條循環(huán)利用途徑，其中VC生物合成途徑包括L-半乳糖(L-galactose)途徑(Wheeler-Smirnoff 途徑)[1-3]、L-古洛糖(L-gulose)途徑[4]、肌醇(myo-inositol)途徑[5]和D-半乳糖醛酸(L-galactonic acid)途徑[6]等。

通過(guò)對(duì)VC合成和代謝通路上的酶進(jìn)行基因操作，可以提高或降低植物體內(nèi)的VC水平。在土豆中的研究表明，反義抑制GDP-甘露糖焦磷酸化酶導(dǎo)致了VC含量的大幅下降[7]。在擬南芥中反義抑制L-半乳糖脫氫酶，在強(qiáng)光下生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植株的VC含量比野生型要降低很多[8]。在煙草中，抑制L-半乳糖醛酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶的活性，導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因株系VC含量較對(duì)照減少30%[9]。而Tokunaga等[10]在煙草懸浮細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)L-半乳糖醛酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶，使得總VC含量提高了2倍左右。不僅如此，一些研究還發(fā)現(xiàn)，在植物內(nèi)表達(dá)異源的VC合成或代謝通路上的酶，也能對(duì)VC的含量進(jìn)行調(diào)控。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)草莓的D-半乳糖醛酸還原酶導(dǎo)致VC的含量增加2～3倍[6]。L-古洛糖是動(dòng)物體內(nèi)VC合成的前體物質(zhì)，在萵苣和煙草中過(guò)量表達(dá)老鼠的古洛糖內(nèi)酯氧化酶使VC含量提高達(dá)7倍[11]；在擬南芥中表達(dá)此酶也使VC含量提高了3倍多[12]。脫氫抗壞血酸還原酶(Dehydroascorbate reductase，DHAR) 參與了VC在植物體內(nèi)的循環(huán)[13]，在煙草和玉米中過(guò)表達(dá)來(lái)自小麥的脫氫抗壞血酸還原酶，其表達(dá)水平在煙草和玉米中分別達(dá)到原來(lái)的32倍和100倍，相應(yīng)地，葉片和谷粒中的VC水平也提高了2～4倍[13]。

磷酸甘露糖變位酶(PMM)催化VC合成通路中甘露糖-6-磷酸到甘露糖-1-磷酸的轉(zhuǎn)化，此反應(yīng)是可逆的。對(duì)植物PMM的轉(zhuǎn)基因操作發(fā)現(xiàn)，在煙草葉片中抑制PMM的表達(dá)可導(dǎo)致煙草VC含量降低，而增加PMM在葉片中的表達(dá)能使VC含量提高20%～50%。在擬南芥中過(guò)表達(dá)擬南芥PMM也導(dǎo)致了VC含量提高25%～33%[14]。在煙草中過(guò)表達(dá)來(lái)自櫻桃的PMM基因，煙草的VC含量提高了兩倍，且VC含量的提高和PMM基因的轉(zhuǎn)錄水平和酶活性正相關(guān)[15]。

以上報(bào)道表明，增加植物體內(nèi)VC合成通路或循環(huán)通路中酶的表達(dá)，可以提高受體的VC含量。水稻是重要的糧食作物，暫未有通過(guò)基因工程提高水稻VC含量的報(bào)道。水稻PMM基因(OsPMM，LOC_Os04g58580)位于水稻第4染色體，基因組全長(zhǎng)3033 bp，cDNA全長(zhǎng)747 bp，編碼含249個(gè)氨基酸的磷酸甘露糖變位酶，催化VC合成通路中甘露糖-6-磷酸到甘露糖-1-磷酸的轉(zhuǎn)化，所催化的反應(yīng)是可逆的。

為了提高水稻種子的VC含量，本研究將OsPMM的全長(zhǎng)cDNA和種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子Bx14融合，構(gòu)建成了表達(dá)載體pDRBOsPMM。轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的骨架選擇的是雙右邊界雙元載體pMNDRBBin6，利用此載體，在轉(zhuǎn)基因系后代的分離過(guò)程中可以篩選到無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株，無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的分離步驟可參見(jiàn)Lu等[16]的報(bào)道。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將OsPMM整合到水稻雜交稻骨干親本C418中，在T2代篩選獲得了無(wú)選擇標(biāo)記且種子VC含量明顯提高的C418轉(zhuǎn)基因純合系。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因受體材料是生產(chǎn)中常用的粳型恢復(fù)系C418。之所以選擇C418，是因?yàn)镃418是秈型遺傳成分較高、形態(tài)偏秈且有特異親和力的粳型恢復(fù)系，是起著“秈粳架橋”作用的品種。 C418與粳稻雜交子一代結(jié)實(shí)正常，與秈稻雜交子一代結(jié)實(shí)率 40%～65%。經(jīng)與多個(gè)不育系配組, 其所配組合具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗倒、高光效、高結(jié)實(shí)率、高配合力等諸多特點(diǎn)，在生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[17]。

1.2質(zhì)粒構(gòu)建和水稻轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒pDRBOsPMM是將OsPMM的全長(zhǎng)cDNA序列和來(lái)自小麥高分子量麥谷蛋白(HMW glutenin)Glu-1B-1Bx基因的種子特異表達(dá)啟動(dòng)子Bx14融合構(gòu)建而成的雙元表達(dá)載體，由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所王道文研究員提供。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，OsPMM基因被轉(zhuǎn)入到C418品種中，水稻組織培養(yǎng)的方法參見(jiàn)Zhai等[18]的報(bào)道。

1.3轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)

在轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)到高分蘗期時(shí)，采集葉片分別提取DNA和RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)。DNA提取采用CTAB法；RNA的提取采用Trizol法，脫氧核糖核酸酶Ⅰ處理后，用Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，以O(shè)lig(dT)15為引物進(jìn)行cDNA第1鏈的合成，具體過(guò)程參照廠家說(shuō)明書(shū)。通表1轉(zhuǎn)基因植株分子檢測(cè)所用引物過(guò)對(duì)T0、T1和T2代轉(zhuǎn)基因植株的OsPMM和標(biāo)記基因Hpt(潮霉素抗性基因，Hygromycin)，進(jìn)行連續(xù)的PCR檢測(cè)來(lái)篩選無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因純合系；目標(biāo)基因在轉(zhuǎn)基因純合系種子中的表達(dá)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)使用的是Transgene公司的定量PCR混合液(TransStart TipTop Green qPCR SuperMix)，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按照相應(yīng)的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)于ABI 7900實(shí)時(shí)PCR儀上擴(kuò)增檢測(cè)。以?xún)?nèi)源的Actin基因?yàn)閰⒄栈?，轉(zhuǎn)基因受體材料C418為參照樣本，對(duì)OsPMM在轉(zhuǎn)基因植株種子部位的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。2-ΔΔCT法[19]用于計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)變化，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)所用的引物及引物序列如表 1所示。

Table 1. Primers used for molecular detection of transgenic plants.

引物名稱(chēng)Primername引物序列Primersequence(5'-3')OsPMM-F/RF:CACGCTTCATTACATTGCTGR:TATGTCCAATTGTCCGGTCHpt-F/RF:TAGGAGGGCGTGGATATGTCR:TACACAGCCATCGGTCCAGAActin-F/RF:AGCAACTGGGATGATATGGAR:CAGGGCGATGTAGGAAAGC

1.4VC含量的測(cè)定

在水稻收割曬干后，隨機(jī)抽取10粒水稻種子，用研缽充分研磨后，進(jìn)行水稻種子中總VC含量的測(cè)定，檢測(cè)方法參照Gillespie等[20]的報(bào)道進(jìn)行，3次重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)OsPMM基因純合系的獲得

為了提高水稻種子的VC含量，將OsPMM基因的全長(zhǎng)cDNA和種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子Bx14融合，以雙右邊界雙元載體pMNDRBBin6為骨架，構(gòu)建成了轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒pDRBOsPMM，其中標(biāo)記基因Hpt位于載體的兩個(gè)右邊界RB1和RB2之間，而目標(biāo)基因OsPMM位于RB2和LB之間，轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒T-DNA區(qū)的線形圖見(jiàn)圖1。

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將OsPMM基因轉(zhuǎn)入C418中，T0代共獲得26個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系。在苗期提取T0代植株葉片的DNA，用OsPMM基因特異檢測(cè)引物OsPMM-F/R和標(biāo)記基因Hpt基因特異檢測(cè)引物Hpt-F/R，對(duì)以上26個(gè)單株進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的PCR篩選。在轉(zhuǎn)基因系中，OsPMM-F/R能擴(kuò)增出814 bp和377 bp兩個(gè)條帶，其中814 bp的條帶是以基因組中的OsPMM基因組序列為模板擴(kuò)增所得，而377 bp則是以轉(zhuǎn)入的cDNA序列為模板擴(kuò)增而來(lái)。在非轉(zhuǎn)基因系中，沒(méi)有額外整合的OsPMMcDNA序列，故只能擴(kuò)出一條814 bp的帶。在含潮霉素標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因單株中，Hpt-F/R能擴(kuò)增出1035 bp的條帶(圖2)。通過(guò)對(duì)T0代檢測(cè)，共有10個(gè)單株既能夠擴(kuò)增出OsPMM基因特異的條帶，又能夠擴(kuò)增出Hpt基因特異的條帶(圖2)。此10個(gè)單株即為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，用于后續(xù)研究。

在T0代植株生長(zhǎng)成熟后，對(duì)以上10個(gè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株單株套袋收種，并在下一個(gè)水稻種植季繼續(xù)種植T1代種子，每個(gè)株系種植30～50個(gè)單株。待水稻生長(zhǎng)至分蘗期，采集葉片，微量提取以上材料的葉片總DNA。以提取的DNA為模板，對(duì)T1代單株分別進(jìn)行OsPMM基因和Hpt基因的PCR檢測(cè)，OsPMM基因檢測(cè)陽(yáng)性而Hpt基因檢測(cè)陰性的單株即為無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)OsPMM基因植株。經(jīng)過(guò)檢測(cè)，T0代10個(gè)株系中，2號(hào)、3號(hào)和7號(hào)株系分別能分離出2個(gè)、3個(gè)和3個(gè)無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因單株，依據(jù)來(lái)源將這些單株分別命名2-1，2-2，3-1，3-2，3-3，7-1，7-2和7-3。

對(duì)以上8個(gè)T1代單株套袋收種，繼續(xù)種植T2代種子，每個(gè)系種植30個(gè)單株，并在水稻生長(zhǎng)到分蘗期后，提取葉片DNA再次對(duì)每個(gè)株系的單株進(jìn)行OsPMM基因和Hpt基因的PCR鑒定，從中篩選無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因純合系。經(jīng)過(guò)鑒定，上述8個(gè)株系中，有3個(gè)株系的T2代單株均顯示為OsPMM基因陽(yáng)性且Hpt基因陰性，為無(wú)選擇標(biāo)記的OsPMM轉(zhuǎn)基因純合系。以上3個(gè)株系分別來(lái)自于T1編號(hào)為2-1、3-1和7-1的單株。圖 3為2-1 部分T2代單株的檢測(cè)結(jié)果。

圖1轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒pDRBOsPMM T-DNA區(qū)的線形結(jié)構(gòu)

Fig.1. Linear structure of transgenic plasmid pDRBOsPMM T-DNA zone.

M-DL2000標(biāo)記； 1-非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?2-空白水對(duì)照; 3～12-轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

M, DL2000 marker; 1, Non-transgenic control; 2, PCR control with water as template; 3-12, Transgenic-positive plants.

圖2T0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的OsPMM基因(A)和Hpt基因(B)的PCR鑒定

Fig. 2. PCR analysis of the OsPMM gene(A) and Hpt gene (B) in T0transgenic-positive plants.

M-DL2000； 1-PCR體系對(duì)照； 2-非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?3-轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性對(duì)照； 4～12-部分T2代轉(zhuǎn)基因純合單株。

M, DL2000; 1, PCR control with water as template; 2, Transgenic-negative control; 3, Transgenic-positive control; 4-12, Partial transgenic T2plants.

圖3無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因系2-1部分T2代單株的OsPMM基因(A)和Hpt基因(B)的PCR鑒定

Fig. 3. PCR analysis of the OsPMM gene (A) and Hpt gene (B) in partial T2progenies of marker-free transgenic line 2-1.

2.2OsPMM基因在轉(zhuǎn)基因純合系種子部位的表達(dá)水平明顯提高

待種子成熟時(shí)，單株套袋收獲以上T2代轉(zhuǎn)基因純合系的種子。待種子曬干后，隨機(jī)抽取部分種子，提取種子部位的RNA，以Actin基因?yàn)閮?nèi)參，以轉(zhuǎn)基因受體C418品種為對(duì)照，對(duì)OsPMM基因在3個(gè)無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因系2-1，3-1和7-1中的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析，發(fā)現(xiàn)OsPMM在轉(zhuǎn)基因系中的表達(dá)水平有明顯的提高(圖 4)。

2.3轉(zhuǎn)基因純合系種子中的VC含量顯著提高

OsPMM基因在轉(zhuǎn)基因純合系種子中的VC轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，為了檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因系種子部位的VC含量是否提高，我們將對(duì)照系和3個(gè)轉(zhuǎn)基因系的種子部位的總VC含量進(jìn)行了測(cè)定。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照C418的VC含量約8 μmol/g，而轉(zhuǎn)基因系的VC含量為10～12 μmol/g，與對(duì)照C418相比，3個(gè)轉(zhuǎn)基因純合系種子中的VC含量提高了25%～50%(圖 5)。

通過(guò)對(duì)OsPMM在轉(zhuǎn)基因系種子中RNA水平的相對(duì)表達(dá)分析，以及種子部位的VC含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)OsPMM基因的轉(zhuǎn)錄水平可以影響水稻種子中的VC含量。本研究結(jié)果表明，在水稻中，通過(guò)提高OsPMM基因的表達(dá)水平來(lái)增加水稻種子的VC含量是行之有效的。

2-1,3-1和7-1為轉(zhuǎn)基因純合系； C418為轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照。

2-1, 3-1 and 7-1, Transgenic homozygous lines; C418, Transgenic-negative control.

圖4OsPMM基因在轉(zhuǎn)基因純合系種子中的相對(duì)表達(dá)水平

Fig. 4. Relative expression level of OsPMM gene in seeds of transgenic homozygous lines.

2-1，3-1和7-1為轉(zhuǎn)基因系； C418-轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照。

2-1, 3-1 and 7-1, Transgenic lines; C418, Transgenic-negative control.

圖5轉(zhuǎn)基因純合系種子中的VC含量分析

Fig. 5. VC content in seeds of transgenic homozygous rice lines.

3討論

水稻作為重要的糧食作物，是我國(guó)南方地區(qū)食用的主食。VC是植物體內(nèi)重要的抗氧化劑[21]，也是人體每天需求量最多的維生素。人類(lèi)不能合成VC，需要從每天的膳食中來(lái)攝取VC，因而提高水稻的VC含量，對(duì)補(bǔ)充人體的VC有很大幫助。對(duì)植物PMM基因的轉(zhuǎn)基因操作發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)植物中PMM基因的表達(dá)，可以改變受體的VC含量。在煙草和擬南芥中過(guò)表達(dá)PMM都能提高受體的VC含量[14]；在煙草中過(guò)表達(dá)來(lái)自櫻桃的PMM基因，也能提高受體VC的含量[22]。對(duì)于水稻而言，水稻種子是食用的部分， 對(duì)水稻的改良重點(diǎn)應(yīng)是提高水稻種子的VC含量。為了特異地提高水稻種子的VC含量，我們采取了構(gòu)建融合基因的策略，使用種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子Bx14驅(qū)動(dòng)OsPMM基因的表達(dá)。改造好的基因構(gòu)建到表達(dá)載體上，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的途徑轉(zhuǎn)入到水稻品種中。結(jié)果和我們預(yù)期一致，OsPMM基因在轉(zhuǎn)基因水稻種子中的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照明顯提高，相應(yīng)地，水稻種子中的VC含量也有一定程度的提高。

在本研究中，我們之所以通過(guò)轉(zhuǎn)基因的途徑將OsPMM基因轉(zhuǎn)入到C418水稻品種中，一是要使OsPMM基因在種子中特異高表達(dá)，使用種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)OsPMM基因的表達(dá)是最有效途徑，這需要對(duì)OsPMM基因進(jìn)行基因工程改造，然后通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入到受體水稻中；二是轉(zhuǎn)基因技術(shù)是進(jìn)行作物改良的一個(gè)有效途徑，相比較于傳統(tǒng)的回交轉(zhuǎn)育育種技術(shù)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)是特異地將含有目標(biāo)基因的T-DNA區(qū)轉(zhuǎn)入到受體中，減少了“連鎖累贅”對(duì)目標(biāo)性狀的影響，能夠在短時(shí)間內(nèi)(一到兩年)獲得除目標(biāo)性狀外，其他性狀和受體保持一致的改良系[23]。三是對(duì)轉(zhuǎn)基因和回交轉(zhuǎn)育技術(shù)選育的玉米、小麥和水稻等作物的研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平上，通過(guò)這兩種技術(shù)選育的植物具有實(shí)質(zhì)等同性，轉(zhuǎn)基因技術(shù)并不會(huì)比傳統(tǒng)的回交育種技術(shù)帶來(lái)更多的基因表達(dá)變化[24-26]。本研究通過(guò)對(duì)T0、T1和T2代轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行連續(xù)的分子鑒定，在T2代便篩選得到了主要農(nóng)藝性狀和對(duì)照一致且種子VC含量提高的轉(zhuǎn)基因純合系。由于在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體上采用了雙右邊界雙元載體作為骨架，所篩選到的轉(zhuǎn)基因純合系無(wú)選擇標(biāo)記基因。另外，目標(biāo)基因OsPMM來(lái)源于水稻，其所用種子特異表達(dá)啟動(dòng)子來(lái)自于禾本科植物小麥。因此，本研究所得到的高VC含量的轉(zhuǎn)基因水稻在育種實(shí)踐中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn):

[1] Wheeler G L, Jones M A, Smirnoff N. The biosynthetic pathway of vitamin C in higher plants.Nature, 1998, 393(6683): 365-369.

[2] Smirnoff N, Wheeler G L. Ascorbic acid in plants: Biosynthesis and function.CritRevBiochemMolBiol, 2000, 35(4): 291-314.

[3] Smirnoff N, Conklin P L, Loewus F A. Biosynthesis of ascorbic acid in plants:A renaissance.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol, 2001, 52: 437-467.

[4] Wolucka B A,van Montagu M. GDP-mannose 3′,5′-epimerase forms GDP-L-gulose, a putative intermediate for the de novo biosynthesis of vitamin C in plants.JBiolChem, 2003, 278(48): 47483-47490.

[5] Lorence A, Chevone B I, Mendes P, et al. Myo-inositol oxygenase offers a possible entry point into plant ascorbate biosynthesis.PlantPhysiol, 2004, 134(3): 1200-1205.

[6] Agius F, Gonzalez-Lamothe R, Caballero J L, et al. Engineering increased vitamin C levels in plants by overexpression of a D-galacturonic acid reductase.NatBiotechnol, 2003, 21(2): 177-181.

[7] Keller R, Renz F S, Kossmann J. Antisense inhibition of the GDP-mannose pyrophosphorylase reduces the ascorbate content in transgenic plants leading to developmental changes during senescence.PlantJ, 1999, 19(2): 131-141.

[8] Gatzek S, Wheeler G L, Smirnoff N. Antisense suppression ofL-galactose dehydrogenase inArabidopsisthalianaprovides evidence for its role in ascorbate synthesis and reveals light modulatedL-galactose synthesis.PlantJ, 2002, 30(5): 541-553.

[9] Tabata K, Oba K, Suzuki K, et al. Generation and properties of ascorbic acid-deficient transgenic tobacco cells expressing antisense RNA forL-galactono-1,4-lactone dehydrogenase.PlantJ, 2001， 27(2): 139-148.

[10]Tokunaga T, Miyahara K, Tabata K, et al. Generation and properties of ascorbic acid-overproducing transgenic tobacco cells expressing sense RNA forL-galactono-1,4-lactone dehydrogenase.Planta, 2005, 220(6): 854-863.

[11]Jain A K, Nessler C L. Metabolic engineering of an alternative pathway for ascorbic acid biosynthesis in plants.MolBreed, 2000, 6(1): 73-78.

[12]李坤嵐. 轉(zhuǎn)小鼠古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶基因擬南芥的評(píng)估. 上海： 復(fù)旦大學(xué), 2010.

Li K L. Evaluation of mouse gulonolactone oxidase gene transformedArabidopsisthaliana. Shanghai: Fudan University, 2010.

[13]Chen Z, Young T E, Ling J, et al. Increasing vitamin C content of plants through enhanced ascorbate recycling.ProcNatlAcadSciUSA, 2003, 100(6): 3525-3530.

[14]Qian W, Yu C, Qin H, et al. Molecular and functional analysis of phosphomannomutase (PMM) from higher plants and genetic evidence for the involvement of PMM in ascorbic acid biosynthesis inArabidopsisandNicotianabenthamiana.PlantJ, 2007, 49(3): 399-413.

[15]Badejo A A, Eltelib H A, Fukunaga K, et al. Increase in ascorbate content of transgenic tobacco plants overexpressing the acerola (Malpighiaglabra) phosphomannomutase gene.PlantCellPhysiol, 2009, 50(2): 423-428.

[16]Lu H J, Zhou X R, Gong Z, X, et al. Generation of selectable marker-free transgenic rice using double right-border (DRB) binary vectors.AustJPlantPhysiol, 2001, 28(3): 241-248.

[17]楊振玉, 張宗旭, 魏耀林, 等. 粳型特異親和恢復(fù)系 C418 的選育及其特性. 雜交水稻, 1998, 13(3): 31-32.

Yang Z Y, Zhang Z X, Wei Y L, et al. Breeding and characteristics of japonica type wide compatibility line C418.HybridRice, 1998, 13(3): 31-32.

[18]Zhai W X, Li X B, Tian W, et al. Introduction of a rice blight resistance gene,Xa21, into five Chinese rice varieties through anAgrobacterium-mediated system.ChinaC:LifeSci, 2000, 43(4): 361-368.

[19]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using rea L-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod.Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[20]Gillespie K M, Ainsworth E A. Measurement of reduced, oxidized and total ascorbate content in plants.NatProtocols, 2007, 2(4): 871-874.

[21]Noctor G, Foyer C H. Ascorbate and glutathione: Keeping active oxygen under control.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol, 1998, 49: 249-279.

[22]Badejo A A, Eltelib H A, Fukunaga K, et al. Increase in ascorbate content of transgenic tobacco plants overexpressing the acerola (Malpighiaglabra) phosphomannomutase gene.Plant&CellPhysiol, 2009, 50(2): 423-428.

[23]Gao L, Xia Z, Jiang G, et al. Generation of marker-free, bacterial blight-resistant transgenic sterile line and hybrid rice withXa21.PlantBreed, 2011, 130(4): 438-443.

[24]Gao L, Cao Y, Xia Z, et al. Do transgenesis and marker-assisted backcross breeding produce substantially equivalent plants? A comparative study of transgenic and backcross rice carrying bacterial blight resistant geneXa21.BMCGenom, 2013, 14: 738-750.

[25]Baudo M M, Lyons R, Powers S, et al. Transgenesis has less impact on the transcriptome of wheat grain than conventional breeding.PlantBiotechnolJ, 2006, 4(4): 369-380.

[26]Coll A, Nadal A, Collado R, et al. Gene expression profiles of MON810 and comparable non-GM maize varieties cultured in the field are more similar than are those of conventional lines.TransgenicRes, 2009, 18(5): 801-808.

收稿日期:2015-08-21； 修改稿收到日期: 2015-10-20。

基金項(xiàng)目:國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專(zhuān)項(xiàng)(2014ZX08001-002)； 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31300999)； 湖北省教育廳項(xiàng)目(B2015229)； 武漢市科學(xué)技術(shù)局項(xiàng)目(2014072704011250)； 江漢大學(xué)科研啟動(dòng)項(xiàng)目(3003-06000043)。

中圖分類(lèi)號(hào):Q786； S511.0353

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1001-7216(2016)04-0441-06

TransgenosisofthePhosphomannomutaseTransgeneIncreasesVitaminCContentinRice

GAOLi-fen1, 2,XIAZhi-hui2, 3,ZHANGJi1,WANGDao-wen2,ZHAIWen-xue2,*

(1InstituteforSystemsBiology,JianghanUniversity,Wuhan430056,China;2InstituteofGeneticsandDevelopmentalBiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China;3InstituteofLifeSciences,HainanUniversity,Haikou570228,China;*Correspondingauthor,E-mail: wxzhai@genetics.ac.cn)

Abstract:VC (vitamin C) is an essential nutrient to human health. Due to lack of L-gulonolactone oxidase, the last enzyme involved in VC synthesis pathway, human could not synthesize VC by themselves. Rice is an important food crop and its nutritional value could be greatly improved by increasing the VC content in rice seeds. Phosphomannomutase (PMM) is an important enzyme in VC synthesis pathway, catalyzing the interconversion from mannose 6-phosphate from mannose 1-phosphate. In this study, Oryza PMM gene (OsPMM) that was under the control of seed-specific expressed promoter Bx14 was transferred into ‘C418’, a restorer line of three-line japonica hybrid rice, using the double right-border vector pMNDRBBin6 through an Agrobacterium tumefaciens-mediated system. Molecular analysis revealed that OsPMM was integrated into the genome of transgenic ‘C418’, and the homozygous and marker-free transgenic line was obtained in the T2 generation. Gene expression analysis of transgenic lines showed the expression level of OsPMM was significantly increased in seeds, and accordingly, the VC content in the seeds of transgenic plant also increased by 25-50%.

Key words:vitamin C; phosphomannomutase; double right-border vector system; marker-free; transgenic line