顏廷帥，羅 慶，潘志勇，劉永忠，彭抒昂（.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；2.金正大生態(tài)工程集團(tuán)股份有限公司 國(guó)家緩控釋肥工程技術(shù)研究中心，山東 臨沭 276700）

柑橘砧木枳橙和香橙B O R 2基因的克隆與缺硼脅迫下的表達(dá)分析

顏廷帥1，2，羅 慶1，潘志勇1，劉永忠1，彭抒昂1
（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；2.金正大生態(tài)工程集團(tuán)股份有限公司 國(guó)家緩控釋肥工程技術(shù)研究中心，山東 臨沭 276700）

以耐缺硼脅迫的枳橙（（Citrus sinens（L.）Osb.×Poncirus trifoliata（L.）Raf.）和不耐缺硼脅迫的香橙（Citrus junos Sieb.ex Tanaka）為材料，克隆了擬南芥硼運(yùn)輸基因AtBOR2的同源基因枳橙CPBOR2和香橙CjBOR2，進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析和缺硼脅迫下的表達(dá)分析。結(jié)果表明，CPBOR2和CjBOR2的ORF長(zhǎng)度分別為2133bp和2073bp，CpBOR2和CjBOR2蛋白都具有7個(gè)跨膜區(qū)域，且具有細(xì)胞膜極性定位和內(nèi)吞降解的保守氨基酸位點(diǎn)；缺硼脅迫下，CjBOR2表達(dá)量與對(duì)照相比無(wú)顯著變化，在前期降低，后期升高。

枳橙；香橙；BOR2；缺硼；克??；qPCR

文獻(xiàn)著錄格式：顏廷帥，羅慶，潘志勇，等.柑橘砧木枳橙和香橙B O R 2基因的克隆與缺硼脅迫下的表達(dá)分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（1）：65-68.

我國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)主要位于南方多雨的山地丘陵地區(qū)，土壤多為酸性的紅黃壤，土壤狀況較差，同時(shí)南方濕潤(rùn)多雨，硼酸極易因淋溶作用而流失，因此土壤缺硼的現(xiàn)象較普遍［1-2］。土壤缺硼易造成柑橘老葉葉脈木栓化，樹(shù)勢(shì)早衰，果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)下降，使產(chǎn)區(qū)農(nóng)民遭受?chē)?yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［3］。

柑橘樹(shù)體主要通過(guò)砧木根系吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)硼，不同的砧木可以影響樹(shù)體的營(yíng)養(yǎng)狀況［4］。目前柑橘砧木吸收和運(yùn)輸硼的機(jī)制還不清楚，最近在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)AtBOR2在缺硼脅迫下硼的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中有重要作用：AtBOR2定位于根部，轉(zhuǎn)運(yùn)共質(zhì)體的硼到質(zhì)外體，促進(jìn)細(xì)胞壁硼糖復(fù)合物的形成，從而保證根部延長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞的正常伸長(zhǎng)和硼向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，缺硼脅迫下AtBOR2表達(dá)量上升［5］。而柑橘砧木中AtBOR2的同源基因在缺硼脅迫下的作用目前還不清楚，為了確定缺硼脅迫下不同柑橘砧木中AtBOR2的同源基因表達(dá)量的變化，本試驗(yàn)所用材料為耐缺硼脅迫的柑橘砧木枳橙和不耐缺硼脅迫的柑橘砧木香橙［6］，克隆枳橙 CPBOR2和香橙CjBOR2，并在缺硼脅迫下對(duì)水培條件下的枳橙和香橙進(jìn)行缺硼脅迫處理，通過(guò) qPCR技術(shù)，測(cè)定CPBOR2和CjBOR2表達(dá)量的變化，為進(jìn)一步確定柑橘吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)硼的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為生長(zhǎng)3個(gè)月的枳橙和香橙幼苗。

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的枳橙和香橙幼苗轉(zhuǎn)入1/2Hoag1and和Aron（全濃度）溶液培養(yǎng)，每2 h通氣15 min，在光周期為16 h/8 h（L/D）和晝夜溫差為28℃/22℃的條件下，每7 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液。待枳橙和香橙幼苗長(zhǎng)出新根后分別隨機(jī)分為兩組，分別移入含有0mg·L-1（缺硼）和0.25mg·L-1（對(duì)照）的1/2Hoag1and和Aron（全濃度）溶液培養(yǎng)0h，4h，8h，1d，2d，3d后采樣，采樣部位分別為根、莖和葉，迅速置于液氮速凍，儲(chǔ)存于超低溫冰箱（-80℃）備用。

1.2 方法

1.2.1 CPBOR2和CjBOR2的克隆

總R N A的提取按照Trizo試劑盒（Ambion公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。第一鏈cDNA的合成按照PrimeScript RTreagent Ki（Perfect Rea1 Time）試劑盒（TaKaR公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以 CsBOR2（orang1.1 t 01735.1）轉(zhuǎn)錄本序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)引物BOR2-F：CAGAACAATGGAAGAAA和BOR2-R：CTCCTGGAAAGTAGATAGAT，以 第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收、純化，連接pMD 18-T載體（TaKaR公司），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析使用一系列在線服務(wù)工具和軟件，使用ORF Finde預(yù)測(cè)ORF區(qū)域（http：//www.ncbi.n1m.nih.gov/gorf/gorf.htm1），使用TMHMM Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域，使用C1usta12（http：//www.e bi.ac.uk/Too1s/msa/c1usta1w2/）進(jìn)行蛋白質(zhì)多序列比對(duì)和一致性分析，使用MEGA5.0軟件的Neighbor-Joining算法構(gòu)建蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［7-8］。

1.2.3 基因表達(dá)分析

以β-Actin為內(nèi)參基因，定量引物為Actin-F：CCAAGCAGCATGAAGATCAA和Actin-R：ATCTGC TGGAAGGTGCTGAG［9］。以測(cè)序所得基因轉(zhuǎn)錄本保守序列為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物qBOR2-F：ATTCT GCCCAAGTTTTTC和qBOR2-R：GCACCCATCTGTG TCTCT，以稀釋5倍的樣品cDNA為qPCR反應(yīng)的底物，按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（TaKaRa公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)樣品的cDNA擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行 4次獨(dú)立重復(fù)，利用SPSS16.0中Duncan’s多重比較對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 CpBOR2和CjBOR2的克隆與測(cè)序

CPBOR2和CjBOR2的P C R擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳如圖1，片段大小2 000～3 000 bp。對(duì) CPBOR2和CjBOR2測(cè)序結(jié)果進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)ORF長(zhǎng)度分別為 2 133和 2 073 bp。與甜橙數(shù)據(jù)庫(kù) CsBOR2（orange1.1t01735）的ORF序列進(jìn)行相似性比對(duì)，相似性分別為99%和99%，從而確定所克隆序列為目的序列。

圖1 CPBOR2和CjBOR2的P C R擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 CPB0R2和CjB0R2的生物信息學(xué)分析

CpBOR2，CjBOR2和CsBOR2的多序列氨基酸比對(duì)和跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)表明（圖 2），CpBOR2和CjBOR2都具有7個(gè)跨膜區(qū)域，CpBOR2和CjBOR2都具有與AtBOR1相同的保守酪氨酸（Y）位點(diǎn)和賴氨酸（K）位點(diǎn)［10-11］，其中 CpBOR2在第41～60 bp處比CjBOR2多出20 bp。

構(gòu)建 CpBOR2和 CjBOR2蛋白與其他植物BOR2蛋白的進(jìn)化樹(shù)（圖 3）表明，CpBOR2和CjBOR2蛋白與甜橙CsBOR2蛋白的進(jìn)化關(guān)系最近，其次與同為多年生雙子葉植物的葡萄VvBOR2進(jìn)化距離較近，與水稻OsBOR2蛋白的進(jìn)化距離最遠(yuǎn)。

圖2 枳橙CpBOR2、香橙CjBOR2和甜橙CsBOR2蛋白氨基酸多序列比對(duì)和跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)

圖3 CpBOR2和CjBOR2蛋白與其他植物BOR2蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析

2.3 CpBOR2和CjBOR2在缺硼脅迫下的表達(dá)模式

為了確定CPBOR2和CjBOR2的表達(dá)情況，本試驗(yàn)用qPCR方法測(cè)定了2個(gè)基因在缺硼脅迫下各個(gè)時(shí)期的表達(dá)量（圖4）。缺硼脅迫下，CjBOR2相對(duì)于對(duì)照無(wú)顯著變化；CPBOR2在前期表達(dá)量顯著下降，8 h時(shí)最低，僅為對(duì)照的0.24倍，后期表達(dá)量上升，48 h時(shí)最高，為對(duì)照的5.76倍，且正常硼濃度下CPBOR2的表達(dá)量變化也較CjBOR2表達(dá)量變化劇烈。

3 討論

缺硼是我國(guó)南方柑橘產(chǎn)區(qū)常見(jiàn)的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響南方柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。最近發(fā)現(xiàn)擬南芥AtBOR2可以應(yīng)對(duì)一定程度的缺硼脅迫。柑橘為嫁接栽培，主要通過(guò)砧木根系吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)硼到地上部，本試驗(yàn)以耐缺硼的砧木品種枳橙和不耐缺硼的砧木香橙為材料，克隆了AtBOR2的同源基因CPBOR2和CjBOR2，進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析和缺硼脅迫下的表達(dá)分析。

CjBOR2較CpBOR2的氨基酸序列在N端缺失了20 bp，表明它們的蛋白質(zhì)的功能可能出現(xiàn)了差別。缺硼脅迫下耐缺硼脅迫的枳橙CPBOR2表達(dá)量劇烈變化，響應(yīng)缺硼脅迫，不耐缺硼的香橙CjBOR2的表達(dá)量與對(duì)照相比無(wú)顯著變化，不響應(yīng)缺硼脅迫，表明CPBOR2在缺硼脅迫條件下可能參與體內(nèi)硼酸的運(yùn)輸從而調(diào)節(jié)體內(nèi)硼濃度，而CjBOR2在香橙缺硼脅迫條件下的作用則不明顯，且正常情況下，CPBOR2表達(dá)量的變化較CjBOR2更加劇烈。缺硼脅迫下CjBOR2與CPBOR2對(duì)植物體內(nèi)硼酸濃度調(diào)節(jié)能力的差異可能是造成2種砧木耐缺硼能力的差異的原因之一。

圖4 缺硼脅迫下根中CPBOR2和CjBOR2表達(dá)量的變化

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（責(zé)任編輯：張 韻）

S666

A

0528-9017（2016）01-0065-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20160125

2015-11-12

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20130146110020）

顏廷帥（1989-），男，山東臨沂人，碩士，從事果樹(shù)方面的研究工作，E-mai1：y a nt i ng s hua i@ki ng e nt a.com。