嚴(yán)　晨，鄔亞華，王子瑤，殷嫦嫦，殷　明

(南昌大學(xué)1.第二附屬醫(yī)院、2.研究生院醫(yī)學(xué)部，江西 南昌　330006；3.九江學(xué)院，江西 九江　332000)

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水飛薊素對人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞的抑制作用及相關(guān)機(jī)制

嚴(yán)晨1,2，鄔亞華3，王子瑤1,2，殷嫦嫦3，殷明1

(南昌大學(xué)1.第二附屬醫(yī)院、2.研究生院醫(yī)學(xué)部，江西 南昌330006；3.九江學(xué)院，江西 九江332000)

目的研究水飛薊素對人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法設(shè)置對照組及不同濃度水飛薊素組，作用人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；CCK-8法測定細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；Western blot檢測ERK1/2、p-ERK1/2及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果水飛薊素抑制Saos-2細(xì)胞增殖，呈時間及濃度依賴性；水飛薊素誘導(dǎo)Saos-2細(xì)胞凋亡，呈濃度依賴性；水飛薊素降低Saos-2細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)，增加Saos-2細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，呈濃度依賴性，而ERK1/2蛋白表達(dá)無明顯變化。結(jié)論水飛薊素能夠抑制人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制ERK信號通路及上調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。

水飛薊素；骨肉瘤；增殖；凋亡；機(jī)制；ERK信號通路；caspase-3

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，多發(fā)于兒童及青少年[1]。目前，OS的主要治療策略為手術(shù)切除聯(lián)合化療。近年來統(tǒng)計(jì)，無轉(zhuǎn)移OS患者的總生存率能達(dá)到70%，而出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移或骨轉(zhuǎn)移，生存率只有25%～50%[2]，且大劑量使用化療藥物產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用及耐藥的頻繁發(fā)生，使得OS患者的生存率并沒有得到明顯提高，因此，OS的治療需進(jìn)一步探討。研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥也具有抑制腫瘤細(xì)胞的作用，且毒副作用小，可作為傳統(tǒng)化療藥物的輔助用藥或聯(lián)合使用，以增加化療藥物的敏感性或減少其用量，以更好的抗OS治療。

水飛薊素(silymarin，SM)是從植物水飛薊中提取的一種活性成分，為多酚類黃酮，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、肝細(xì)胞再生等作用，臨床已運(yùn)用其治療肝臟疾病[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SM對乳腺癌、皮膚癌、前列腺癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肺癌具有抑制作用[4-6]，但對OS的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究SM對OS的作用，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

1　材料

1.1細(xì)胞系人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室?guī)齑妗?/p>

1.2主要藥品與試劑水飛薊素(山東西亞生化科技有限公司，批號1035907)；DMSO(Solarbio公司，美國，批號02A033)；胰酶(Solarbio公司，美國，批號20150806)；α-MEM(Hyclone公司，美國，批號NAP1372)；胎牛血清(Hyclone公司，美國，批號：NYM1035)；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，批號：JK-021)；Annexin V-FITC /PI凋亡檢測試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司，批號：150509J)；總蛋白提取試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號：P1250)；兔抗人ERK1/2單克隆抗體(Cell Signaling公司，美國，批號：14)；p-ERK1/2單克隆抗體(Cell Signaling公司，美國，批號：15)；兔抗人GAPDH(Proteintech公司，美國，批號：10494-1-AP)；cleaved caspase-3多克隆抗體(Proteintech公司，美國，批號：9677-1-AP)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號：1215E)。

2　方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞從液氮中復(fù)蘇后，用10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，置于37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次，待細(xì)胞匯合80%～90%后，按1 ∶3傳代、培養(yǎng)或進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.2倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化取對數(shù)生長期Saos-2細(xì)胞，按每孔5×104接種于24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組更換含不同藥物濃度的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)分6組：0 μmol·L-1(對照組)、40、80、120、160、200 μmol·L-1，作用48 h后，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照。

2.3CCK-8法測定細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期Saos-2細(xì)胞，按每孔5×103接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組更換含不同藥物濃度的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)分組同2.2，各藥物濃度組均設(shè)3個復(fù)孔和1個空白孔，分別作用24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀(波長450 nm)測定各孔吸光度OD(A)值。各組吸光度OD=A細(xì)胞-A空白，細(xì)胞增殖抑制率(inhibition rate, IR)：IR/%=(1-OD實(shí)驗(yàn)/OD對照)×100%。

2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期Saos-2細(xì)胞，按每孔5×105接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組更換含不同藥物濃度的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)分組同2.2，作用48 h后，消化收集細(xì)胞，用PBS重新懸浮細(xì)胞，并計(jì)數(shù)，各組取2×105細(xì)胞懸浮液，1 500 r·min-1，5 min離心后棄上清，加入500 μL 1×Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞，重懸后，先加入5 μL Annexin V-FITC，再加入10 μL PI，輕輕混勻，在室溫下，避光反應(yīng)10 min，行流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算凋亡率。

2.5Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)ERK1/2、p-ERK1/2及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)取對數(shù)生長期Saos-2細(xì)胞，按每孔5×105接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組更換含不同藥物濃度的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)分4組：對照組(0 μmol·L-1)、低濃度組(40 μmol·L-1)、中濃度組(120 μmol·L-1)、高濃度組(200 μmol·L-1)，作用48 h后，常規(guī)消化收集各組細(xì)胞，按總蛋白抽提試劑盒操作說明提取各組細(xì)胞總蛋白，行聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉，孵育一抗GAPDH(1 ∶4 000)、ERK1/2(1 ∶1 000)、p-ERK1/2(1 ∶2 000)、cleaved caspase-3(1 ∶1 000)，4℃過夜，1×TBTS洗膜3次，孵育二抗(1 ∶6 000)，1×TBTS 洗膜3次，暗室膠片曝光，條帶用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

3　結(jié)果

3.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯微鏡下觀察顯示：對照組細(xì)胞生長良好，呈梭形或不規(guī)則形，胞質(zhì)透亮，胞膜光整；處理組部分細(xì)胞體積縮小、變圓，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，胞膜邊緣毛糙，折光度增強(qiáng)，呈細(xì)胞凋亡樣形態(tài)學(xué)改變；處理組細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞間隙增寬，可見少許細(xì)胞脫壁、漂浮，隨著濃度的增大，處理組上述形態(tài)學(xué)改變越明顯(Fig 1 )。

A: Control group(0 μmol·L-1); B:40 μmol·L-1;C:80 μmol·L-1; D:120 μmol·L-1; E:160 μmol·L-1; F:200 μmol·L-1

Fig 2　Apoptosis rate of Saos-2 cells treated with silymarin

*P<0.05vscontrol

3.2水飛薊素對骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖的影響CCK-8結(jié)果顯示：處理組均抑制骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖，藥物濃度越大，作用時間越長，增殖抑制越明顯，與對照組相比差異有顯著性(P<0.05)，見Tab 1。

GroupIR/%(24h)IR/%(48h)IR/%(72h)Control00040μmol·L-110.16±2.31*14.96±2.89*18.34±1.93*80μmol·L-124.42±4.42*34.05±2.03*41.41±4.35*120μmol·L-152.01±7.81*65.01±2.78*71.62±4.44*160μmol·L-168.01±3.44*76.92±4.51*83.96±3.52*200μmol·L-180.50±2.93*87.58±2.07*92.22±2.80*

*P<0.05vscontrol

3.3水飛薊素對骨肉瘤Saos-2細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：水飛薊素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，各組細(xì)胞凋亡率分別為(2.08±0.12)%、(8.15±0.37)%、(15.37±1.06)%、(32.68±2.02)%、(48.34±1.59)%、(67.58±2.43)%，處理組濃度越高，凋亡率越大，與對照組比差異有顯著性(P<0.05),見Fig 2。

3.4水飛薊素對骨肉瘤Saos-2細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示：水飛薊素降低Saos-2細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2蛋白表達(dá)，增加cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，與對照組相比差異有顯著性(P<0.05)，而ERK1/2蛋白表達(dá)無明顯變化(Fig 3)。

4　討論

研究證實(shí)[7-10]，水飛薊素具有預(yù)防癌癥發(fā)生及抗腫瘤作用，毒副作用小，還能增加多柔比星、順鉑和卡鉑的敏感性。本研究CCK-8及流式檢測結(jié)果顯示，水飛薊素能夠抑制Saos-2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并呈濃度依賴性。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是一類絲氨酸/酪氨酸蛋白激酶，廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，MAPKs信號通路為細(xì)胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)控細(xì)胞的存活、生長、增殖、分化及凋亡等多項(xiàng)生理過程[11]。非磷酸化的MAPKs為靜息狀態(tài)，而磷酸化的MAPKs為激活狀態(tài)，當(dāng)MAPKs信號通路受到上游激酶作用下，發(fā)生磷酸化后而被激活，進(jìn)一步激活下游轉(zhuǎn)錄因子，啟動相關(guān)基因及蛋白表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤中MAPKs信號通路過表達(dá)或過激活，如：肝癌、腎癌、胰腺癌、食管癌[12-16]。MAPKs主要包括3個亞家族：ERK(extracellular signal-regulated kinase)家族、JNK(C-JUN-N terminal kinase)家族、p38家族，其中ERK與細(xì)胞的生長、增殖密切相關(guān)。有研究報道，水飛薊素可通過MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，其中ERK1/2磷酸化明顯受到抑制[17]。徐良志等[18]研究發(fā)現(xiàn)，大黃素通過抑制ERK信號通路，抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。caspase家族是一組半胱氨酸蛋白酶，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起到重要的作用。細(xì)胞凋亡途徑有多種，但絕大多數(shù)途徑末端都是通過caspase的級聯(lián)激活，最終激活caspase-3，形成具有活性的cleaved caspase-3片段，進(jìn)一步產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。施劍明等[20]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素、順鉑能增加骨肉瘤MG-63細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡。本研究中，水飛薊素作用骨肉瘤Saos-2細(xì)胞48h后，p-ERK1/2蛋白表達(dá)降低，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)增加，呈濃度依賴性，而ERK1/2蛋白表達(dá)無明顯變化,表明水飛薊素能夠抑制ERK磷酸化，阻滯ERK信號傳導(dǎo)通路，同時上調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)。

Fig 3　Cleaved caspase-3,ERK1/2,p-ERK1/2 protein expression of Saos-2 cells treated with silymarin for 48h detected by Western ±s,n=4)

綜上所述，水飛薊素能夠抑制Saos-2細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡，可能與抑制ERK信號通路及上調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究為水飛薊素抗骨肉瘤及其作用靶點(diǎn)提供一定的實(shí)驗(yàn)參考。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在九江學(xué)院醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室全體成員對本實(shí)驗(yàn)的支持與幫助！)

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Inhibitory effect of silymarin on human osteosarcoma Saos-2 cells and its mechanism

YAN Chen1,2, WU Ya-hua3, WANG Zi-yao1,2, YIN Chang-chang3, YIN Min1

(1.TheSecondAffiliatedHospitaltoNanchangUniversity，2.MedicalGraduateSchoolofNanchangUniversity，Nanchang330006,China；3.JiujiangCollege,JiujiangJiangxi332000,China)

AimTo study the effect of silymarin on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma saos-2 cells and to explore its possible mechanisms.MethodsControl group and different concentration groups of silymarin were set, and Saos-2 cells were treated with silymarin. Celluar morphologic changes were observed by inverted phase contrast microscope. Proliferation of cells was tested CCK-8 assay. Apoptosis rate of cells was analyzed by flow cytometry. ERK1/2、p-ERK1/2 and cleaved caspase-3 protein expression were measured by Western blot.ResultsSilymarin inhibited the proliferation of Saos-2 cells in a time-dependent and concentration-dependent manner. Silymarin induced the apoptosis of Saos-2 cells in a concentration-dependent manner. Silymarin decreased p-ERK1/2 protein expression and increased cleaved caspase-3 protein expression in a concentration-dependent manner, while ERK1/2 protein expression had no obvious change.ConculsionsSilymarin can inhibit the proliferation of human osteosarcoma saos-2 cells and induce apoptosis of them, and the mechanism may be related to inhibition of ERK signaling pathway and upregulated caspase-3 protein expression.

silymarin; osteosarcoma; proliferation; apoptosis; mechanism; ERK signaling pathway; caspase-3

2016-02-21，

2016-04-14

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81160226)

嚴(yán)晨(1986-)，男，碩士生，研究方向：中藥抗骨腫瘤，E-mail:yanchen8623@163.com；殷明(1958-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：脊柱與腫瘤，通訊作者，E-mail: yinming0791@aliyun.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.016

A

1001-1978(2016)07-0966-05

R284.1；R329.24；R329.25；R738.302.2

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-6-20 11:49網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.032.html