吳　鶯，吳麗賢，許建華

(福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 1.福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.天然藥物學(xué)系，福建 福州　350122)

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姜黃素衍生物C085抑制K562/G01細(xì)胞及Bcr-Abl激酶的體外研究

吳鶯1,2，吳麗賢1，許建華1

(福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 1.福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.天然藥物學(xué)系，福建 福州350122)

目的研究姜黃素衍生物C085對K562/G01細(xì)胞及野生型和伊馬替尼耐藥型Bcr-Abl 激酶的作用，以期能找到一種對IM耐藥點(diǎn)突變激酶有效的酪氨酸激酶抑制劑。方法分別采用MTT法及流式細(xì)胞儀檢測及觀察C085對細(xì)胞增殖及凋亡的影響；應(yīng)用Kinase-Glo?激酶發(fā)光檢測試劑盒檢測C085對4種Abl激酶(WT、T135I、Y253F、Q252H)活性的影響；蛋白免疫印跡檢測C085對Bcr-Abl和下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白的磷酸化水平及其他凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；JC-1熒光染色法檢測C085對細(xì)胞線粒體膜電位的影響；集落形成法觀察C085對CML病人骨髓CD34+細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果C085低濃度下即可抑制K562/G01的增殖，且可非ATP競爭性地抑制野生型及IM耐藥點(diǎn)突變Abl激酶的活性； C085可抑制Bcr-Abl的自磷酸化，下調(diào)下游信號(hào)轉(zhuǎn)通路蛋白的磷酸化水平和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，作用強(qiáng)于IM，具有明顯的量效關(guān)系；C085通過直接作用于線粒體的PT孔使其開放，激活凋亡相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促凋亡作用強(qiáng)于IM；鏡下觀察及集落數(shù)量統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，C085可對已經(jīng)產(chǎn)生IM耐藥的CD34+祖/干細(xì)胞集落有明顯的抑制作用。結(jié)論C085可抑制K562/G01細(xì)胞的生長可能與其抑制Bcr-Abl蛋白激酶活性，下調(diào)相關(guān)信號(hào)通路；直接作用于線粒體的PT孔使其開放，激活凋亡相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。C085對IM敏感及耐藥的白血病細(xì)胞均有殺傷作用，有望克服IM的耐藥而成為新的TKI。

姜黃素衍生物；C085；CML；伊馬替尼耐藥；Bcr-Abl；突變

伊馬替尼(imatinib,IM)又稱格列衛(wèi)(STI571),為 Bcr-Abl激酶抑制劑,已被證實(shí)可用于Ph+慢性粒細(xì)胞白血病 (CMLs)的治療. 但其治療后易復(fù)發(fā)，IM耐藥的最常見的原因是Bcr-Abl激酶域點(diǎn)突變和 Bcr-Abl 激酶活性增強(qiáng)。體外試驗(yàn)[1-3]顯示 Bcr-Abl 激酶ATP結(jié)合區(qū)內(nèi)P環(huán)(P-loop)內(nèi)E255V、Y253F/H點(diǎn)突變和T315I點(diǎn)突變的Bcr-Abl陽性細(xì)胞株，對IM有較高耐藥性水平。

目前新型的酪氨酸激酶抑制劑基本被分為兩類:ATP競爭型抑制劑和非ATP競爭型抑制劑。達(dá)沙替尼(dasatinib，BMS-354825)、AP23464、SKI-606、PD166326、尼洛替尼(nilotinib,AMN107)和INNO-406 (NS-187) 都為ATP競爭型抑制劑,與IM相比，他們能與ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合能力更強(qiáng)，可能對IM耐藥的病人有效。但是，他們并不能夠抑制T315I Bcr-Abl磷酸化。因此，一些非ATP 競爭型抑制劑，如 ON012380, Aurora 激酶抑制劑MK0457(VX-680)以及p38 MAP激酶抑制劑BIRB-796正被寄予希望[4]。

在我們尋找新型的Bcr-Abl激酶抑制劑的研究中，為了避免因突變引起的CML細(xì)胞耐藥，我們合成了一些以酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)以外的區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn)的化合物。姜黃素(curcumin，Cur) 為姜科姜黃屬的多年生草本植物。C085是本實(shí)驗(yàn)室利用拼合原理合成的姜黃素衍生物(Fig 1A)，其在與Bcr-Abl激酶的結(jié)合位點(diǎn)上與IM完全不同。在前期研究時(shí)發(fā)現(xiàn)其能明顯抑制IM敏感的白血病細(xì)胞株的增殖[5]。在此基礎(chǔ)上, 我們進(jìn)一步研究C085對K562/G01細(xì)胞的作用及機(jī)制。并對其與Abl野生型及IM耐藥點(diǎn)突變激酶的關(guān)系進(jìn)行研究，以期能找到一種對IM耐藥點(diǎn)突變激酶有效的新TKI。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑姜黃素衍生物C085由本課題組合成并純化,經(jīng)質(zhì)譜驗(yàn)證、HPLC分析鑒定,純度為95%以上;RPMI l640培養(yǎng)基(Hyclone,Australia);新生牛血清(杭州四季青公司);人全血CD34+分選試劑盒，MethoCult?GF H4434(Stem Cell Technologies, Vancouver,Canada);Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、JC-1線粒體凋亡檢測試劑盒、蛋白定量檢測試劑盒(南京凱基生物發(fā)展有限公司)、Kinase-Glo?Luminescent Kinase Assay Platform(Promega，USA)；MTT(Sigma USA); Phospho-c-Abl, Phospho-Stat5 and Phospho-CrkL)、Phospho-Erk1/2pathway sampler kit 、C-Raf、Mek1/2, Phospho- Mek1/2、Erk1/2、β-active(Cell signaling Technology, USA); DMSO(Sigma-Aldrich,USA);蛋白分子Marker(Bio-Rad,USA);ECL熒光底物(Amersham,USA); Abl激酶底物 (Enzo Life Science, Inc ，NY,USA)；Abl-WT、Abl -T135I、Abl -Y253F、Abl -Q252H(Millipore,USA)；ATP(Sigma，USA)。其它試劑均為進(jìn)口分裝分析純。

1.1.2主要儀器5% CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher,美國);免疫印跡成像系統(tǒng)(Carestream,加拿大);倒置顯微鏡(Olympus,日本);流式細(xì)胞儀(BD 美國);酶標(biāo)儀(Thermo Fisher,美國);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Beckman,美國); 384孔培養(yǎng)板，6孔培養(yǎng)板(Corning,德國)。

1.1.3細(xì)胞株及培養(yǎng)方法K562/G01細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液研究所惠贈(zèng)[6]。用RPMI 1640+10%胎牛血清+雙抗(1×105IU·L-1青霉素+100 mg·L-1鏈霉素)+4 μmol·L-1IM培養(yǎng)于37℃,5% CO2飽和濕度條件下,取對數(shù)生長期的細(xì)胞洗滌后用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1MTT法觀察對細(xì)胞增殖的影響取對數(shù)生長期細(xì)胞, 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104每毫升 , 接種于96孔培養(yǎng)板, 每孔180 μL, 加入不同濃度的藥物，每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加藥后置于37 ℃ 、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一定時(shí)間后, 每孔加入20 μL MTT( 5 g·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，2 000 r·min-1離心5 min, 甩板扣干, 各孔再加入150 μL的DMSO, 震蕩溶解, 在570 nm處測OD值, 計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值細(xì)胞生長抑制率/%=(對照組OD570值-實(shí)驗(yàn)組OD570值)/對照組OD570值×100%

以同一藥物的不同濃度對細(xì)胞生長抑制率作圖，可得到量效反應(yīng)曲線，根據(jù)線性回歸方程求出該藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。

1.2.2臺(tái)盼藍(lán)排染法觀察對細(xì)胞增殖的影響取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105每毫升，按每孔0.2 mL接種于96孔板內(nèi)，加入梯度濃度的藥物，置37 ℃、5% CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。48 h后吹打均勻，吸取10 μL培養(yǎng)液，與10 μL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液混勻，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，每個(gè)藥物濃度重復(fù)計(jì)數(shù)3次，藍(lán)染細(xì)胞判為死亡細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)量。

1.2.3Abl激酶活性的測定按Kinase-Glo?激酶發(fā)光檢測試劑盒要求進(jìn)行操作。此試劑盒是一個(gè)發(fā)光法的激酶檢測試劑盒，激酶反應(yīng)后溶液中剩余的ATP可與熒光素酶發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)。在 ATP 含量相同的體系中，ATP剩余量的多少與發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)弱成正比，與激酶活性負(fù)相關(guān)。

在384孔板中操作。藥物處理組每孔中依次加入1 μL C085(0.01,0.03,0.1,0.3和0.9 μmol·L-1)，1 uL Abl激酶底物(30 ng EAIYAAPFAKKK)，3 μL 10 nmol·L-1野生或突變型Abl激酶及5 μL ATP(0.2 或2 μmol·L-1)，陽性對照組不加藥物，改加1 μL。Buffer[50 mmol·L-1HEPES(pH 7.3),10 mmol·L-1MgCl2, 0.1% BSA, 2 mmol·L-1DTT]，陰性對照組不加激酶，改加3 μL Buffer。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。30℃孵育20 min后，每孔加入10 μL熒光素酶及底物的混合物，在酶標(biāo)儀上測化學(xué)發(fā)光數(shù)值。計(jì)算酶活抑制率及IC50。

酶活抑制率/%=(陰性對照組-實(shí)驗(yàn)組)/(陰性對照組-陽性對照組)×100%

1.2.4蛋白免疫印跡觀察細(xì)胞信號(hào)蛋白的表達(dá)[7]調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105每毫升, 經(jīng)不同濃度藥物作用24 h后處理細(xì)胞，抽提30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)膜至 PVDF膜(150 mA,4℃,1.5 h)，封閉液(1% BSA, Tris-HCl 20 mmol·L-1, pH 7.5, NaCl 150 mmol·L-1, 0.05% Tween-20)室溫封閉1 h，加一抗(anti-phospho-Bcr-Abl、phospho-Stat5或phospho-CrkL抗體)搖床4 ℃孵育過夜。TBST 洗去未結(jié)合的一抗。加二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫?fù)u床孵育1 h。將ECL試劑盒中的A和B兩試劑等體積混合,滴加到Image Station 4000MM成像儀上。將PVDF 膜正面朝下覆蓋在ECL試劑上,按成像儀的操作說明進(jìn)行曝光。

1.2.5Annexin V-FITC/PI雙熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105每毫升,經(jīng)不同濃度藥物作用24 h后,離心收集(2 000 r·min-1,5 min),用PBS洗滌細(xì)胞2 次(2 000 r·min-1,5 min),加入500 μL Binding buffer懸浮細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC混勻后,加入5 μL Propidium Iodide,混勻,室溫避光反應(yīng)5～15 min,流式細(xì)胞儀分析藥物對細(xì)胞凋亡的影響。

1.2.6JC-1熒光染色法檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整濃度為3×105每毫升，經(jīng)不同濃度藥物作用24 h后，離心收集(2 000 r·min-1，5 min)，用PBS洗滌細(xì)胞2次(2 000 r·min-1，離心5 min)，加入JC-1熒光染料后置于37℃，5%飽和濕度CO2培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)15～20 min。室溫離心收集細(xì)胞，用1×Incubation Buffer洗滌2次。吸取500 μL 1×Incubation Buffer重新懸浮細(xì)胞。轉(zhuǎn)移入流式管中，4℃避光，冰上保存，于60 min內(nèi)上機(jī)檢測。流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位△Ψm值，通過檢測紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。

1.2.7集落形成法觀察藥物對CML患者CD34+祖/干細(xì)胞的抑制作用提取IM敏感的白血病患者及IM耐藥的白血病患者的CD34+細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105每毫升。取0.2 mL細(xì)胞加入1.8 mL的H4434中，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的藥物，對照組加入等量的DMSO作為對照，渦旋混勻后，靜置5 min，接種于12孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，每組設(shè)2個(gè)平行孔，在12孔周圍加入無菌的dd H2O，37℃ 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周。對孔板中的細(xì)胞集落進(jìn)行拍照，計(jì)數(shù)。以藥物濃度為橫軸，集落抑制率值為縱軸繪制量效關(guān)系曲線。

2　結(jié)果

2.1C085對K562/G01細(xì)胞增殖的抑制作用用不同濃度的C085(1.25～20 μmol·L-1)作用于K562/G01細(xì)胞24、48和72 h，IC50分別為(6.15±0.14)、(5.11±0.12)和(3.74±0.07) μmol·L-1，C085呈濃度時(shí)間依賴性地抑制這些細(xì)胞株的增殖(Fig 1B)。

為了更直觀地證明C085對K562/G01的增殖抑制和殺傷作用，我們采用臺(tái)盼藍(lán)排染實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105每毫升，實(shí)驗(yàn)組分別加入1.25～20 μmol·L-1的C085至細(xì)胞培養(yǎng)體系，以經(jīng)典的酪氨酸激酶抑制劑IM做為對照組，空白組加入等量的DMSO，72 h后進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：空白組細(xì)胞呈對數(shù)生長；C085可濃度依賴性地抑制K562/G01細(xì)胞的增殖，在10 μmol·L-1即可達(dá)到完全抑制；而IM在低濃度時(shí)對K562/G01細(xì)胞無明顯殺傷作用，高濃度時(shí)的殺傷作用亦明顯弱于C085(Fig 1C)。

Fig 1　In vitro K562/G01 cells -killing activity of C085

A：Chemical structure of C085. B: Proliferation of K562/G01 cells in the presence of escalating concentrations of C085(0～20 μmol·L-1) for 24,48 and 72 h.C: Effect of C085 and imatinib on the viability of K562/G01 cells(72 h)

2.2C085對K562/G01細(xì)胞的促凋亡作用為了明確C085殺傷K562/G01細(xì)胞是否與其誘導(dǎo)凋亡有關(guān)，我們采用Annexin V-FITC/PI雙熒光染色法，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率。

調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105每毫升，每孔2 mL種于24孔板內(nèi)，分別加入C085(2.5、5、10 μmol·L-1)及陽性對照藥IM，作用24 h后，離心收集細(xì)胞，按試劑盒要求進(jìn)行染色，標(biāo)記Annexin V-FITC和PI，流式細(xì)胞術(shù)測定Annexin V陽性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)的百分?jǐn)?shù)。此方法精度高、速度快、準(zhǔn)確性好，是目前較先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，C085作用24 h即對細(xì)胞均有較強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用，主要是中、晚期凋亡。與陽性對照藥IM相比，誘導(dǎo)凋亡作用明顯(Fig 2)。

2.3C085體外抑制野生型及IM耐藥點(diǎn)突變Abl激酶我們已知C085可明顯抑制K562/G01細(xì)胞株的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，這些作用是否與其抑制Abl激酶活性有關(guān)？C085是否對野生型及IM耐藥點(diǎn)突變Abl激酶活性均有抑制作用？我們購買了4種激酶：Abl-WT、Abl -T135I、Abl -Y253F、Abl -Q252H 以及Kinase-Glo?激酶發(fā)光檢測試劑盒對此問題進(jìn)行研究[8]。

每種激酶設(shè)計(jì)2組ATP濃度，藥物處理組加入0.001～2.7 μmol·L-1遞增濃度的C085，并設(shè)陽性對照組(不加藥物，改加1 μL Buffer)和陰性對照組(不加激酶，改加3 μL Buffer)。按試劑盒要求操作后在酶標(biāo)儀上測化學(xué)發(fā)光數(shù)值。以抑制率為縱坐標(biāo)，藥物濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制曲線，計(jì)算IC50(Fig 3, Tab 1)。

Tab 1　IC50(nmol·L-1) value for C085 on Abl kinase activity in vitro

抑制率/%=(陰性對照組發(fā)光值-藥物處理組發(fā)光值)/(陰性對照組發(fā)光值-陽性對照組發(fā)光值)×100%

結(jié)果表明，姜黃素衍生物C085對所有Abl激酶活性均有明顯抑制，IC50均在nmol·L-1級(jí)別。特別是對Abl-T315I也有相同的抑制作用，在0.2 μmol·L-1ATP條件下，IC50僅為(7.37±1.24) nmol·L-1。另外，在不同ATP濃度時(shí)，IC50未發(fā)生明顯改變，即C085對激酶抑制作用無明顯差異，這提示我們C085可能是非ATP競爭型激酶抑制劑。

2.4C085抑制K562/G01細(xì)胞中Bcr-Abl及其下游信號(hào)通路蛋白磷酸化Bcr-Abl主要通過持續(xù)激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。Bcr-Abl的下游促生長通路主要有P13K-AKT-mTOR、Ras-Raf-MEK-Erk及Stat3、Stat5。為進(jìn)一步驗(yàn)證C085抑制K562/G01細(xì)胞增殖與抑制Bcr-Abl激酶的關(guān)系，將不同濃度DMSO、IM及 C085 作用K562/G01細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，裂解后取上清蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡。從圖可知，C085可濃度依賴性的下調(diào)Bcr-Abl蛋白及其下游增殖相關(guān)通路信號(hào)分子的磷酸化水平，同時(shí)降低c-Raf、MEK、ERK的總蛋白含量(Fig 4)。結(jié)果表明，C085可能通過下調(diào)Bcr-Abl激酶活性，阻止Bcr-Abl蛋白及其下游信號(hào)分子的磷酸化，從而阻斷其下游增殖相關(guān)通路來殺傷K562/G01細(xì)胞。

2.5C085 通過線粒體通路誘導(dǎo)K562/G01細(xì)胞凋亡線粒體是傳輸細(xì)胞凋亡信號(hào)中至關(guān)重要的細(xì)胞器官。線粒體跨膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的耗散被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，主要是由于線粒體內(nèi)膜的通透性孔道(PT孔道)開放引起。PT孔道的開放釋放了膜間隙中與凋亡相關(guān)的活性物質(zhì)即各種促凋亡蛋白，如細(xì)胞色素C、AIF、Smac/DIABLO等；也削弱了線粒體膜兩側(cè)的質(zhì)子梯度，導(dǎo)致ATP合成下降；釋放的活性物質(zhì)激活caspase，引起細(xì)胞凋亡[9]。

Fig 2　Effect of C085 on induction of apoptosis in K562/G01 cells

Fig 3　C085 inhibits wild-type and mutant Abl kinase in vitro

Fig 5C085 triggers mitochondrial pathway of apoptosis in K562/G01 cellsA:Treatment of K562/G01 cells with C085 at indicated concentrations for 24 h significantly led to reduction of MMP examined by JC-1 staining.B:Treatment of K562/G01 cells with C085 at indicated concentrations for 24 h activated the stream of caspase-9,3 and PARP pathway analyzed by Western blot.

JC-1為陽離子脂質(zhì)突光染料,有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)。在正常細(xì)胞中線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1可選擇性的進(jìn)入線粒體，聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可逆的由綠色轉(zhuǎn)變成紅色；而當(dāng)細(xì)胞凋亡，線粒體膜電位降低，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體產(chǎn)生綠色熒光?？赏ㄟ^熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化，紅/綠比值可以衡量正常細(xì)胞的比例[10]。

從圖看出C085對K562/G01細(xì)胞線粒體跨膜電位能產(chǎn)生影響，線粒體膜電位紅綠比值降低，10 μmol·L-1時(shí)改變尤其明顯。說明C085能夠明顯降低MMP(Fig 5A)。MMP的改變促進(jìn)了細(xì)胞色素c的釋放，進(jìn)而裂解procaspases-9和3，最后裂解PARP(Fig 5B)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.6C085可抑制CML患者CD34+祖/干細(xì)胞我們已知C085對IM耐藥的CML細(xì)胞敏感, 那么這種作用是否同樣適用于CML患者的CD34+祖/干細(xì)胞？從對IM敏感及耐藥的CML病人骨髓中分離出CD34+祖/干細(xì)胞，通過觀察干細(xì)胞集落形成單位分析C085的增殖抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C085(2.5、5、10 μmol·L-1)可以有效的抑制CML病人的CD34+祖/干細(xì)胞的增殖，集落抑制率分別為34.40%、47.71%和58.26%，同時(shí)，對于IM耐藥的病人的CD34+細(xì)胞，抑制率也可達(dá)到30%、35.65%和50.78%(Fig 6A,B),兩者之間差異無顯著性(P>0.05).因此，同其他的白血病細(xì)胞一樣，從IM敏感及耐藥病人體內(nèi)提取的CD34+祖/干細(xì)胞對C085依然敏感。

Fig 6　Effects of C085 on CML progenitor/stem cells survival from human bone arrow

A：Colony formation of imatinib sensitive or-resistant CML CD34+cells.CD34+cells were isolated and cultured with low growth factors,either without inhibitiors(control),or in the presence of graded concentrations of C085 for 24 h and then plated in methylcellulose progenitor culture for 14 d.Data are presented as the percentage of suppression of CFUs compared to untreated controls No significant differences between CML and IM-resistant CML CD34+cells are indicated; B:Pictures of C085 inhibiting the growth of CD34+cells CFU photographed by fluorescent microscope.

3　討論

分子靶向治療的代表性藥物IM是針對Bcr-Abl激酶的藥物，取得了巨大成功。但隨著治療的進(jìn)行，因Bcr-Abl激酶域點(diǎn)突變和Bcr-Abl激酶活性增強(qiáng)等原因，產(chǎn)生的IM耐藥成為目前CML治療中亟待解決的難題。針對Bcr-Abl激酶活性繼續(xù)開發(fā)新一代酪氨酸激酶抑制劑是首要解決途徑。

Imatinib是ATP的競爭性Bcr-Abl抑制劑，只能高度特異性地結(jié)合于Bcr-Abl激酶非活化構(gòu)象上的ATP位點(diǎn)。這一特性使其不良反應(yīng)減小，但也易使突變株產(chǎn)生IM耐受[11-12]。而C085對IM耐受的CML細(xì)胞有較強(qiáng)的促凋亡作用，激酶實(shí)驗(yàn)也表明其也可強(qiáng)烈抑制野生型及點(diǎn)突變Abl激酶，特別是對Abl -T135I抑制作用也較強(qiáng)。IC50均在納摩爾級(jí)別，且隨著ATP濃度的增加未發(fā)生明顯變化，為非ATP競爭性抑制劑。

Bcr-Abl融合蛋白是CML 惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵蛋白。進(jìn)一步的作用機(jī)制研究表明，C085可通過抑制Bcr-Abl自身磷酸化，隨之抑制其下游信號(hào)分子Stat 5、Crkl的磷酸化，降低c-Raf、Mek、Erk激酶活性，并打開線粒體的PT孔降低膜電位，阻止caspase級(jí)聯(lián)的激活而促進(jìn)K562/G01細(xì)胞細(xì)胞凋亡。作用均強(qiáng)于IM。

在CML患者體內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)具有干細(xì)胞CD34抗原標(biāo)志-CD34+伴Bcr-Abl融合基因陽性的CML細(xì)胞。臨床實(shí)踐表明，此類細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特征，具有十分重要的研究價(jià)值，Ph+/CD34+/CXCR4+為CML白血病干細(xì)胞的標(biāo)志物[13]。CD34+細(xì)胞與CML病情進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸相關(guān)，與耐藥有關(guān)，包括IM在內(nèi)的許多藥物對其不敏感。而C085具有殺傷白血病患者CD34祖/干細(xì)胞，抑制其集落形成的能力，不僅對CML細(xì)胞有效，對IM耐藥的細(xì)胞也有抑制作用，有清除白血病患者骨髓CD34祖/干細(xì)胞的作用，這為其開發(fā)成新一代的慢性粒細(xì)胞白血病治療藥物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

BCR-ABL基因是重要的凋亡抑制基因之一，而其編碼的融合蛋白質(zhì)是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的根本原因，C085能以此為作用靶點(diǎn)，抑制其表達(dá)，將有望從發(fā)病本質(zhì)上殺傷CML細(xì)胞。而C085對IM耐藥的白血病細(xì)胞及耐藥病人的CD34+細(xì)胞均有殺傷作用，有望克服IM的耐藥而成為新的TKI。

(本課題完成于福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，在此對實(shí)驗(yàn)室的各位老師、同學(xué)的幫助表示由衷地感謝！)

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Key wods:curcumin derivative；C085; chronic myelogenous leukemia; imatinib resistance; Bcr-Abl; mutation

Curcumin derivative C085 inhibits proliferation of K562/G01 cells and activity of Bcr-Abl kinaseinvitro

WU Ying1,2,WU Li-xian1，XU Jian-hua1

(1.FujianKeyLaboratoryofNaturalMedicinePharmacology,2.DeptofNaturalMedicine,SchoolofPharmacy,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350122,China)

AimTo find new kinase inhibitors that overcome the imatinib resistance in the treatment of chronic myeloid leukemia(CML) by synthesizing C085, a novel derivative of curcumin, and testing its activities against wild-type(WT) and imatinib-resistant mutant Abl kinases, as well as in imatinib-resistant CML cellsinvitro.MethodsCell proliferation and apoptosis were examined using MTT assay and flow cytometry, respectively;Kinase activity was measured using Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay Platform in recombinant WT and mutant(Q252H, Y253F, and T315I) Abl kinases. The phosphorylation levels of Bcr-Abl initiated signaling proteins were analyzed using Western blotting. Colony forming units(CFU) growth was used to test the effects of C085 on human leukemia progenitor/stem cells.ResultsC085 suppressed the growth of imatinib-resistant K562/G01 cells and potently inhibited both WT and mutant(Q252H, Y253F, and T315I) Abl kinase activities in a non-ATP competitive manner with the values of IC50at low nanomole levels. C085 dose-dependently down-regulated Bcr-Abl kinase activity in K562/G01 cells as judged by autophosphorylation and Stat5,Crkl phosphorylation，and inhibited the phosphorylation of downstream targets Raf,Mek and Erk with protein content reducing. C085 could directly impact mitochondrial PT hole and make it open, which prevents the activation of caspase cascade reaction and induces the apoptosis.Furthermore, C085 significantly suppressed CFU growth, implicating that C085 could inhibit human leukemia progenitor/stem cells.ConclusionC085 may inhibit K562/G01 cells through inhibiting Bcr-Abl kinase activity and down-regulating the downstream signal proteins. Directly acting on mitochondrial PT hole and then activating apoptosis- associated proteins are also involved in the pro-apoptotic effect of C085.C085 is a promising compound for the treatment of CML patients with Bcr-Abl kinase domain mutations that confer imatinib resistance.

2016-02-10,

2016-04-18

福建省教育廳中青年教師資助項(xiàng)目(No JA13150)

吳鶯(1979-),女，碩士，講師，研究方向：藥理學(xué)，E-mail：wuying97414@tom.com；許建華(1958-)，男，博士，教授，研究方向：藥理學(xué)，E-mail:xjh@mail.fjmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.023

A

1001-1978(2016)07-1004-08

R282.71；R329.24；R329.25；R345.57；R733.7；R979.1

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-20 11:49網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.046.html