宋麗嬌，李　晉，姜　艷，陳　瑩，馬　琳，金　華，常艷旭

（天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津　300193）

·中藥研究·

蛇床子香豆素類(lèi)成分的含量測(cè)定及指紋圖譜研究*

宋麗嬌，李晉，姜艷，陳瑩，馬琳，金華，常艷旭

（天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

［目的］采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定不同批次蛇床子中6種香豆素類(lèi)成分的含量，并建立指紋圖譜分析方法評(píng)價(jià)其質(zhì)量。［方法］采用高效液相色譜法測(cè)定蛇床子中花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素與異歐前胡素的含量，并對(duì)17批蛇床子藥材進(jìn)行指紋圖譜相似度分析。色譜條件為Hedra ODS-2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脫，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。［結(jié)果］測(cè)定了不同批次蛇床子中6種化學(xué)組分的含量，建立蛇床子HPLC指紋圖譜，17批次藥材與對(duì)照指紋圖譜相似度均在0.980以上。［結(jié)論］建立的蛇床子中6種香豆素成分同時(shí)測(cè)定的HPLC方法及指紋圖譜可用于蛇床子的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；蛇床子；指紋圖譜；香豆素類(lèi)化合物

蛇床子為傘形科植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果實(shí)。蛇床子性溫、味苦，有小毒，具有燥濕祛風(fēng)、殺蟲(chóng)止癢、溫腎壯陽(yáng)的功效，用于治療陰癢帶下、濕疹瘙癢、濕痹腰痛、腎虛陽(yáng)痿和宮冷不孕［1］。在臨床上，外用治療各種皮膚病及滴蟲(chóng)性陰道炎，手、足癬感染等疾病［2］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)蛇床子還具有一定防治骨質(zhì)疏松及促進(jìn)透皮吸收等作用［3］，而其主要化學(xué)成分蛇床子素具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化以及抗腫瘤［4-6］等作用。蛇床子主要含有蛇床子素、佛手柑內(nèi)酯、花椒毒酚、花椒毒素、歐前胡素、異歐前胡素、異虎耳草素、哥倫比亞內(nèi)酯等香豆素類(lèi)化合物，倍半萜類(lèi)揮發(fā)油，色酮類(lèi)以及黃酮類(lèi)化合物等成分［7-8］，由于香豆素類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)相似，為蛇床子化學(xué)成分分離以及測(cè)定增加了一定難度［9］，故對(duì)其分析方法的優(yōu)化不斷涌現(xiàn)［10-14］。本研究采用高效液相色譜法能夠同時(shí)測(cè)定蛇床子中6種香豆素類(lèi)成分的含量，比較了不同批次樣品含量差異，并建立蛇床子藥材高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，計(jì)算各批藥材相似度進(jìn)行綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1　儀器與材料

1.1儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），包括四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，可變波長(zhǎng)檢測(cè)器（VWD）；十萬(wàn)分之一電子天平（METTLER TOLEDO）；BP121S萬(wàn)分之一天平（德國(guó)賽托利斯公司）；SB-1000YDTD超聲清洗槽（寧波新芝生物科技股份有限公司）；3K15離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠）。

1.2試劑與藥材

1.2.1試劑花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素與異歐前胡素對(duì)照品均購(gòu)買(mǎi)于成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇為色譜純（天津康科德試劑公司），甲酸（美國(guó)ACS恩科化學(xué)），其它試劑均為分析純，水為超純水（Millipore公司，Mill-QⅡ型）。

1.2.2藥材蛇床子藥材17批分別購(gòu)自不同藥店。蛇床子藥材粉碎后過(guò)100目篩，備用。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1色譜條件色譜柱Hedra ODS-2柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）；流速為0.5mL/min。梯度洗脫程序?yàn)椋?～5min，5～35% A；5～13 min，35～60%A；13～30 min，60～65%A；30～38 min，65～75%A；38～45 min，75～90%A；45～50 min，90%A；50～58 min，90～95%A；58～59 min，95～5%A；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。其HPLC色譜圖如圖1所示。

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81503213）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（TD12-5033）。

作者簡(jiǎn)介：宋麗嬌（1991-），女，碩士在讀，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。

通訊作者：常艷旭，E-mail：tcmcyx@126.com。

圖1　蛇床子對(duì)照品（A）與樣品（B）的高效液相色譜圖Fig.1　HPLC chromatograms of standards（A）and samples （B）of Cnidium monnieri（L.）Cuss

2.2對(duì)照品溶液的制備分別精密稱(chēng)取花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素對(duì)照品，均用甲醇配制為1 mg/mL溶液，再分別吸取上述各標(biāo)準(zhǔn)品溶液一定量，并用甲醇稀釋得到一系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液，備用。2.3測(cè)定精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣，測(cè)定，即得。

2.4正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了不同甲醇提取濃度（50%、75%、100%）、不同料液比（0.1 g/5 mL、0.1 g/10 mL、0.1 g/20 mL）、不同提取時(shí)間（20 min、30 min、40 min）3個(gè)因素對(duì)這6個(gè)化合物提取總量的影響，根據(jù)正交設(shè)計(jì)軟件采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)［15］。

2.5供試品溶液的制備精密稱(chēng)取蛇床子粉末0.05 g，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，超聲提取40 min，所得溶液14 000 r/min離心10 min，取上清，作為供試品溶液。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1方法學(xué)考察

3.1.1線性關(guān)系考察按照2.1項(xiàng)下的色譜條件依次進(jìn)樣各濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以對(duì)照品溶液的濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，見(jiàn)表1。結(jié)果表明，花椒毒素、異虎耳草素和佛手柑內(nèi)酯在0.400～100 μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，而歐前胡素、蛇床子素與異歐前胡素分別在 0.800～200 μg/mL，1.600～400 μg/mL和0.250～50 μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1　蛇床子中6種有效成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性、定量限和檢測(cè)限Tab.1 The calibration curves，linearity ranges，LODs，LOQs of 6 active ingredients in Cnidium monnieri（L.）Cuss

3.1.2精密度實(shí)驗(yàn)取同一混合對(duì)照品溶液，按上述2.1項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素的峰面積，其相應(yīng)峰面積的RSD分別為0.97%、1.02%、0.79%、0.81%、1.20%和0.53%，表明儀器精密度良好。

3.1.3重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取同一批次蛇床子藥材粉末6份，精密稱(chēng)定，按上述2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，計(jì)算花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素峰面積的RSD分別為3.39%、3.20%、3.31%、3.24%、3.41%和4.88%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

3.1.4穩(wěn)定性考察取同一混合對(duì)照品溶液，按上述2.1項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10、12 和24 h進(jìn)樣，計(jì)算6種化學(xué)成分峰面積的RSD分別為0.66%、0.83%、0.72%、1.08%、0.89%和0.70%，表明該樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱(chēng)取已知含量的蛇床子粉末6份，分別加入一定量的花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素對(duì)照品溶液，按2.5項(xiàng)下方法提取并進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算這6種化合物的平均回收率，分別為101%、99.4%、99.4%、100%、97.7%和100%，結(jié)果見(jiàn)表2。

3.2樣品含量測(cè)定精密稱(chēng)取17批蛇床子藥材粉末，按照供試品溶液的制備方法制備不同批次供試品溶液，根據(jù)回歸方程計(jì)算供試品溶液中6種香豆素類(lèi)化合物含量，結(jié)果見(jiàn)表3。在測(cè)定蛇床子藥材的6種化學(xué)成分中，蛇床子素含量最高，其次為歐前胡素，花椒毒素、異虎耳草素與佛手柑內(nèi)酯，而異歐前胡素含量最低，且在S10、S11、S13和S14批次中，其含量未達(dá)到定量限要求，故未列出其含量。

表2　蛇床子中6種有效成分的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2　The recoveries of 6 active ingredients in Cnidium monnieri（L.）Cuss

表3　不同批次樣品中6種化學(xué)成分的含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Contents of six active components in different batches of Cnidium monnieri（L.）Cuss mg/g

3.3指紋圖譜的建立

3.3.1指紋圖譜的重現(xiàn)性、精密度和穩(wěn)定性取同一批次蛇床子樣品6份，按上述方法提取，進(jìn)樣并記錄色譜圖，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果顯示各峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于0.24%，相對(duì)峰面積的RSD小于2.92%，表明該方法重現(xiàn)性良好；取同一份樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于0.24%，相對(duì)峰面積的RSD小于2.61%，結(jié)果顯示精密度良好；取同一份樣品溶液分別于0、2、4、6、8、10、12和24 h進(jìn)樣并記錄色譜圖，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于0.44%，相對(duì)峰面積的RSD小于2.89%，表明該樣品于24 h內(nèi)穩(wěn)定［16］。

3.3.2指紋圖譜的建立將上述17批蛇床子樣品HPLC色譜圖進(jìn)行指紋圖譜分析，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）”軟件生成對(duì)照指紋圖譜，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理［17］，其HPLC指紋圖譜見(jiàn)圖2。該指紋圖譜中有12個(gè)共有峰，其中可確認(rèn)峰6所代表的化學(xué)成分為花椒毒素，峰8為異虎耳草素，峰9為佛手柑內(nèi)酯，峰10為歐前胡素，峰11為蛇床子素。計(jì)算各批次蛇床子藥材指紋圖譜與生成的對(duì)照?qǐng)D譜R的相似度，結(jié)果見(jiàn)表4。其相似度計(jì)算結(jié)果顯示，17批蛇床子藥材指紋圖譜相似度均大于0.980。

表4　相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.4　Results of similarity evaluation

4　討論

首先本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品提取條件進(jìn)行優(yōu)化，比較該6種化學(xué)成分的含量，結(jié)果顯示，0.1g蛇床子藥材于20 mL 100%甲醇超聲提取40 min的條件下其總量最高，故應(yīng)用此條件作為供試品的最佳提取條件。HPLC測(cè)定不同批次蛇床子中6種香豆素類(lèi)化合物的含量，采用甲醇-0.1%甲酸水進(jìn)行梯度洗脫，分離效果較好，且峰形較佳。

目前傳統(tǒng)HPLC法同時(shí)測(cè)定香豆素類(lèi)化合物的數(shù)目較少［18］，故發(fā)展了液-質(zhì)聯(lián)用等方法對(duì)蛇床子進(jìn)行定量［19］，但其成本較高，而本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法即可對(duì)17批蛇床子藥材中6種主要香豆素類(lèi)化合物進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示，17批蛇床子藥材中蛇床子素含量均在11.3～50.0 mg/g（1.13%～5.00%）范圍內(nèi)，《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，本品按干燥品計(jì)算，含蛇床子素不得少于1.0%［1］，即各批藥材均符合中國(guó)藥典規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)以花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素和蛇床子素為指標(biāo)，測(cè)定不同產(chǎn)地6種香豆素類(lèi)化合物的含量，該結(jié)果表明廣西、安徽產(chǎn)蛇床子香豆素類(lèi)化合物含量較高，即不同批次蛇床子其香豆素類(lèi)化合物含量差異較大。中藥指紋圖譜能較全面地反映中藥中所含化學(xué)成分的組成及含量分布情況，進(jìn)而對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)［20］。通過(guò)采用高效液相色譜法測(cè)定6種化學(xué)組分的含量，可得知不同批次藥材中6種化學(xué)成分的含量差異，故采用中藥指紋圖譜從而全面分析17批次藥材間差異。根據(jù)相似度計(jì)算結(jié)果可以得知，與對(duì)照指紋圖譜相比較，17批蛇床子藥材相似度均大于0.980，符合中藥指紋圖譜研究的技術(shù)要求。根據(jù)HPLC測(cè)定結(jié)果，可確定17批次藥材有12個(gè)共有峰，其中包括本實(shí)驗(yàn)已測(cè)定的化學(xué)成分，分別為花椒毒素、異虎耳草素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素與蛇床子素，故在采用HPLC指紋圖譜時(shí)可以與5種化學(xué)成分為指標(biāo)來(lái)全面評(píng)價(jià)蛇床子藥材的質(zhì)量差異，并為不同產(chǎn)地蛇床子樣品之間的鑒別提供科學(xué)依據(jù)。

圖2　17批蛇床子樣品HPLC指紋圖譜Fig.2　HPLC fingerprint chromatograms of 17 batches of Cnidium monnieri（L.）Cuss

5　結(jié)論

建立了蛇床子中6種化合物同時(shí)進(jìn)行分離與測(cè)定HPLC分析方法，該方法準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便、易行。同時(shí)建立了蛇床子HPLC指紋圖譜，可對(duì)不同批次蛇床子的質(zhì)量差異進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，可為蛇床子質(zhì)量控制研究提供一定參考。

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（本文編輯：高杉，于春泉）

Simultaneous determination of coumarins and fingerprint analysis in Cnidium monnieri（L.）Cuss.

SONG Li-jiao，LI Jin，JIANG Yan，CHEN Ying，MA Lin，JIN Hua，CHANG Yan-xu
（Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］A fingerprint analysis and simultaneous determination of six coumarins were established and validated to evaluate the quality of different batches of Cnidium monnieri（L.）Cuss.［Methods］The contents of xanthotoxin，isopimpinelline，bergapten，imperatorin，osthole and isoimperatorin were determined by HPLC.The analysis was carried out on Hedra ODS-2 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）.The mobile phase was methanol-0.1%formic acid water aqueous solution in gradient elution.The flow rate was 0.5 mL/min and the detection wave length was 320 nm.［Results］The contents of six components in various bathes of samples were determined and HPLC fingerprint was established.The similarities of 17 batches of Cnidium monnieri（L.）Cuss.were more than 0.980.［Conclusion］The established method could be suitable to evaluate the quality control of Cnidium monnieri（L.）Cuss.

HPLC；Cnidium monnieri（L.）Cuss.；fingerprint；coumarins

R284.2

A

1672-1519（2016）06-0368-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.06.13

2016-01-18）