郭冰玉, 張 宇, 回 薔, 常 鵬, 陶 凱

作者單位：110084 遼寧 沈陽,沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 整形外科

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柚皮苷抑制黑色素瘤的生長與轉(zhuǎn)移

郭冰玉, 張 宇, 回 薔, 常 鵬, 陶 凱

作者單位：110084 遼寧 沈陽,沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 整形外科

目的 初步探索柚皮苷對黑色素瘤細胞生長與遷移的抑制作用。方法 使用不同濃度的柚皮苷分別處理A375細胞，應用MTT法檢測不同處理因素對A375細胞增殖的影響，利用TRANSWELL實驗檢測不同處理因素對A375細胞遷移的作用。通過WESTERN BLOT及REAL-TIME PCR方法檢測不同因素作用下相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果 不同濃度的柚皮苷對A375細胞增殖與遷移均有一定的抑制作用，其中10、20、40 μm/L柚皮苷作用24 h后，對A375細胞增殖的抑制率分別為(40.01±0.74)%、(48.69±3.66)%和(54.32±1.61)%。20、40 μm/L柚皮苷作用24 h后，對A375細胞遷移的抑制率分別為(18.44±3.89)%和(38.14±7.98)%。柚皮苷對A375細胞增殖與遷移功能的抑制作用隨著劑量增加。柚皮苷對調(diào)控細胞增殖、遷移的CDK4等蛋白均有抑制作用。結(jié)論 柚皮苷對黑色素瘤細胞A375細胞增殖與轉(zhuǎn)移均有抑制作用，可以作為臨床治療黑色素瘤的新的潛在藥物而進一步研究。

黑色素瘤； 柚皮苷； 增殖； 遷移； A375

黑色素瘤的5年生存率不足10%，其致死率占皮膚腫瘤的首位[1]。近年來，黑色素瘤的發(fā)病率逐年升高，而不斷改進的手術(shù)方案與化療措施并不能很好地提高患者的生存率[2]。很多報道指出，致癌基因的突變是黑色素瘤誘發(fā)的主要因素，因此，越來越多的靶向藥物研究進入了人們的視線[3]。柚皮苷(naringin)是一種雙氫黃酮類化合物，目前已被證明具有抗氧化、抗炎等多種生物學活性[4]。也有研究指出，柚皮苷是一種潛在的抗癌藥物，但作用機制并不明確[5]。柚皮苷已被證明可以抑制如乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、腸癌和卵巢癌等多種腫瘤細胞的生長與侵襲轉(zhuǎn)移[6]。自2015年6月至2016年1月，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院整形外科以人黑色素瘤細胞A375作為研究對象，初步探索柚皮苷對于A375細胞增殖與遷移的影響，并且進一步初探對其起作用的原因。

1 對象與方法

1.1 研究對象

人黑色素瘤A375細胞株(實驗室凍存)；DMEM培養(yǎng)基(美國INVITROGEN公司)；胎牛血清(天津灝洋)；柚皮苷(美國SELLECK公司)；0.4 %臺盼藍，抗體： CDK4，CDK6，MMP2，MMP9和GAPDH(美國SANTA公司)；SYBR Green (美國PROMEGA公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人黑色素瘤細胞A375使用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 藥物處理濃度 通過前期試驗篩選，柚皮苷選取10、20、40 μm/L 3個濃度，使用生理鹽水配置；對照組使用生理鹽水處理。

1.2.3 MTT實驗 將處于對數(shù)生長期的A375細胞以1×104每孔的密度接種于96孔板中，細胞培養(yǎng)12 h添加不同處理因素，每組每個時間點設3個復孔。藥物處理后分別取0、12、24、36、48 h時間點添加5 mg/ml MTT 10 μl，孵育4 h后，小心吸去培養(yǎng)基，每孔中加入100 μl DMSO，溶解MTT-甲臜結(jié)晶，15 min后，在490 nm處記錄吸光值。

1.2.4 TRANSWELL實驗 對數(shù)生長期細胞以1×105每孔的密度接種于TRANSWELL小室中，終體積200 μl，下室加入600 μl無血清培養(yǎng)基；12 h后更換培養(yǎng)基，使用不同藥物濃度處理細胞，每組設3個復孔。藥物作用24 h后，棉簽擦去上層細胞，95%乙醇固定20 min，0.4%臺盼藍染色20 min。200倍顯微鏡下觀察。

1.2.5 WESTERN BLOT檢測蛋白表達水平 對數(shù)生長期的細胞于6孔板中，貼壁培養(yǎng)12 h后，添加不同濃度的藥物進行處理，藥物作用24 h后收集細胞，提取總蛋白；電泳、轉(zhuǎn)膜后，室溫封閉1 h；一抗4℃過夜。二抗室溫1 h。

1.2.6 REALTIME PCR檢測蛋白RNA表達水平 通過TRIZOL法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行REALTIME PCR反應。所用引物為CDK4,F(5′-3′):CTGGTGACAAGTGGTGGAAC;R(5′-3′):GGTCGGCTTCAGAGTTTCC;CDK6,F(5′-3′):GTCTGATTACCTGCTCCGC;R(5′-3′):CCTCGAAGCGAAGTCCTC;MMP2,F(5′-3′):CGCATCTGGGGCTTTAAAC;R(5′-3′):CAGCACAAACAGGTTGCAG;MMP9,F(5′-3′):CGACGTCTTCCAGTACCGAG;R(5′-3′):GTATCCGGCAAACTGGCT;GAPDH,F(5′-3′):CATCCCTTCTCCCCACACAC;R(5′-3′):AGTCCCAGGGCTTTGATTTG。

1.2.7 劃痕實驗 在6孔板加入約5×105個細胞。第2天用槍頭比對著直尺劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用PBS洗細胞3次，去除漂浮的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h時取樣，拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的藥物對A375細胞增殖的影響

對不同濃度的柚皮苷處理后，在不同的時間點下，通過MTT檢測細胞的增殖情況(圖1)。結(jié)果顯示，柚皮苷可以抑制A375細胞的增殖。柚皮苷對A375細胞增殖的抑制作用隨著濃度的增加而增加(圖2)。

2.2 不同濃度的柚皮苷對A375細胞增殖相關(guān)蛋白的影響

不同濃度的柚皮苷對CDK4和CDK6均有一定程度的抑制作用，隨著藥物濃度的升高抑制作用增強(圖3)。

2.3 不同濃度的柚皮苷對A375細胞轉(zhuǎn)移的影響

不同濃度的柚皮苷作用24 h后，對A375細胞的轉(zhuǎn)移功能均有一定程度的抑制，其抑制率隨著藥物濃度的增加而增加。通過transwell實驗發(fā)現(xiàn)，不同濃度的柚皮苷具有抑制A375細胞轉(zhuǎn)移的作用，隨著濃度的增高，抑制作用有所增強(圖4)。劃痕實驗證實，柚皮苷處理后細胞遷移能力減慢。

2.4 不同濃度的柚皮苷對A375細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的影響

不同濃度的柚皮苷對MMP2與MMP9均有一定程度的抑制作用，隨著藥物濃度的升高抑制作用增強(圖5～7)。

圖1 不同濃度柚皮苷處理后A375細胞的增殖情況 圖2 不同劑量柚皮苷對A375細胞增殖的抑制率 圖3 不同濃度柚皮苷作用下A375細胞蛋白的變化 圖4 不同劑量的柚皮苷作用下A375細胞的轉(zhuǎn)移情況 a. Nacl. b. 20 μm/L. c. 40 μm/L. 圖5 不同濃度柚皮苷作用下A375細胞蛋白的變化 圖6 不同濃度柚皮苷處理后A375細胞MMP2, MMP9的影響 圖7 不同濃度柚皮苷處理后A375細胞蛋白RNA水平的影響
Fig 1 The proliferation of A375cells treated by Naringin with different concentrations. Fig 2 The inhibition on A375 cell proliferation treated by Naringin with different concentrations. Fig 3 The changes of A375 proteins treated by Naringin with different concentrations. Fig 4 The migration of A375 cells treated by Naringin with different concentrations. a. Nacl. b. 20 μm/L. c. 40 μm/L. Fig 5 The proteins of A375 cells treated by Naringin with different concentrations. Fig 6 The MMP2 and MMP9 levels of A375 cells treated by Naringin with different concentrations. Fig 7 The RNA levels of A375 cells treated by Naringin with different concentrations.

3 討論

黑色素瘤具有惡性程度高、增殖快、易發(fā)生淋巴結(jié)等部位的遠隔轉(zhuǎn)移等特點[7]。雖然近年來手術(shù)及各種放化療方法不斷改進[8]，但黑色素瘤患者的生存率仍然不高。因此，尋找新的靶向藥物，針對黑色素瘤進行靶向治療對于提高患者生存率有很大意義。

目前多種研究發(fā)現(xiàn)，中藥不僅對腫瘤細胞具有直接殺傷作用，還可以對抗放化療所產(chǎn)生的并發(fā)癥與不良反應，而且中藥不易產(chǎn)生耐受現(xiàn)象，對身體不良反應較小，因此，中藥是目前腫瘤治療研究的熱點。有報道指出在腫瘤患者的化療過程中，中藥的配合使用可以有效地減輕化療藥物導致的如惡心、嘔吐、食欲不振等不良反應，從而提高患者的生活質(zhì)量，改善預后，延長患者生存時間。柚皮苷全稱為柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，主要存在于蕓香科植物中，作為重要的有效成分已經(jīng)被報道對多種腫瘤有抑制作用。在結(jié)腸癌細胞中，柚皮苷可以通過調(diào)節(jié)p21蛋白的表達，抑制細胞的增殖。乳腺癌細胞中柚皮苷可以調(diào)節(jié)wnt通路抑制細胞的生長[9]。也有報道指出，柚皮苷可以降低基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，抑制腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[10]。與此同時，柚皮苷也可以通過抑制c-src通路來調(diào)節(jié)細胞的代謝水平，進而通過抑制細胞的糖代謝，對細胞的生長與侵襲轉(zhuǎn)移起到抑制作用[11]。

CDK4與CDK6是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，可以與細胞周期素D結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞G1/S期的轉(zhuǎn)換。CDK4與CDK6的特異性激活與腫瘤的增殖密切相關(guān)，人類大約80%的腫瘤都存在CDK4/CDK6異常表達的現(xiàn)象[12]。CDK4/CDK6的異常表達，可以加速G1期的進程，加速腫瘤細胞增殖，使腫瘤細胞獲得生存優(yōu)勢。因此，CDK4/CDK6已成為抗腫瘤的藥物靶點而被廣泛研究[13]。研究表明，CDK4/CDK6的靶向抑制劑具有較小的細胞毒性及較高的藥物敏感性[14]。腫瘤轉(zhuǎn)移的基本過程大致為：形成早期原發(fā)灶，生成相關(guān)血管，細胞脫落而侵入基質(zhì)，細胞進入脈管系統(tǒng)而形成癌栓，進一步生長成轉(zhuǎn)移灶[15]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可以降解細胞外基質(zhì)，這是導致腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白酶。其中，MMP2和MMP9均屬于明膠類基質(zhì)金屬蛋白酶，可以水解細胞外基質(zhì)，促進癌細胞轉(zhuǎn)移[16]。與此同時，MMP2與MMP9也可以啟動血管基底膜的蛋白降解，為內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)移開辟通路，進一步促進血管生成[17]。也有研究證明，MMP2與MMP9具有一定的生長因子釋放功能[18]。因此，許多靶向藥物是通過抑制MMPs來對腫瘤起到抑制作用[19]。

本研究表明，不同濃度的柚皮苷對人黑色素瘤細胞A375均有一定程度的抑制作用，它可以抑制細胞的增殖與轉(zhuǎn)移。實驗結(jié)果表明，柚皮苷在很低的濃度(40 μm/L)時，對細胞的抑制率可以達到50%。柚皮苷可以通過抑制CDK4/CDK6、MMP2和MMP9來實現(xiàn)對細胞增殖與轉(zhuǎn)移的抑制作用。

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Inhibition of Naringin in the growth and migration of melanoma

GUOBing-yu,ZHANGYu,HUIQiang,CHANGPeng,TAOKai.

(DepartmentofPlasticSurgery,TheGeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang110084,China)

TAOKai，Email:13309887570@163.com

Objective To explore the effect of Naringin on the growth and migration of melanoma cells.Methods A375 cells were treated with Naringin at different concentrations, MTT assay was used to detect the influence on the proliferation of A375 cells; Transwell assay was used to detect the effect on migration. The proteins which were associated with proliferation and migration were detected by western blot and real-time PCR. Results Different concentrations of Naringin had certain inhibition on A375 cell proliferation and migration. The inhibition rates on A375 cell proliferation at 24 hours after treatment of 10 μm/L, 20 μm/L and 40 μm/L Naringin were (40.01±0.74)%， (48.69±3.66)% and (54.32±1.61)%, the inhibition rates on A375 cell migration at 24 hours after treatment of 20 μm/L and 40 μm/L Naringin were (18.44±3.89)% and (38.14±7.98)%. Inhibitions on A375 cells proliferation and migration were enhanced as the dose increased. At the same time Naringin can significantly inhibit the expression of the proteins which were associated with the cells proliferation and migration. Conclusion Naringin can inhibit the proliferation and migration of A375 cells, which means that it may provide a new strategy for the treatment of melanoma cancer.

Melanoma; Naringin; Proliferation; Migration; A375

郭冰玉(1989-)，女，遼寧沈陽人，技師，碩士研究生.

陶 凱,110084,沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 整形外科,電子信箱：13309887570@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.08.019

R739.5

A

1673-7040(2016)08-0503-04

2016-05-16)