唐昊　祁海峰　王耀麗　楊雪飛　李鵬飛　雷洋　張鵬　周健

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血小板線粒體調(diào)節(jié)肺毛細(xì)血管屏障功能的實(shí)驗(yàn)研究

唐昊祁海峰王耀麗楊雪飛李鵬飛雷洋張鵬周健

400042 重慶， 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

【摘要】目的探討血小板線粒體對肺損傷(ALI)時(shí)肺毛細(xì)血管通透性的調(diào)節(jié)作用。方法建立鹽酸(pH 1.2, 1.5 ml/kg)誘發(fā)的急性肺損傷動物模型，通過肺毛細(xì)血管濾過系數(shù)、流式細(xì)胞儀檢測、共聚焦顯微鏡方法，觀察血小板線粒體對鹽酸致急性肺損傷形成中肺毛細(xì)血管屏障功能的影響。結(jié)果與正常組比較，鹽酸致肺損傷模型中肺毛細(xì)血管濾過系數(shù)增高2.5倍(n=4,P<0.05)，滅活血小板線粒體后，肺毛細(xì)血管濾過系數(shù)增高5倍(n=4,P<0.05)。流式細(xì)胞儀分析血小板線粒體轉(zhuǎn)移到白細(xì)胞中；共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，血小板與中性粒細(xì)胞相互作用促進(jìn)肺損傷。結(jié)論抑制血小板線粒體功能增加鹽酸誘導(dǎo)的肺損傷，肺血管內(nèi)皮屏障依賴于血小板線粒體的功能，線粒體從血小板傳遞給白細(xì)胞可導(dǎo)致增加白細(xì)胞粘附到損傷的微血管內(nèi)皮。

【關(guān)鍵詞】急性肺損傷；血小板；肺微血管屏障功能；線粒體

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)和/或急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是重癥醫(yī)學(xué)科臨床常見的疾病[1-3]。ARDS的臨床特征為難治性低氧血癥和進(jìn)行性呼吸窘迫，其主要病理變化為肺不張、形成透明膜、肺水腫，以通透性增強(qiáng)、肺毛細(xì)血管彌漫性損傷為基礎(chǔ)。據(jù)國內(nèi)外臨床醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)，其病死率在50%以上，該病預(yù)后極差、發(fā)展迅猛、起病急驟[4-6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，血小板與ARDS的發(fā)病密切相關(guān)[7-12]。一方面，ARDS促進(jìn)血小板的活化，ARDS時(shí)，血小板在數(shù)量、結(jié)構(gòu)、功能、生化等方面都會發(fā)生改變；另一方面，血小板促進(jìn)ARDS的發(fā)病過程，ARDS時(shí)，活化的血小板沉積在受損的肺微血管系統(tǒng)內(nèi)，有助于引發(fā)和加劇肺泡損傷；血小板與白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞因子相互作用促進(jìn)ARDS的發(fā)病，也可通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)ARDS的發(fā)病。為此，我們對血小板線粒體在鹽酸致肺損傷模型中調(diào)節(jié)肺毛細(xì)血管通透性的作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，旨在為探討ALI中血小板和內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的相互作用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

選擇健康清潔級雄性小鼠(8～12 周齡，C57BL/6,體質(zhì)量 20～25 g，由哥倫比亞醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，CD41、CD45和VE-鈣黏素等免疫熒光抗體均購自重慶賽奧生物生物技術(shù)有限公司；大鼠抗小鼠的CD144 (VE-cadherin)抗體，大鼠抗小鼠的CD41-FITC, 大鼠抗小鼠的CD45 PE抗體均購自eBioscience公司, 肺毛細(xì)血管濾過系數(shù)測定實(shí)驗(yàn)儀器和軟件，共聚焦顯微鏡儀器和分析軟件，由哥倫比亞醫(yī)學(xué)中心Jahar實(shí)驗(yàn)室提供。

二、實(shí)驗(yàn)動物分組

用完全隨機(jī)方法將實(shí)驗(yàn)動物小鼠60只分為兩組，每組30只。①生理鹽水對照組(control group)；②鹽酸誘發(fā)ALI組(acid-induced acute lung injury group)。小鼠用戊巴比妥鈉腹腔麻醉，然后用 1 mol/L HCl(2 μl/g, pH=1.5)經(jīng)鼻滴入氣管內(nèi)復(fù)制動物模型，于灌注后第 2 h處死，留取血清，右肺組織用 10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，左肺于-80 ℃液氮中保存?zhèn)溆?。用免疫組化法測定肺組織中纖維蛋白含量，通過病理切片HE染色及天狼星紅染色觀察肺組織膠原纖維沉積情況；用離體肺進(jìn)行體外肺毛細(xì)血管濾過系數(shù)的測定及共聚焦顯微鏡觀察。

三、檢測指標(biāo)與方法

參照文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道的方法，建立了離體血液灌注鼠肺的準(zhǔn)備，保持肺動脈壓、左心房壓、氣道壓力分別在12， 3和5 cmH2O，以恒定的血流量(0.5 ml/min)，流量(0.5 ml/min，37 ℃)；灌輸生理鹽水或鹽酸至氣管內(nèi)，獲得過濾系數(shù)后1 h，利用小鼠離體肺灌流模型,采用肺重量分析法測定肺毛細(xì)血管濾過系數(shù) (Kf); 用EDT法，4 ℃條件下，新鮮分離肺微血管內(nèi)細(xì)胞，免疫染色后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測和分析，進(jìn)一步封片用激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白CD41、CD45和VE-鈣黏素等的表達(dá);用 EDT法，4 ℃條件下，分離肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步用抗體 IκBα、TF、vWF、VE-鈣黏素和 P-選擇素免疫熒光染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測和分析不同抗體在不同細(xì)胞上的表達(dá)，封片并用適時(shí)激光共聚焦顯微鏡觀察其在細(xì)胞中的表達(dá)及定位。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)　　果

一、血小板灌注對肺微血管濾過系數(shù)的影響

正常對照組基線Kf是0.22±0.04 ml/(cmH2O·min·100 g wet lung weight)。鹽酸滴注氣道后，Kf是對照組的2.5倍，說明微血管損傷。魚藤酮治療的血小板組Kf升幅5倍，而未經(jīng)處理的血小板組，Kf升幅2.5倍。魚藤酮治療血小板增加肺損傷。由此，抑制血小板線粒體功能會增加肺微血管濾過系數(shù)，見圖1。

二、魚藤酮對血小板聚集和體外血小板線粒體轉(zhuǎn)移的影響

為了探討血小板轉(zhuǎn)移線粒體的可能性，確定了血小板特異性蛋白作為標(biāo)志物，CD41和線粒體黛(綠色)。我們標(biāo)記分離的細(xì)胞為血小板用CD41(α2B，Ⅱb / Ⅲa受體復(fù)合物)，血小板線粒體黛綠色，在控制血小板數(shù)量的條件下，對照組血小板表達(dá)CD41和MTG的數(shù)量少，魚藤酮提高血小板表達(dá)CD41和MTG的數(shù)量，表明血小板線粒體被轉(zhuǎn)移到其他的血小板。流式細(xì)胞技術(shù)檢測顯示，線粒體從對魚藤酮中毒血小板朝著健康的血小板遷移，見圖2。

圖2　魚藤酮對血小板聚集和體外血小板線粒體轉(zhuǎn)移的影響

三、線粒體從血小板轉(zhuǎn)移到白細(xì)胞

鹽酸誘導(dǎo)肺微血管的適時(shí)肺成像，肺微血管被灌注入紅色熒光鈣黃綠素紅(5 μM，20 min，藍(lán))，血小板表達(dá)DsRed的(紅)和白細(xì)胞表達(dá)鈣黃綠素綠(綠色)。共聚焦顯微鏡呈像表示血小板白細(xì)胞共定位。從血小板線粒體轉(zhuǎn)移到白細(xì)胞導(dǎo)致增加白細(xì)胞粘附到受傷的肺微血管。紅色和綠色熒光的共定位是由黃色在微血管白細(xì)胞呈現(xiàn)的,見圖3。

討　　論

研究證明，線粒體從血小板轉(zhuǎn)移到白細(xì)胞導(dǎo)致白細(xì)胞黏附到受損微血管的數(shù)量增加，抑制血小板線粒體電子傳遞可使肺微血管滲透性增加。在鹽酸引起的肺損傷模型實(shí)驗(yàn)中，血小板可促進(jìn)肺泡毛細(xì)血管內(nèi)膜損傷，造成滲透性肺水腫。通過本實(shí)驗(yàn)，推測激活的血小板介導(dǎo)的ALI可能通過包括聚合、 介質(zhì)的釋放，以及內(nèi)皮細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，并與多形核白細(xì)胞和單核細(xì)胞，共同引發(fā)或擴(kuò)增了炎性損傷的相互作用的機(jī)制，這種相互作用可能是基于血小板線粒體的功能。線粒體不僅是必需的，而且在大多數(shù)的細(xì)胞中作為供能以穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境。該細(xì)胞器還通過產(chǎn)生活性氧調(diào)節(jié)胞內(nèi)的信號，并通過細(xì)胞色素C的釋放引發(fā)細(xì)胞凋亡。在小鼠鹽酸引起的肺損傷模型中，與對照組相比，線粒體從血小板轉(zhuǎn)移到白細(xì)胞導(dǎo)致白細(xì)胞黏附于微血管的數(shù)量增加，從而導(dǎo)致肺損傷。

圖1抑制血小板線粒體功能增加肺微血管濾過系數(shù)

圖3魚藤酮對血小板聚集和體外血小板線粒體轉(zhuǎn)移的影響

這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了急性肺損傷相關(guān)的血管功能障礙機(jī)制，血小板可增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞促凝血蛋白表達(dá)，可能原因是酸性損傷增加了CD45片段的VE-鈣黏附分子上血小板蛋白CD41和CD42b的表達(dá)，指示血小板蛋白轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮。蛋白表達(dá)的原因是因?yàn)榧?xì)胞上的游離血小板來源的蛋白增強(qiáng)了內(nèi)皮促凝血反應(yīng)[13-18]。肺的炎癥損傷通過內(nèi)皮表面血小板衍生蛋白的沉積引起促凝血表型在肺部的表達(dá)。本研究同時(shí)支持一個(gè)新的關(guān)于組織因子(tissue factor, TF)出現(xiàn)在內(nèi)皮表面的機(jī)制[4]。對于TF大多數(shù)的理解來源于體循環(huán)，主要是基于TF通過纖維母細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞表達(dá)。病理狀態(tài)下，例如膿毒癥，TF可在單核細(xì)胞和人血小板中表達(dá)[8-10]。酸性物質(zhì)損傷內(nèi)皮表面表達(dá)的TF可能不是來源于血管平滑肌，而完全來源于血小板。內(nèi)皮表達(dá)的CD41和CD42b的酸性損傷證實(shí)來源于血小板的蛋白具有體外活性[9]，這種變化的發(fā)生是內(nèi)皮游離血小板持續(xù)黏附和脫離的結(jié)果。此外，這些血小板表達(dá)中對酸性損傷的增強(qiáng)是血小板內(nèi)皮通過肺血管表面與構(gòu)成VE鈣黏蛋白在肺血管表面廣泛的區(qū)域相互作用的證據(jù)[11-12]。既然活化的血小板釋放了CD41+和CD42b+微粒，很可能血小板微粒在蛋白轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了作用。在最小程度上，白細(xì)胞也有助于TF在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)。肺損傷時(shí)，內(nèi)皮血小板決定血管內(nèi)皮的促炎-抗凝表型的形成。肺損傷中血小板的作用大多數(shù)認(rèn)為對白細(xì)胞起激活作用[9-13]。

本研究結(jié)果顯示，線粒體從血小板轉(zhuǎn)移到白細(xì)胞。循環(huán)中的血小板含有少數(shù)具有完整功能的線粒體。越來越多的證據(jù)顯示，這些線粒體不僅通過產(chǎn)生能量而且通過氧化還原反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的啟動，調(diào)節(jié)血小板形成血栓的功能[2，4，10]。除了止血的調(diào)節(jié)，傳統(tǒng)認(rèn)為血小板的作用可作為識別和研究人類線粒體功能障礙性疾病，因?yàn)榕c其他代謝活躍的組織相比血小板容易獲取。生理狀態(tài)下，血小板通過循環(huán)接近內(nèi)皮，但是血液流動以及抗凝物質(zhì)可防止血小板黏附形成血栓。然而當(dāng)血管損傷時(shí)，血小板開始通過快速以及復(fù)雜的信號通路，加快三級放大的凝血反應(yīng)[4, 7-9]。第一步，血小板通過特殊的表面受體相互作用與暴露的內(nèi)皮下因子(例如von Willebrand 因子、膠原蛋白、血小板反應(yīng)蛋白和層連蛋白)一起黏附至受損的內(nèi)皮；第二步，血小板的聚合，主要通過血小板表面的G蛋白耦聯(lián)受體捆綁的ADP和凝血酶調(diào)節(jié)，從而啟動了細(xì)胞的一系列信號放大反應(yīng)。這些信號級聯(lián)反應(yīng)，包括磷脂酶C的抑制，磷脂酰肌醇三激酶的活化，主要引起血小板的變形以及其他血小板的活化和黏附。最后第三步，血小板釋放包括來自血小板顆粒的ADP在內(nèi)的可溶性因子和表達(dá)性炎癥介質(zhì)。此外表面糖蛋白Iib/IIIa的表達(dá)增加了血小板的間接聚合，最后形成血栓[1，3]。

線粒體從血小板轉(zhuǎn)移到白細(xì)胞為一種新的ALI/ARDS的調(diào)節(jié)途徑，血小板的激活和聚集在急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病中起著重要的作用，血小板與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用促進(jìn)肺損傷，研究結(jié)果表明，線粒體與血小板活化和凋亡的調(diào)節(jié)相關(guān)[15-16]。越來越多的證據(jù)表明血小板活化增強(qiáng)、線粒體超極化和ROS產(chǎn)生，均參與肺損傷。許多研究表明，血小板數(shù)量減少及血小板功能受損，同樣會引起不同程度的肺損傷[17-19]。已有研究表明，線粒體從骨髓基質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至肺泡上皮細(xì)胞，可增加肺泡的ATP，從而起到保護(hù)肺的作用[11]。

綜上所述，血小板不僅在血栓形成中起作用，同樣在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，血小板活化、內(nèi)皮損傷和纖維蛋白原之間相互作用參與了ARDS過程，而且可能是主要的致病因素之一。血小板與ARDS發(fā)病的關(guān)系十分復(fù)雜。在ARDS時(shí)，血小板本身既是受損靶細(xì)胞，又可通過自身結(jié)構(gòu)和功能的改變加速ARDS的進(jìn)程。有針對性的進(jìn)行抗血小板治療，有望改變ALI/ARDS的自然病程。

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(本文編輯：黃紅稷)

唐昊，祁海峰，王耀麗，等. 血小板線粒體調(diào)節(jié)肺毛細(xì)血管屏障功能的實(shí)驗(yàn)研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(3)： 258-262.

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.03.005

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金青年資助項(xiàng)目(81200057)

通訊作者：王耀麗，Email: wangylchen2005@aliyun.com

中圖法分類號：R563.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Corresponding author：Wang Yaoli, Email: wangylchen2005@aliyun.com

(收稿日期：2016-01-21)

Platelet mitochondria modulate lung microvascular barrier function in acid-induced lung injury

TangHao,QiHaifeng,WangYaoli,YangXuefei,LiPengfei,LeiYang,ZhangPeng,ZhouJian.Desect1mentofCriticalCareMedicine,DapingHospital,ResearchInstituteofSurgery,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing, 400042,China

【Abstract】ObjectiveTo determine the role of platelet mitochondria in lung microvascular barrier regulation in the mouse model of acid-induced acute lung injury(ALI). MethodsTo induce ALI, HCl (pH 1.2, 1.5 ml/kg) was used in the isolated mouse lungs by airway instillation. After 1 h, it was determined the microvascular filtration coefficient (Kf) to quantify lung microvascular barrier properties. pulmonary vascular cells were isolated for flow cytometry and confocal microscopy to detect the role of platelet mitochondria in lung microvascular barrier regulation in the mouse model of acid-induced ALI. ResultsAcid instillation increased Kf 2.5-fold above baseline (n=4, P<0.05), indicating that acid instillation caused major microvascular injury. In isolated mouse lung perfused with rotenone-treated platelets, acid instillation increased Kf 5-fold above baseline (n=4, P<0.05). The presence of platelet mitochondria in the leukocyte was evident optically, as well as by the flow cytometry and confocal microscopy. ConclusionsInhibiting platelet mitochondrial function increases lung injury in the acid-aspiration model of ALI. Lung endothelial barrier protection depends on functioning platelet mitochondria. The mitochondrial transfer from platelet to leukocyte resulted in increased leukocyte adhesion to injuried microvessel.

【Key words】Acute lung injury;Platelet;Lung microvascular barrier function;Mitochondria