劉　宇， 郭　輝， 高曉夢， 張艷芳， 徐甲坤， 董　平??， 梁興國

(1. 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266003；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071)

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活性中心突變型胃蛋白酶原的酵母表達(dá)及高效激活研究?

劉宇1， 郭輝1， 高曉夢1， 張艷芳1， 徐甲坤2， 董平1??， 梁興國1

(1. 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266003；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071)

摘要：針對活性中心突變型胃蛋白酶原難以被激活且穩(wěn)定性差的問題，本文研究了活性中心突變對胃蛋白酶原激活及其穩(wěn)定性的影響。根據(jù)豬胃蛋白酶原A的基因序列設(shè)計(jì)引物，通過RT-PCR和重疊延伸PCR法分別獲得野生型(rPG)和突變型(D32A和D215A)胃蛋白酶原基因片段，其中突變型胃蛋白酶原分別為活性中心關(guān)鍵氨基酸天冬氨酸(D)突變?yōu)楸彼?A)。將野生型和突變型胃蛋白酶原分別在酵母中成功表達(dá)，研究其激活、激活后的穩(wěn)定性和活性情況。研究表明，可以成功地在酵母中表達(dá)并純化野生型和突變型重組豬胃蛋白酶原rPG、D32A和D215A。在pH=2.0條件下，rPG在5 min內(nèi)即可全部激活，且在37℃具有良好的穩(wěn)定性，而D32A和D215A需24 h以上才可激活。通過在激活反應(yīng)中加入野生型胃蛋白酶，D32A和D215A的激活時(shí)間可縮短至1 h，雖然激活過程有部分酶原發(fā)生降解，但激活后獲得的突變型胃蛋白酶可穩(wěn)定3 d，激活后的突變型胃蛋白酶無蛋白水解活性。研究結(jié)果表明，活性中心關(guān)鍵氨基酸突變后的胃蛋白酶原仍可激活，雖然在激活過程中胃蛋白酶原的穩(wěn)定性差，但激活后產(chǎn)生的胃蛋白酶穩(wěn)定性良好，這為進(jìn)一步研究突變型胃蛋白酶提供了可能和保證。

關(guān)鍵詞：豬胃蛋白酶原； 畢赤酵母表達(dá)； 突變； 酶原激活

引用格式：劉宇， 郭輝， 高曉夢， 等. 活性中心突變型胃蛋白酶原的酵母表達(dá)及高效激活研究 [J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2016, 46(7)： 54-61.

LIU Yu, GUO Hui, GAO Xiao-Meng, et al. Expression and activation of recombinant porcine pepsinogen with mutated active site [J].Periodical of Ocean University of China, 2016,46(7)： 54-61.

胃蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶家族的消化性蛋白酶[1]，科學(xué)家對胃蛋白酶的關(guān)注超過了80年[2-3]，這不僅是因?yàn)槲傅鞍酌甘侵匾牡鞍酌?，更重要的是胃蛋白酶與生物體的消化代謝密切相關(guān)。目前，關(guān)于胃蛋白酶的研究主要集中在兩方面：一方面為胃蛋白酶作為工具酶來制備多肽或膠原蛋白；另一方面為對胃蛋白酶系的完善，即不同物種中胃蛋白酶的提取純化，探索其水解蛋白質(zhì)的生化特性[4-6]，以期找到豐富胃蛋白酶的工具酶性質(zhì)。為了更好的利用胃蛋白酶，長久以來科學(xué)家們一直在努力闡明其作用機(jī)理[7-8]。

目前胃蛋白酶降解蛋白的活性中心關(guān)鍵氨基酸已經(jīng)確定，為D32和D215，這一機(jī)理是通過X射線衍射分析酶和蛋白的結(jié)晶推測所得[9-10]。在酶活性機(jī)理的研究中，X射線衍射法無疑是最可靠和可信的方法之一，然而X射線衍射法在實(shí)際操作中困難重重，獲得相應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往需要豐富的經(jīng)驗(yàn)和漫長的探索時(shí)間。因此，近年來廣受關(guān)注的蛋白質(zhì)工程，成為研究酶必需基團(tuán)和活性中心的又一重要方法[11-13]。這一技術(shù)主要是利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)將酶中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸突變?yōu)槠渌被幔贉y定其活性來推測被置換的氨基酸是否為酶活性所必需。

使用蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究胃蛋白酶作用機(jī)理的過程中，需要首先獲得酶原，這一方面是因?yàn)槲傅鞍酌冈谏矬w內(nèi)其以酶原形式分泌，另一方面處于激活狀態(tài)的酶穩(wěn)定性大大弱于酶原，在表達(dá)純化等過程中易于受到其他因素的影響，發(fā)生失活。因此，通常首先獲取酶原，然后再對其進(jìn)行激活處理[14-16]。胃蛋白酶原的激活是個(gè)自激活的過程，當(dāng)pH<5.0時(shí)，酶原自動(dòng)激活，轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩锘钚缘奈傅鞍酌竅17-18]。然而研究表明[19]，胃蛋白酶原的激活需要D32和D215的共同參與，當(dāng)D32變?yōu)锳時(shí)，酶原不僅不能被激活，而且D32A酶原在酸性條件下不穩(wěn)定，易變性降解。在這種情況下，關(guān)鍵氨基酸突變型酶原的激活成為解明胃蛋白酶作用機(jī)理的亟待解決的關(guān)鍵問題。

隨著胃蛋白酶研究的持續(xù)深入，包括其可以水解糖類和核酸類物質(zhì)[20-21]等新活性被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)報(bào)道，對胃蛋白酶的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理的研究也提出了越來越高的要求。因此，本文旨在系統(tǒng)研究豬胃蛋白酶原突變體D32A和D215A的激活可能性，借助酶促反應(yīng)引發(fā)其高效激活，并對其激活后的酶的穩(wěn)定性做系統(tǒng)評價(jià)，為早期的X射線衍射結(jié)果提供實(shí)驗(yàn)支持，同時(shí)也為解明胃蛋白酶的作用機(jī)理提供幫助。

1　材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

新鮮豬胃刮取胃底腺區(qū)。載體pPICZαA購自Invitrogen (San Diego, CA)。畢赤酵母(Pichiapastoris) X-33購自CICC (中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)。E.coliTOP10、Trizol、TIANscript RT Kit、TIANpure Mini Plasmid Kit、質(zhì)粒提取和連接試劑盒購自天根生化科技有限公司(北京)。膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶購自NEB有限公司 (USA)。熒光定量PCR試劑購自大連寶生物。DEAE Sepharose Fast Flow和Sephacryl S-200 HR購自GE Healthcare life sciences (USA)。引物購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 野生型豬胃蛋白酶原A及其突變體真核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)GeneBank中豬胃蛋白酶原A(PGA)的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增其ORF(Open reading frame)的引物EX-F和EX-R(見表1)，Trizol法提取豬胃組織總RNA，并利用天根TIANscript RT Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成第一鏈cDNA，以之為模板擴(kuò)增PGA的ORF，具體反應(yīng)體系及程序如下：20 μL反應(yīng)體系包含5×buffer 4 μL，2mmol/L dNTP 2 μL，cDNA模板1 ng，上下游引物各1 μL，phusion DNA聚合酶為NEB公司產(chǎn)品。反應(yīng)程序?yàn)?8℃ 30 s；98℃ 10 s，63℃ 30 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。

根據(jù)PGA基因序列，采用重疊延伸PCR法(見圖1)[22]分別將其活性中心關(guān)鍵氨基酸D32和D215進(jìn)行定點(diǎn)突變，將D的密碼子GAT/C，突變?yōu)镚CT/C，即丙氨酸A。具體引物序列見表1。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)OMEGA膠回收試劑盒回收純化?？寺〉絧PICZαA載體上，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10。挑取陽性克隆送至華大基因測序。

圖1　重疊延伸法定點(diǎn)突變原理示意圖

引物名稱Primername序列(5'-3')Sequence(5'-3')EX-FAGCTGAATTCAAGT-GGCTACTGCTGCTC(EcoRI)EX-RTATGCGGCCGCGGCCACGGGAGCCA(NotⅠ)32F1TGGAGATTGGGAGCCAGGAAAGAAC32R1GGTTGGAGGAGCCGGTGGC-AAAGATGACGGTGAAG32F2CTTCACCGTCATCTTTG-CCACCGGCTCCTCCAACC32R2GCGGGGATAGAACCAAGGCGGGAT215F1TGGAGATTGGGAGCCAGGAAAGAAC215R1GCAGAGAGGTGCCCG-TAGCCACAATGGCCTGGCAG215F2CTGCCAGGCCATTGTGGC-TACGGGCACCTCTCTGC215R2CACGATCCCAGAGGAAAAGCGATCAGART-FGTGGGTGCCCTCTGTCTACTGRT-RGAGGAGTCATCAGGGTTGAACTG

注：32F1，32R1，32F2和32R2為構(gòu)建D32A突變體的引物；215F1，215R1，215F2和215R2為構(gòu)建D215A突變體的引物；RT-F和RT-R為熒光定量引物。32F1，32R1，32F2和32R2 are primers for building mutant D32A. 215F1，215R1，215F2和215R2 are were primers for building mutant D215A. RT-F and RT-R are primers for RT-PCR.

1.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、鑒定與篩選

提取上述3種重組質(zhì)粒并應(yīng)用PmeI使質(zhì)粒線性化，電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞[27]，30℃條件下分別經(jīng)YPDS平板培養(yǎng)、YPD平板篩選單菌落和YPD液體增菌步驟后，提取重組酵母基因組，利用通用引物進(jìn)行PCR鑒定，篩選陽性Mut+型轉(zhuǎn)化子。

為得到大量目的蛋白，擬采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR來鑒定高表達(dá)的轉(zhuǎn)化子。以含有目的基因的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用TaKaRa的SYBR ? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒，10 μL反應(yīng)體系里包括5 μL 2×SYBR Premix Ex Taq，10 μmol/L上下游引物各0.4μL，3μL模板，1.6μL ddH2O。熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 2 min；94℃ 15 s；56℃ 15 s；72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。60℃逐步升溫到94℃進(jìn)行溶解曲線分析。

分別隨機(jī)選取7個(gè)上述鑒定為陽性的重組菌接種到10 mL YPD液體培養(yǎng)基中，參照李圣翔等[27]的方法進(jìn)行0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，于誘導(dǎo)表達(dá)4 d時(shí)提取菌液總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA用于熒光定量分析。反應(yīng)體系及程序同上，每個(gè)樣品3個(gè)平行反應(yīng)。

1.4 重組蛋白的表達(dá)純化

將篩選出的高表達(dá)轉(zhuǎn)化子按照1.3中的方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，各表達(dá)1 L。表達(dá)4 d后，收集上清，60%飽和硫酸銨鹽析，沉淀透析至25 mmol/L磷酸鉀緩沖液(KPI，pH= 7.0，A液)，上樣于用A液平衡的 DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱(2.5 cm×15 cm)，A液(pH=7.0，含0.5mol/L NaCl)線性梯度洗脫，流速5 mL/min，分別收集洗脫峰，SDS-PAGE[23]電泳檢測目的組分。含有目的組分的收集峰透析至A液并上樣于A液平衡的Hiprep 16/60 sephacryl S-200 H凝膠柱，A液(pH=7.0，含0.15mol/L NaCl)洗脫，流速0.5 mL/min，收集洗脫峰，SDS-PAGE檢測。

1.5 SDS-PAGE

參照Laemmli[23]的方法，采用不連續(xù)垂直平板電泳法對重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。其中分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，考馬斯亮藍(lán)染色顯示蛋白條帶。

1.6 胃蛋白酶原的激活及其穩(wěn)定性

所有操作皆在冰上進(jìn)行。對于野生型胃蛋白酶原，在90 μL 0.5 mg/mL胃蛋白酶原溶液中加入10 μL 0.1 mol/L HCl，使溶液pH=2.0，25 ℃激活一定時(shí)間后，用1 mol/L NaAc(pH=9.6)終止反應(yīng)，使溶液的pH=5.3。

對突變型胃蛋白酶原的激活采用如下2種方法：(1)參照上述野生型酶原的激活方法；(2)酶促激活方法：在90 μL胃蛋白酶原溶液中加入10 μL 1 mol/L HCl，使溶液的pH=2.0，同時(shí)加入一定量的重組豬胃蛋白酶(rP)，25℃激活一定時(shí)間后，按上述方法終止反應(yīng)。

激活后胃蛋白酶的穩(wěn)定性采用如下方法進(jìn)行分析：將按上述方法激活后的酶液的pH分別調(diào)至2.0、3.0、4.0和5.0，放置在37 ℃水浴鍋中，分別于12、24、36和48 h取樣，加入20 μL 0.1 mol/L NaOH和10 μL 4×蛋白電泳上樣緩沖液終止反應(yīng)，SDS-PAGE電泳檢測。

1.7 胃蛋白酶活力測定

由于時(shí)間的限制，本文任然存在著不足之處：作者分析了40則語料，但是作為例子，呈現(xiàn)在論文中的只有6則；對于語料的分析基于作者自身的能力，可能存在分析不足的情況；對于廣告語類型的劃分，是根據(jù)作者自身的認(rèn)知水平。

激活后胃蛋白酶活力的測定采用Anson法[24]，酶活單位定義為在pH=2.0、37 ℃條件下，以血紅蛋白為底物，每分鐘使上清產(chǎn)生0.001吸光值所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

2　結(jié)果與分析

2.1 豬胃蛋白酶原A野生型及其突變體的畢赤酵母表達(dá)純化

本研究以豬胃組織總RNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA為模板，通過RT-PCR及重疊延伸PCR法，分別獲得了野生型豬胃蛋白酶原A(PGA)和突變體D32A和D215A基因片段，并分別克隆至pPICZαA載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞后，通過基因組PCR法，鑒定陽性轉(zhuǎn)化子(結(jié)果未列出)。本研究選擇的X-33為Mut+型分泌型表達(dá)菌[25]，蛋白表達(dá)時(shí)需要定期加入甲醇做為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)分泌型表達(dá)便于后續(xù)蛋白純化。

為得到大量的目的蛋白，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測誘導(dǎo)表達(dá)4 d后轉(zhuǎn)化子在RNA水平的表達(dá)情況，從陽性菌中篩選出高表達(dá)的轉(zhuǎn)化子用于后續(xù)表達(dá)。根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果，最終選擇X-33-pPICZα A-P-3、X-33-pPICZα A-D32A-6和X-33-pPICZα A-D215A-2重組菌進(jìn)行后續(xù)表達(dá)實(shí)驗(yàn)(見圖2)。

將甲醇誘導(dǎo)表達(dá)4 d后的上清液經(jīng)硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱和Hiprep 16/60 sephacryl S-200 H凝膠柱純化后，得到重組蛋白rPG、mPG1(D32A)和mPG2(D215A)。每一步的純化結(jié)果見表2和圖3。經(jīng)純化后，在SDS-PAGE電泳圖中可以看出，得到了較為單一的條帶，分子量與預(yù)期分子量一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野生型豬胃蛋白酶原和突變型豬胃蛋白酶原在畢赤酵母X-33中成功地得到了表達(dá)。

2.2 重組豬胃蛋白酶原的激活

由圖4可知，重組野生型rPG在pH=2.0條件下可迅速激活，5 min內(nèi)即可全部激活，且可在37℃穩(wěn)定存在4 d而不降解，且酶活無明顯變化，與現(xiàn)有研究相符[26]。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本研究中所采用的表達(dá)純化方案可行，重組野生型豬胃蛋白酶原與天然豬胃蛋白酶原具有相同的激活穩(wěn)定性，因此后續(xù)采用相同的方法表達(dá)純化得到的突變體可用于激活穩(wěn)定性研究。

(A.野生型；B.D32A突變型；C.D215A突變型。A. Wild-type; B. Mutant D32A; C. Mutant D215A.)

總蛋白/mgTotalprotein重組蛋白RecombinantproteinrPGD32AD215A粗酶液Crudeextract1065011600895060%硫酸銨60%(NH4)2SO437809361016離子交換層析Anionexchangechromatography803656凝膠過濾SephadexG-200gelfiltration1.80.61.4

采用1.6(1)的方法，即與野生型胃蛋白酶相同的激活方法，發(fā)現(xiàn)突變體D32A和D215A在pH=2.0條件下可以激活，但速度極慢，需24 h，且穩(wěn)定性極差，激活后的酶的量不足酶原的1%(見圖5A)。由于突變酶原在酸性條件下不穩(wěn)定，為了提高激活效率，采用1.6(2)中闡述的改良的酶促激活方法，結(jié)果表明當(dāng)在突變體D32A和D215A的激活反應(yīng)體系中加入微量的野生型胃蛋白酶(rP)后(0.4 U rP，質(zhì)量為突變體的0.3%)，突變體D215A的激活速度顯著加快，電泳分析表明在25oC條件下1 h內(nèi)突變酶原的條帶消失，被激活后酶的條帶出現(xiàn)，即突變酶原完全被激活為酶(見圖5B)。在突變型胃蛋白酶原的激活體系中加入不同含量的rP后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)rP的含量增加至1 U時(shí)，突變型胃蛋白酶原的穩(wěn)定性下降，幾乎看不到激活后的酶的條帶；而將rP的含量減少至0.01 U時(shí)，酶促激活反應(yīng)仍可在1 h內(nèi)完成，且突變型胃蛋白酶的穩(wěn)定性更好(見圖6)。

(M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein marker；C：粗酶液Crude extract；Y：60%硫酸銨沉淀60% Ammonium sulfate precipitation；D：DEAE層析DEAE-FF；S：丙烯酰胺葡聚糖凝膠層析Sephacryl S-200 H.)

圖3SDS-PAGE(12%)電泳檢測純化結(jié)果

Fig.3Analysis of purification results by 12% of SDS-PAGE

(1為未激活的rPG；2為激活5 min；3為激活30 min；4～7分別為激活后37℃放置1、2、3和4 d。1.rPG; 2. rPG activated for 5 min; 3. rPG activated for 30 min; 4-7.activated rP stay at 37℃ for 1 d, 2 d, 3 d and 4 d, respectively.)

圖4重組rPG的激活

Fig.4Activation of rPG

(A為突變體D32A在pH=2.0的條件下自然激活和酶促激活；B為突變體D215A在pH=2.0的條件下自然激活和酶促激活。其中1為未激活的酶原，2為自然激活，3為酶促激活。A. D32A activated at pH=2.0 under different conditions. B. D215A activated at pH=2.0 under different conditions. 1.Unactivated pepsinogen; 2. Natural activation; 3. Enzymatic activation.)

圖5突變體D32A和D215A的激活

Fig.5Activation of mutant pepsinogen D32A and D215A

(1為未激活的D215A;2～4分別為D215A在1 U、0.1 U和0.01 U胃蛋白酶作用下的酶促激活結(jié)果；5為未激活的D32A;6～8分別為D32A在0.01 U、0.1 U和1 U胃蛋白酶作用下的酶促激活結(jié)果。1. Unactivated D215A; 2-4. D215A were enzymatic activated at 1 U、0.1 U和0.01 U rP conditions, respectively; 5. Unactivated D32A; 6-8. D32A were enzymatic activated at 1 U、0.1 U和0.01 U rP conditions, respectively.)

圖6不同含量rP對突變體D32A和D215A的激活的影響

Fig.6The effect of rP concentration on activation of mutant pepsinogen D32A and D215A

2.3 突變型胃蛋白酶D32A和D215A的穩(wěn)定性及其活性

分別將2.2中激活處理獲得的突變型胃蛋白酶D32A和D215A放置于37℃水浴鍋中，每隔24 h取樣1次，SDS-PAGE分析其穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖7)表明，突變型胃蛋白酶原D32A和D215A在激活過程中穩(wěn)定性較差，與Lin[19]的研究相符，但激活后突變型胃蛋白酶D32A和D215A在3 d內(nèi)可以保持相對穩(wěn)定。

對激活后的突變型胃蛋白酶進(jìn)行蛋白水解活性測定，發(fā)現(xiàn)突變型胃蛋白酶D32A和D215A皆無蛋白水解活性，將酶活測定反應(yīng)時(shí)間延長至60 min，突變體仍無活性。因此激活獲得的突變型胃蛋白酶D32A和D215A表現(xiàn)出不降解蛋白的性質(zhì)，這符合早期的X射線衍射結(jié)果的推測結(jié)果[9-10]。同時(shí)，表明激活過程中加入的野生型胃蛋白酶的含量極低，不影響突變胃蛋白酶的利用和性質(zhì)研究，即采用外加胃蛋白酶來激活突變型胃蛋白酶原是研究突變型胃蛋白酶的可行性方法。

(A為D32A激活后穩(wěn)定性；B為D215A激活后穩(wěn)定性。其中1為酶原，2為激活8 h，3～5分別為激活后37℃放置1 d、2 d和3 d。A. The stability of D32A. B. The stability of D215A. 1. Unactivated pepsinogen; 2. Activated for 8 h; 3-5. activated mP stay at 37℃ for 1 d, 2 d and 3 d, respectively.)

圖7突變體激活后穩(wěn)定性

Fig.7Stability of mutant pepsin

3　討論

本文通過定點(diǎn)突變技術(shù)將豬胃蛋白酶的活性中心關(guān)鍵氨基酸D32和D215突變?yōu)楸彼?，并?shí)現(xiàn)了突變型胃蛋白酶原D32A和D215A在畢赤酵母中表達(dá)。相比于大腸桿菌系統(tǒng)[14,19]胃蛋白酶的生物活性較低的缺點(diǎn)，酵母表達(dá)系統(tǒng)能夠獲得活性較好、結(jié)構(gòu)完整的胃蛋白酶[16,25,27]，雖然早在1989年即有對突變體D32A的研究[19]，但當(dāng)時(shí)利用的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，受限于原核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)后修飾體系的不完善，雖然表達(dá)后的D32A既不能激活，也沒有蛋白水解活性，但不能完全排除表達(dá)體系對突變型胃蛋白酶原D32A性質(zhì)和功能的影響。本研究實(shí)現(xiàn)了突變型胃蛋白酶原D32A和D215A在畢赤酵母中表達(dá)，并以野生型胃蛋白酶原的表達(dá)作為參照，既驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)方法的可行性，同時(shí)也首次在酵母中表達(dá)純化得到突變型豬胃蛋白酶原D32A和D215A，為進(jìn)一步研究D32和D215在胃蛋白酶催化中的作用提供了支持。

研究指出[19]胃蛋白酶原的激活需要D32和D215的共同參與，當(dāng)D32突變后，酶原不能激活，甚至在酸性條件下酶原本身也不穩(wěn)定。雖然，在本研究中發(fā)現(xiàn)，突變型胃蛋白酶原D32A和D215A在pH=2.0條件下可以激活為胃蛋白酶，得到了與之前報(bào)道略有不同的結(jié)果，但完全激活時(shí)間大于24 h，速度極慢。這種極低的效率和突變酶原在酸性條件下不穩(wěn)定的性質(zhì)，可能是前人認(rèn)為其不能被激活的原因。

由于胃蛋白酶原的激活是自激活的過程[28-29]，H+激活產(chǎn)生的胃蛋白酶可以進(jìn)一步激活其他的胃蛋白酶原[30]，因此本研究采用了酶促激活方式，當(dāng)在突變型胃蛋白酶原D32A和D215A的激活過程中加入激活后的野生型胃蛋白酶時(shí)，突變型胃蛋白酶原的激活速率顯著加快，1h即可全部激活。突變型胃蛋白酶原D32A和D215A在激活過程中的同樣表現(xiàn)出了不穩(wěn)定的特征，部分酶原在激活過程中有降解現(xiàn)象發(fā)生，這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)[19]中報(bào)道的一致，但激活后的突變型胃蛋白酶穩(wěn)定性良好，在37℃可以穩(wěn)定存在3d，即本實(shí)驗(yàn)首次實(shí)現(xiàn)了突變型豬胃蛋白酶原D32A和D215A的激活，這一結(jié)果使其具備了進(jìn)一步用于酶學(xué)性質(zhì)和作用機(jī)理研究的可能。

胃蛋白酶是體內(nèi)重要的消化酶，對機(jī)體的健康有重要影響；同時(shí)胃蛋白酶也是重要的工具酶，在膠原蛋白及短肽的生產(chǎn)中有重要作用[31-33]。本研究一方面實(shí)現(xiàn)了胃蛋白酶活性中心關(guān)鍵氨基酸突變后的酶原高效激活，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了激活后的突變型酶具有良好的穩(wěn)定性。這一結(jié)果必將為胃蛋白酶的活性和結(jié)構(gòu)研究提供重要支持，為闡明胃蛋白酶可降解多糖等新發(fā)現(xiàn)的機(jī)理研究打開新的方法之門。本研究中采用人工手段獲得的突變型胃蛋白酶也將豐富胃蛋白酶家族酶系，為胃蛋白酶新活性的發(fā)現(xiàn)和胃蛋白酶的系統(tǒng)性研究提供幫助。

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責(zé)任編輯朱寶象

基金項(xiàng)目：? 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201327)；國家教育部留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目；山東省自然科學(xué)基金杰出青年基金項(xiàng)目(JQ201204)；國家青年千人計(jì)劃資助項(xiàng)目資助

收稿日期：2015-04-03；

修訂日期：2015-12-03

作者簡介：劉宇(1987-)，女，博士生。E-mail:shishui87@163.com ??通訊作者： E-mail: dongping@ouc.edu.cn

中圖法分類號：Q556+.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-5174(2016)07-054-08

DOI:10.16441/j.cnki.hdxb.20150126

Expression and Activation of Recombinant Porcine Pepsinogen with Mutated Active Site

LIU Yu1, GUO Hui1, GAO Xiao-Meng1, ZHANG Yan-Fang1, XU Jia-Kun2,DONG Ping1, LIANG Xing-Guo1

(1.College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Science, Qingdao 266071,China)

Abstract:The activation and stability of pepsinogen play an important role in studying pepsin activity. In this study, the activation and stability of mutated porcine pepsinogens of which the key amino acid at active site was mutated were investigated. According to the sequence in GenBank, the primers were designed to amplify the pepsinogen gene. RT-PCR and overlap extension PCR were used to obtain the cDNA that corresponds to the zymogenic form of porcine pepsin (EC 3.4.23.1), both the wild (rPG) and mutated types (D32A and D215A). The gene was cloned into the vector pPICZα A and transformed into Pichia pastoris X-33. The recombinant enzyme was purified through DEAE-cellulose anion exchange chromatography and Sephadex G-200 gelfiltration. The heterogeneous expression and activation property of wild and mutated pepsinogen were studied in details. The results showed that the recombinant pepsinogens (rPG, D32A and D215A) were successfully expressed and highly purified from P. pastoris. At pH 2.0, rPG could be activated in 5 min and stabilized in 37 ℃. And compared to commercial pepsin, the recombinant wild type pepsin had a similar activity. However, the activation of mutated pepsionogen D32A and D215A would need more than 24 h. In order to activate D32A and D215A, a roundabout enzyme-activated method was used. The D32A and D215A solution were adjusted to pH 2.0 with diluted HCl and added one unit of the wild-type pepsin. The mixture was incubated at 25 ℃ for 12 h. The results showed that D32A and D215A were activated in this way. Furthermore, the mutated pepsinogen could be activated in 1 h with this enzyme-activated method. Although the mutated pepsinogen would degrade during activation, the activated mutated pepsin has a relatively good stability. It had been reported that the active site amino acid D32 and D215 were necessary for the activation of pepsinogen and in acid solution D32A did not activate to pepsin but slowly denatured. However, in this study we first investigated the activate possibility of mutated pepsinogen of which active site key amino acid was mutated. And the result showed that mutated pepsinogen D32A and D215A could be activated with a roundabout enzyme-activated method. The activated mutated pepsin D32A and D215A could be stabled for at least 3 days. The results of our work will provide a possibility to study the property of mutated pepsin.

Key words:porcine pepsinogen; Pichia pastoris expression; mutation; activation

Supported by National Natural Science Foundation of China(31201327)；Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, State Education Ministry；Shandong Province Funds for Distinguished Young Scientists(JQ201204)； National Youth Qianren Plan