李　賢，曾偉偉，王　慶，王英英，李瑩瑩，石存斌，吳淑勤

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水生動(dòng)物免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

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草魚呼腸病毒研究進(jìn)展

李賢1,2，曾偉偉1*，王慶1，王英英1，李瑩瑩1，石存斌1，吳淑勤1*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水生動(dòng)物免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

摘要：由草魚呼腸病毒引起的草魚出血病是一種高度傳染性與致死性的病毒性疾病，該病的頻繁暴發(fā)給我國草魚養(yǎng)殖業(yè)及淡水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。論文就近年來對草魚呼腸病毒在基因組序列及基因分型、流行病學(xué)、先天性免疫、檢測方法、免疫防控等方面的研究進(jìn)行綜述，以期為草魚呼腸病毒的研究提供借鑒和參考，為草魚出血病預(yù)防和控制提供幫助。

關(guān)鍵詞：草魚呼腸病毒；基因組；流行病學(xué)；先天性免疫；檢測方法

草魚呼腸病毒(Grass carp reovirus，GCRV)主要引起中國、越南、緬甸等亞洲國家淡水養(yǎng)殖中的草魚在魚種階段發(fā)生草魚出血病，病死率一般為 30%～50%，最高可達(dá)90%，而且還能感染青魚、麥穗魚、布氏鰲條魚等，使感染魚發(fā)生出血病癥狀而死亡。該病毒流行廣，死亡率高、發(fā)病季節(jié)長，嚴(yán)重影響了我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。近年來經(jīng)?？梢娨虿蒴~出血病暴發(fā)而導(dǎo)致大批草魚死亡，給養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年由于草魚出血病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)10 多億元，該病的基礎(chǔ)研究及其防控受到越來越多人的重視。

1　GCRV基因組序列

草魚呼腸病毒的基因組由11條雙鏈分段的RNA組成，共編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白和5種非結(jié)構(gòu)蛋白?；蚪M各節(jié)段具有5′末端帽子結(jié)構(gòu)，3′末端不具有Poly (A)尾序列。2002年，Attoui等完成了GCRV-873株的全基因組測序，是第一株完成全基因組序列分析的草魚呼腸病毒，同年還完成了GSRV的全基因組測序。2008年，Mohd等完成了AGCRV的全基因組序列測定。2010年，張超等完成了GCRV-HZ08毒株的全基因組測序。2012年，Ye等完成了GCRV-GD108株的全基因組測序。2013年，Pei Chao等[1]完成了GCRV-109的全基因組測序；Fan Yuding等[2]完成了GCRV-106、GCRV-918、GCRV-HeNan988、GCRV-HuNan794、GCRV 104[2]的全基因組測序。2013年-2015年，Wang Tu等[3]完成了GCRV JX02株的全基因組序列測定。至今完成全基因組序列測定的毒株已有12株(表1)，有一些毒株則根據(jù)研究者自身研究需要完成了部分節(jié)段的測序(表2)。2000年，Qiu等完成了GCRV的S1、S2、S3、S8、S10節(jié)段的基因組測序；2001年，Qiu完成了GCHV的S2、S3、S5、S6、S7、S9、S11節(jié)段的基因組測序；2013年，Jian等完成了GCRV-096的S6、S10節(jié)段的基因組測序； Ying等完成了GCRV-ZS11、GCRV-YX11、GCRV-QY12、GCRV-QC11、GCRV-NC11、GCRV-JS12、GCRV-HS11、GCRV-HN12的S9節(jié)段的基因組測序；Wang等完成了JX02的S10節(jié)段的基因組測序。

2　GCRV基因分型和流行病學(xué)調(diào)查

關(guān)于草魚呼腸病毒的基因分型研究，不少學(xué)者都進(jìn)行過嘗試，但沒能得出一個(gè)確定的結(jié)果，也沒有一個(gè)確定的方法或標(biāo)準(zhǔn)，多數(shù)是根據(jù)核苷酸序列或推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹來進(jìn)行分析，各人所選用的節(jié)段或蛋白也并不相同。Pei Chao等[1]研究了GCReV-109株的蛋白序列，發(fā)現(xiàn)GCReV-109和GCRV-GD108有96.6%～99.5%的相似率，但與GCRV-873和HGDRV的相似率分別只有16.7%～46.1%和15.1%～45.4%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示中國的草魚呼腸病毒株可以分為3個(gè)基因型，蛋白GCReV-109 VP56和HGDRV VP55有同族關(guān)系，GCReV-109 NS38、GCRV-873NS38、HGDRVVP39有同族關(guān)系。這些結(jié)果表明病毒間的同族關(guān)系和地理分布沒有必然聯(lián)系。曾偉偉等報(bào)道根據(jù)現(xiàn)有的分離株序列信息，進(jìn)行核苷酸序列與氨基酸序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，把這3類毒株按照基因序列差異分為I型(代表株為GCRV-873與GCRV-873-JX09-01)、Ⅱ型(代表株為GCRV-HZ08與GCRV-GD10)和Ⅲ型(GCRV-104，GCRV-HB1007)。不同類型的毒株其核苷酸和氨基酸序列的同源性都小于30%，而同一類型的毒株其核苷酸和氨基酸序列的同源性都大于95%。Wang等的分析表明HZ08株的第2完整片段和GCRV GD108 (AQRV)，GCRV 873 (AQRV-C)，金體美鳊呼腸病毒 (GSRV,AQRV-C)，美國草魚呼腸病毒(AGCRV，AQRV-G)，大馬哈魚呼腸病毒 (CSRV，AQRV-A)，和GCRV 104 (未分類)相應(yīng)片段的相似率分別是96.4%、51.7%、51.3%、50.9%、50.6%和49.7% ?；赩P6的核酸序列可把病毒分為3組，即GCRV 873 (基因Ⅰ型)，HZ08(基因Ⅱ型)和104 (基因Ⅲ型)，3個(gè)基因型間的相似性小于20%?；颌裥桶?個(gè)分離株873、096、875、876、991，相似性從72.5%～99.7%，基因Ⅱ型包括3個(gè)分離株HZ08，GD108和HA-2011，相似性從72.6%～98.7%，基因Ⅲ型只有一個(gè)分離株GCRV104，與GCRV873和HZ08比較相似性分別是19.2%和16.5%。Yan Xiuying等[4]研究用VP4、VP6、VP7的序列去分析25個(gè)分離的GCRV的序列差異，親緣關(guān)系和基因型。結(jié)果顯示，這25個(gè)GCRV分離株可分為4個(gè)基因，在GCRV中，相對保守的VP4、VP6和VP7基因編碼大部分外殼蛋白包括很多可變位點(diǎn)。所以，VP4、VP6和VP7能用作GCRV基因分型。GCRV096、GCRV JX01、GCRV 873、GCRV 875、GCRV 876和 GCRV 991是基因Ⅰ型，AGCRV 和 AGCRV PB01-155是基因Ⅱ型，GCRV HZ08、GCRV GD108、GCRV 918、GCRV HuNan794、GCRV HeNan988、GCRV 106、GCRV ZS11、GCRV QC11、GCRV HN12、GCRV HS11、GCRV YX11、GCRV JS12、GCRV QY12、GCRV JX02和 GCRV 097是基因Ⅲ型，GCRV104 是基因Ⅳ型。以上這些研究都表明在中國有至少3個(gè)基因型的草魚呼腸病毒。

表2　完成部分節(jié)段測序的草魚呼腸病毒及其信息

病毒名稱Virus測序片段Segments片段大小/bpFragmentsizeGenBank登錄號Accession№測定時(shí)間DeterminedtimeGCRV-JX01S10909JX0428072013GCRVS13949AF260511S12000GCRVS23877AF260511S22000GCRVS33702AF260511S32000GCRVS81287AF2590532000GCRVS10909AF2366882001GCRV-ZS11S91257KC1300822013GCRV-YX11S91257KC1300812013GCRV-QY12S91257KC1300802013GCRV-QC11S91257KC1300792013GCRV-NC11S91257KC1300782013GCRV-JS12S91257KC1300772013GCRV-HS11S91257KC1300762013GCRV-HN12S91257KC1300752013GCRV-096S61981JN2066642013GCRV-096S10855JN2066652012GrasscarphemorrhagicvirusS33702AF2845032000GrasscarphemorrhagicvirusS23877AF2845022000GrasscarphemorrhagicvirusS91130AF2845042003GrasscarphemorrhagicvirusS71414AF2391742000GrasscarphemorrhagicvirusS11820AF2343212000GrasscarphemorrhagicvirusS52239AF2512622000GrasscarphemorrhagicvirusS62039AF2391752001GrasscarphemorrhagicvirusS10909AF2366882001

草魚呼腸病毒的流行具有典型的季節(jié)性，其主要原因在于該病毒的聚合酶最適溫度為28℃，因此，草魚出血病的高發(fā)期就主要是在夏季，其水溫為25℃～30℃時(shí)最易暴發(fā)。在很多高密度飼養(yǎng)的草魚種池，當(dāng)水的溫度超過24℃時(shí)，病毒增殖迅速，可對魚體的免疫系統(tǒng)發(fā)生作用，致使魚體發(fā)生嚴(yán)重的功能障礙導(dǎo)致死亡。而在水溫低于20℃時(shí)，病毒的增殖會受到抑制甚至部分病毒會失去感染性，但大多可以保留其抗原性，因此，在低溫環(huán)境時(shí)，魚體在攜帶病毒的情況下可產(chǎn)生特異性抗體，即使溫度回暖再感染強(qiáng)毒，也可耐過，所以草魚出血病大多只在氣候溫暖的南方水域發(fā)生，而在我國北方罕見。曾偉偉[5]等建立了三重PCR檢測技術(shù)，利用建立的三重PCR方法對2009年-2011年期間從全國各地收集的草魚出血病病料進(jìn)行檢測和初步流行病學(xué)分析，結(jié)果表明，Ⅰ型陽性率 為9.3%，Ⅱ型陽性率為45.3%，Ⅲ型陽性率為2.3%，Ⅰ型和Ⅱ型混合感染陽性率為5.8%，Ⅱ和Ⅲ型混合感染陽性率為2.3%，其他類型的混合感染未檢測到。表明目前主要流行的草魚呼腸病毒為Ⅱ型。

3　抗草魚呼腸病毒免疫相關(guān)因子

作為機(jī)體免疫重要組成部分的免疫相關(guān)因子，已經(jīng)被廣泛研究。在草魚上，主要研究了與先天性免疫有關(guān)的基因(蛋白)、信號通道基因(蛋白)、調(diào)節(jié)基因(蛋白)等。Feng Xiaoli等[6]進(jìn)行了關(guān)于草魚TBK1基因的研究，TBK1基因是一種誘導(dǎo)IFN分化的信號通路激酶，TBK1的過度表達(dá)能通過誘導(dǎo)IFN-Ⅰ和Mx1的產(chǎn)生來抑制病毒感染，參與抗病毒和抗菌的免疫應(yīng)答，同時(shí)它能調(diào)節(jié)自身平衡以避免過度活化產(chǎn)生的不良效果，在抗病毒和抗菌的先天性免疫中起重要作用；Feng Xiaoli等[7]還進(jìn)行了關(guān)于IFN刺激物STING的研究，STING是一種重要的RLR通路響應(yīng)調(diào)節(jié)物，通過抑制GCRV生成而表現(xiàn)出有抗病毒的活性，它不僅能通過IFN-依賴通路應(yīng)答dsRNA類似物，而且能通過IFN-Ⅰ獨(dú)立通路應(yīng)答病毒和細(xì)菌的PAMPs，在先天性免疫中有非常重要的作用；Cai Jia等[8]進(jìn)行了關(guān)于N4BP1基因應(yīng)答GCRV感染的研究，N4BP1蛋白是一種交互蛋白，同時(shí)也是N4E3連接酶的一種底物，GCRV感染后，N4BP1會上調(diào)，在CIK細(xì)胞系中超表達(dá)來抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄，在病毒入侵的免疫應(yīng)答中起重要作用； Chen等進(jìn)行了關(guān)于RIG-I基因的研究，RIG-I是一種重要的檢測核苷酸病原相關(guān)分子模式的胞質(zhì)模式識別受體，同時(shí)在先天性免疫應(yīng)答中調(diào)節(jié)IFN-Ⅰ和誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子，試驗(yàn)用qRT-PCR方法檢測經(jīng)GCRV或病毒PAMP攻毒和細(xì)菌PAMPs刺激后相關(guān)因子mRNA的表達(dá)量，結(jié)果表明RIG-Ⅰ對dsRNA、細(xì)菌PAMPs都有應(yīng)答,在抗病毒和抗菌的先天性免疫中發(fā)揮重要作用；Peng等做了關(guān)于Mx蛋白的研究，Mx蛋白通過IFN-Ⅰ信號通路調(diào)節(jié)在抗多種病毒的先天性免疫應(yīng)答中起重要作用，試驗(yàn)用RT-qPCR檢測了經(jīng)GCRV感染后的3種Mx和IFN-Ⅰ基因的表達(dá)，結(jié)果表明4種基因都表達(dá)了，Mx的表達(dá)與IFN-Ⅰ的表達(dá)無相關(guān)性，研究顯示Mx基因能抑制GCRV的復(fù)制，它的超表達(dá)調(diào)節(jié)IFN-Ⅰ基因的反饋抑制行為；Su等進(jìn)行了骨髓分化因子88(MyD88)的研究，試驗(yàn)克隆了一段草魚全長MyD88的cDNA，用GCRV感染發(fā)現(xiàn)MyD88表達(dá)上調(diào)，分析表明MyD88或許參與了草魚的抗病毒免疫防御；Su等進(jìn)行了細(xì)胞質(zhì)解旋酶蛋白MDA5(黑素瘤分化關(guān)聯(lián)基因5)的研究，表明MDA5能識別dsRNA和ssRNA長分子，調(diào)節(jié)IFN-I的分泌，注射GCRV后用半定量RT-PCR檢測，MDA5的mRNA表達(dá)上調(diào)，分析表明在草魚中MDA5參與了早期的抗GCRV的抗病毒先天免疫防御； Pei Y Y等[9]研究用GCRV和LPS刺激草魚，發(fā)現(xiàn)GCRV刺激后，草魚組織中的TLR4水平出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)，LPS刺激后，TLR4出現(xiàn)了下調(diào)的現(xiàn)象；Yu Xiaobo等[10]通過化學(xué)方法獲得2種遠(yuǎn)志的甲醇提取物，分別刺激草魚腎細(xì)胞系(CIK)并測定免疫基因(Mx1、IL-1b、TNFa、MyD88和IgM)水平，化合物1和2都能使Mx1，IL-1b，TNFa和MyD88出現(xiàn)不同程度上調(diào)，且化合物2(3，4，5-三甲氧基肉桂酸)比化合物1(1，5-脫水-D-山梨醇)效果更顯著。結(jié)果表明這些化合物能調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因，一定程度上產(chǎn)生消滅病毒和寄生蟲感染的效果；Jiang Yao等[11]用鞭毛蛋白和GCRV刺激草魚，CiTLR5a和CiTLR5b水平都顯著上調(diào)了，其他的MyD88、NF-κB、IRF7、IL-1β和TNF-α也上調(diào)了，說明CiTLR5a和CiTLR5b參與了鞭毛蛋白和GCRV刺激的應(yīng)答反應(yīng)；Li Yan等[12]用GCRV感染刺激草魚CIK細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)能引起CiTrap1水平的上調(diào)，同時(shí)這項(xiàng)研究結(jié)果表明，CiTrap1參與宿主的先天性抗病毒感染應(yīng)答反應(yīng)可能是通過保護(hù)受感染的細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。這些結(jié)果顯示了草魚體內(nèi)的先天性免疫因子在抗病毒感染上的變化和作用，或許我們可通過刺激誘導(dǎo)草魚的先天性免疫來增強(qiáng)草魚的抗GCRV能力。

在研究過程中，有些學(xué)者發(fā)現(xiàn)某些基因型的特點(diǎn)或許可以在選育抗草魚呼腸病毒的草魚苗種上提供參考，這為防治草魚出血病提供了新思路。Wan等進(jìn)行了關(guān)于IPS-1基因的研究，IFN-β啟動(dòng)刺激物IPS-1在生產(chǎn)IFN-Ⅰ和促炎性細(xì)胞因子中起重要作用，統(tǒng)計(jì)分析顯示基因型為3741TT的比基因型-3741CC的對GCRV的抵抗力要強(qiáng)。Wan Quanyuan等[13]做了關(guān)于LGP2基因的研究，在RNA病毒感染的先天性免疫中LGP2是實(shí)用的檢測物和調(diào)節(jié)物，試驗(yàn)表明LGP2不同的基因型與對GCRV的抵抗力(易感性)有密切相關(guān)，-1392GG基因型比CC基因型對GCRV更敏感，494TT基因型和4403TT基因型比AA和CC對GCRV更有抵抗力。Wang等報(bào)道MDA5是RLR家族的成員，在應(yīng)對病毒感染的先天性免疫中起重要作用，試驗(yàn)結(jié)果表明基因型-713C/G和3338A/C與對GCRV的抵抗力關(guān)系密切，-713G和3338C對GCRV有抵抗力。Wan Quanyuan等[14]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)RIG-Ⅰ編碼區(qū)缺失的突變基因，它與對GCRV的抵抗力(易感性)有關(guān)，對照試驗(yàn)表明經(jīng)GCRV攻毒后有缺失突變的組累積死亡率更高。這些結(jié)果表明草魚體內(nèi)的某些基因?qū)共蒴~呼腸病毒有幫助。若能選育出抗GCRV的草魚品種，將會對草魚出血病的防治提供極大的幫助。

4　GCRV檢測方法

目前針對草魚呼腸病毒建立了很多檢測方法，為疾病的快速準(zhǔn)確診斷、流行病學(xué)的調(diào)查以及疾病的防治打下了基礎(chǔ)。這些檢測方法大致可分為以下四類：

常規(guī)PCR檢測方法，實(shí)現(xiàn)了從單重到多重的檢測。2010年，Zhang等以S10基因片段為模板，用先進(jìn)的RNA提取技術(shù)建立RT-PCR檢測方法，515 bp的S10片段dsRNA能檢出的最低值是1.0 fg，該技術(shù)能用于GCRV和其他dsRNA的快速診斷。2011年，Chi等建立了雙重PCR檢測方法，根據(jù)GCRV-GD108株的11個(gè)節(jié)段序列和GCRV標(biāo)準(zhǔn)株分別設(shè)計(jì)引物，篩選出適合的引物對，該方法能在一次反應(yīng)中鑒別出病毒屬GCRV或GCRV-GD108株，可以提高檢測效率同時(shí)節(jié)約成本。2012年，王曉豐等根據(jù)GenBank中GCRV VP6蛋白基因保守序列設(shè)計(jì)引物，以GCHV-892總RNA為模板，通過RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增出目的條帶，并對該方法能檢測的最低濃度是102拷貝數(shù)/μL，方法特異性良好。2012年，曾偉偉等[5]建立了三重PCR檢測方法，根據(jù)GCRV各類型毒株的保守區(qū)域設(shè)計(jì)3對引物，該法敏感性、特異性、穩(wěn)定性良好，且能在一次反應(yīng)中鑒別毒株所屬基因型，鑒別效率比上述雙重PCR更高，應(yīng)用前景更廣，是一種能對草魚出血病進(jìn)行快速診斷和分子流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查的方法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)檢測方法提高了靈敏度。 2011年，周勇等用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出GCRV VP6基因片段，克隆到載體上，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pEGFP-N1-VP6，作為模板進(jìn)行TaqMan real-time PCR擴(kuò)增，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，同時(shí)可進(jìn)行定量分析，能用于GCRV的快速診斷和定量檢測。2011年-2012年期間，劉寶芹等做了兩個(gè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究，一個(gè)是根據(jù)GCRV HZ08株S7基因保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，用含有 S7 基因全長的重組質(zhì)粒 PAVX1-S7 作為標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建出標(biāo)準(zhǔn)曲線，比常規(guī)PCR方法更能檢測出草魚出血?。涣硪粋€(gè)研究是根據(jù)GCRV JX-0901株S7基因保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，構(gòu)建出標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗(yàn)表明該方法有較好的敏感性和特異性。2013年，殷亮等[15]根據(jù)基因Ⅰ型GCRV S6保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，并構(gòu)建含PVAX1-S6片段的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法靈敏、高效、特異、可重復(fù)性強(qiáng)，適用于GCRV基因Ⅰ型的快速檢測和定量分析。2013年，楊映等[16]建立了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法，根據(jù)傳統(tǒng)毒株GCRV-873的S6基因序列和新型毒株GCRV GD-108的L2基因序列設(shè)計(jì)引物，從多對中篩選出兩對合適的引物，該方法靈敏度達(dá)10拷貝數(shù)/μL，特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性比普通PCR更好，且一次反應(yīng)就能鑒別出新型GCRV和傳統(tǒng)型GCRV,可用于草魚呼腸病毒的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)檢測方法可在基層應(yīng)用。2013年，Zeng W W等[17]根據(jù)GCRV-HZ08 S6基因片段保守序列設(shè)計(jì)了6個(gè)RT-LAMP引物，結(jié)果可通過熒光染料顯色直接觀測，能檢出最低10拷貝數(shù)/μL的量，特異性良好，能簡單快速的檢測GCRV HZ08基因型的感染。2012年，張金鳳等[18]根據(jù)GCRV VP6基因序列設(shè)計(jì)引物，以病毒全基因組RNA為模板，該方法使用SYBR Green Ⅰ熒光染料，結(jié)果易判定且靈敏度達(dá)33 pg，且能簡捷快速的檢測和診斷草魚出血病。2012年，王曉豐等根據(jù)GenBank中GCRV HZ08等毒株的VP6蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，以GCRV-892總RNA為模板，該方法的敏感度達(dá)10拷貝數(shù)/μL，適用于和GCRV HZ08屬同一基因型的病毒檢測。2012年，李玉平等根據(jù)GCRV VP6基因序列設(shè)計(jì)引物，以樣品cDNA為模板，用SYBR Green Ⅰ作染料，能通過肉眼觀察來判定結(jié)果，該方法適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖臨床上對GCRV快速診斷。2013年，楊水仙等[19]根據(jù)GenBank登錄號為AF236688的VP7基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，驗(yàn)證篩選出RT-LAMP特異性引物，該方法準(zhǔn)確性高，所需條件易滿足，檢測方法簡單，能直接判定結(jié)果，可用于基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場檢測。

2013年，He Yongxing等[20]根據(jù)草魚IgM的保守序列制備和篩選出單克隆抗體，建立了一種特異性針對GCRV VP7蛋白抗體的蛋白印跡法，該法能用于GCRV感染的血清學(xué)診斷。2014年，Jing Hongli等[21]建立了單克隆抗體檢測GCRV的方法，用組氨酸標(biāo)簽對重組的VP4進(jìn)行重構(gòu)并在E.coli中大量表達(dá)，該方法針對重組的VP4蛋白獲得了4種單克隆抗體 ，特異性和敏感性好，能用于GCRV的準(zhǔn)確診斷。

5　草魚出血病的防控

目前草魚出血病的防控大致可分為疫苗預(yù)防免疫、抗病毒藥物防治和土法防控三類，以疫苗免疫為主。

5.1疫苗防控

生產(chǎn)上用得較多的是組織滅活疫苗和減毒活疫苗，亞單位疫苗和基因疫苗還沒有在生產(chǎn)上推廣使用。陳道印等報(bào)道用漁場出血病病料制作的毒種疫苗，又用于本漁場的草魚接種，保護(hù)率達(dá)98.03%，能有效的防控草魚出血?。缓獍矆?bào)道珠江水產(chǎn)研究所研制的草魚出血病凍干細(xì)胞弱毒疫苗，免疫保護(hù)率達(dá)90%以上，有免疫原性強(qiáng)、免疫效果好、免疫保護(hù)期長等優(yōu)點(diǎn)；林明輝等報(bào)道用草魚出血病凍干細(xì)胞疫苗(防治病毒性出血病)與細(xì)菌性“三聯(lián)”滅活疫苗(防治細(xì)菌性爛鰓病、腸炎病、赤皮病)肌肉注射草魚，與對照組相比，免疫效果顯著，可有效防治草魚四病的發(fā)生，是提高養(yǎng)殖效益的有效措施；劉林等構(gòu)建了將GCRV VP6基因克隆進(jìn)載體桿狀病毒的核酸疫苗，免疫試驗(yàn)表明此核酸疫苗具有較好的免疫保護(hù)效果。Tian Yuanyuan等[22]報(bào)道了在GCRV-GD108 VP4上有多個(gè)B細(xì)胞抗原決定簇，用原核載體pET32a在E.coliBL21(DE3)株中表達(dá)VP4重組蛋白，試驗(yàn)結(jié)果表明此亞單位疫苗可用來對GCRV-GD108株進(jìn)行免疫；鄒勇構(gòu)建了含GCRV外衣殼蛋白VP6基因的重組基因疫苗，以氫氧化鋁佐劑為免疫增強(qiáng)劑，設(shè)置濃度梯度和對照試驗(yàn)，結(jié)果顯示此疫苗能夠誘導(dǎo)草魚產(chǎn)生免疫反應(yīng)，有很高的免疫保護(hù)率。 亞單位疫苗和基因疫苗有較好的免疫效果，但是技術(shù)含量高，成本也很高，制備過程復(fù)雜，目前沒能得到推廣應(yīng)用。接種草魚出血病凍干細(xì)胞弱毒疫苗是一種比較有效的免疫方法，但弱毒苗有復(fù)壯的風(fēng)險(xiǎn)，在使用過程中需小心。

5.2抗病毒藥物防控及土法防控

除了主流的以注射疫苗免疫的防控方法外，還有一些其他的防控手段，使用抗生素和中草藥是最常見的手段。例如投喂“三黃粉”，用水花生、大蒜頭和鹽拌餌投喂，大黃、黃芩、黃柏、板藍(lán)根拌飼投喂；金處方藥劑的外消和內(nèi)服，投喂楓香樹葉、大黃硫酸銅合劑浸洗病魚或全池潑灑以及菜油煮沸后冷卻與經(jīng)煮沸后的大黃混勻全池潑灑等方法；郭慧玲報(bào)道了用金銀花、菊花、大黃、黃柏研碎混勻加水全池潑灑等方法；蘭作友報(bào)道用生石灰，病毒靈(黃芪多糖)、諾氟沙星、板蘭根，適當(dāng)添加維生素，維生素C治療8 d，能起到很好的效果；張忙友報(bào)道使用晉鑫底凈、止血康鰓、菌毒清、胰腎病毒康、敗毒散、止痢停、10%恩諾沙星粉、高穩(wěn)維生素 CAE治療，7 d后草魚停止死亡。

免疫途徑有口服、浸泡和注射這幾種，經(jīng)口服投食飼喂的方式要經(jīng)過胃腸道的消化吸收，免疫效果會被削弱；浸泡免疫要通過機(jī)體屏障，免疫效果也不理想；這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)是省時(shí)省力。注射法的免疫效果好，但魚個(gè)體小，數(shù)量多，操作起來繁瑣復(fù)雜，對于漁場來說工作量非常大，而且注射也可能對魚造成機(jī)體傷害。技術(shù)的進(jìn)步帶來口服法和浸泡法的改進(jìn)。李瑞偉等[23]報(bào)道了GCHV細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗的微囊化技術(shù)，能降低疫苗抗原的損失，以海藻酸鈉、殼聚糖為微囊壁材，以滅活疫苗為微囊芯材，制備成微囊疫苗，試驗(yàn)與疫苗口服組、對照組做了比較，結(jié)果顯示微囊疫苗有62.5%的相對免疫保護(hù)力。Xue Renyu等[24]報(bào)道了一種以蠶蛹做口服疫苗的方法，構(gòu)建了一個(gè)含2個(gè)GCRV VP6基因的載體pFastBac-FA-VP6-ph-VP6，重組桿狀病毒BacFish-vp6，用以飼喂5齡蠶，5 d后用蠶的凍干粉末作口服疫苗，結(jié)果顯示這種口服疫苗是有效的。劉秋鳳等[25]做了GCRV為載體培養(yǎng)技術(shù)與滅活疫苗浸泡免疫效果研究，試驗(yàn)優(yōu)化了CIK細(xì)胞在微載體Cephodex上的培養(yǎng)條件，并在此微載體的CIK細(xì)胞上培養(yǎng)GCRV病毒，然后制備滅活疫苗并用浸泡法免疫草魚，結(jié)果顯示浸泡免疫后增強(qiáng)了機(jī)體的免疫保護(hù)力。

草魚出血病病原主要侵染在草魚的活組織細(xì)胞中而致病。采用化學(xué)藥物治療則因?yàn)樗幬锖茈y滲入到病毒所感染的組織細(xì)胞或滲入的含量很低而達(dá)不到殺滅病毒的藥量，所以很難達(dá)到療效。采用免疫法來提高草魚自身對出血病病毒的抵抗能力，以防控草魚出血病的發(fā)生,是非常有效的防治途徑。

6　展望

當(dāng)前，防治草魚出血病的最為有效的辦法仍然是疫苗免疫，但疫苗使用過程中，問題也比較多，目前獲得法規(guī)許可的疫苗產(chǎn)品僅有一種，通過連續(xù)傳代致弱的活疫苗，而且未獲得大規(guī)模的推廣應(yīng)用和認(rèn)可，主要原因其一是安全性問題，因?yàn)橥ㄟ^連續(xù)傳代致弱的毒株，可能在感染敏感宿主之后，又毒力返強(qiáng)了；其二是弱毒疫苗不適合在氣溫比較高的時(shí)候應(yīng)用；其三是價(jià)格還比較貴。通過多來源、多途徑的方式開發(fā)研制低毒、高效、速效的新型免疫增強(qiáng)劑已成為草魚出血病防治研究的主要趨勢，而隨著對草魚免疫機(jī)制的更深入、更全面的研究,口服型免疫增強(qiáng)劑將會成為控制草魚出血病、提高草魚免疫力極為有效的途徑。

能同時(shí)檢測和鑒別所有草魚呼腸病毒株型標(biāo)準(zhǔn)診斷方法的建立，做好魚苗苗種病原檢測，確保放養(yǎng)的草魚魚苗不攜帶病毒，是降低和控制草魚出血病流行與爆發(fā)的重要措施。疫苗免疫仍然是今后草魚出血病防控最為重要的手段，根據(jù)草魚出血病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，研制針對當(dāng)前草魚出血病流行株型的多價(jià)或單價(jià)滅活疫苗和新一代弱毒活疫苗是當(dāng)前草魚出血病防控最為緊要的事情；亞單位疫苗、DNA疫苗等基因工程新型疫苗的研制，是今后草魚出血病疫苗發(fā)展的方向；草魚出血病疫苗的免疫途徑仍然是以注射為主，這種免疫方式比較繁瑣，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，也增加了疫苗的應(yīng)用成本，提高口服疫苗和浸泡疫苗免疫效果是今后草魚出血病疫苗研究的重要方向。

雖然對草魚呼腸病毒進(jìn)行了多方面的研究，但是草魚出血病的防控形勢依然嚴(yán)峻，每年該病的爆發(fā)依然對漁業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失，通過疫苗免疫的手法有一定效果但不能完全防控該病。對草魚呼腸病毒進(jìn)行研究，從分子生物學(xué)、宿主對病毒的敏感性和病毒的交叉免疫保護(hù)效果方面開展研究，以期能對該病的防控做出更多的貢獻(xiàn)。

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收稿日期：2015-11-07

基金項(xiàng)目：江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20152ACF60021)；國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD25B02)

作者簡介：李賢(1989-)，男，湖南邵陽人，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病害研究。*通訊作者

中圖分類號:S941.41

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)07-0094-08

Progress on Grass Carp Reovirus

LI Xian1,2，ZENG Wei-wei1，WANG Qing1，WANG Ying-ying1，LI Ying-ying1，SHI Cun-bin1，WU Shu-qin1

(1．PearlRiverFisheryResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,KeyLaboratoryofFisheryDrugDevelopment,MinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofAquaticAnimalImmuneTechnology,KeyLaboratoryofFisheryDrugDevelopment，MinistryofAgriculture，Guangzhou，Guangdong，510380，China；2．CollegeofFisheriesandLifeScience，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai，201306，China)

Abstract:Grass carp hemorrhage caused by grass carp reovirus,is a highly contagious and fatal viral disease，frequent outbreaks of the disease cause huge economic losses to our grass carp and freshwater aquaculture.In this paper，grass carp reovirus genome sequence and genotyping，epidemiology，innate immunity，detection methods，immune prevention research progress in these areas in recent years were reviewed,in order to provide reference for the grass carp reovirus studies，and prevention and control of grass carp hemorrhage.

Key words:Grass carp reovirus; genome; epidemiology; innate immunity; detection method