王育偉，岳　華，張曉暉，周愛(ài)民，李廷見(jiàn)，毛東林，肖　龍

(綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川綿陽(yáng) 621000)

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專(zhuān)論與講座

雞毒支原體研究概況

王育偉，岳華，張曉暉，周愛(ài)民，李廷見(jiàn)，毛東林，肖龍

(綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川綿陽(yáng) 621000)

摘要：雞毒支原體(MG)是對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害很大的支原體，主要導(dǎo)致禽類(lèi)慢性呼吸道疾病(CRD)，以禽的結(jié)膜炎、產(chǎn)蛋率及飼料轉(zhuǎn)換率下降、屠宰率下降等為主要特征。MG可通過(guò)垂直和水平傳播方式在雞群中傳播，每年給全球家禽產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。隨著對(duì)MG細(xì)胞表面抗原黏附素蛋白(pMGA)和PvpA、GapA的結(jié)構(gòu)與功能研究的深入，K株、TG5株等MG疫苗研究也取得較大進(jìn)展。由于抗生素的濫用，MG基因中也發(fā)生耐藥突變，產(chǎn)生了QRDRs等抗藥結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致MG在耐藥性上也出現(xiàn)新的特點(diǎn)。論文主要對(duì)國(guó)內(nèi)外MG的疫苗開(kāi)發(fā)、耐藥情況和檢測(cè)技術(shù)等進(jìn)行綜述，旨在對(duì)家禽MG的綜合防控提供借鑒。

關(guān)鍵詞：雞毒支原體；檢測(cè)；疫苗；防控；耐藥性

雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)是致病性最強(qiáng)、引起損失最大的支原體，主要導(dǎo)致雞慢性呼吸道疾病(Chronic respiratory disease，CRD)。MG在禽體內(nèi)潛伏6 d～21 d后，可使患禽出現(xiàn)呼吸道啰音、咳嗽、流鼻涕等癥狀，部分表現(xiàn)為結(jié)膜炎、眶下竇炎。CRD雖然致死率不高，但嚴(yán)重影響家禽產(chǎn)蛋率、孵化率和飼料轉(zhuǎn)化率，給養(yǎng)殖企業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。隨著人們長(zhǎng)期用藥不規(guī)范，使得MG獲得對(duì)泰樂(lè)菌素、替米考星等藥物產(chǎn)生了可遺傳耐藥性[1]，有關(guān)MG的抗原特征、耐藥性情況、疫苗研究也取得了一些進(jìn)展。

1　病原學(xué)特征

1.1病原

雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)是目前發(fā)現(xiàn)的最小(0.25 μm～0.5 μm)、最簡(jiǎn)單的原核生物，屬于軟皮體綱支原體目。MG經(jīng)吉姆薩染色在鏡下呈球狀，可在含馬、豬滅活血清的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，形成大小為0.2 mm～0.3 mm中央凸起且光滑的圓盤(pán)狀菌落。MG血清型屬于A型，可發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖，產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣，對(duì)瓊脂培養(yǎng)基中的馬血清具有溶血特性。

1.2抗原及毒力因子

多項(xiàng)研究證明禽類(lèi)發(fā)生呼吸道癥狀與MG的表面抗原相關(guān)，目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MG胞漿膜上有200多個(gè)特征性多肽，其中對(duì)黏附素和血凝素研究相對(duì)深入。MG黏附素蛋白(protein of MG adhesion,pMGA,p67) 是MG的細(xì)胞膜蛋白，之后又發(fā)現(xiàn)了p52和p77。在ts-11和S6菌株證明有P67(pMGA)存在,通過(guò)pMGA單克隆抗體的抵抗紅細(xì)胞凝集作用，表明pMGA在促進(jìn)紅細(xì)胞凝集中發(fā)揮重要作用。在S6株的研究中，加入pMGA抗體后表達(dá)頻繁的pMGA1.1變?yōu)閜MGA1.9，說(shuō)明了pMGA可高度自我調(diào)節(jié)以保持MG的正常生理功能。

黏附素變相蛋白(phase variant protein of adhesion，PvpA)是由PvpA基因家族編碼的48 ku～55 ku蛋白，主要存在于MG細(xì)胞膜內(nèi)。體外試驗(yàn)表明抗體反應(yīng)與PvpA的表達(dá)與變異均相關(guān)，說(shuō)明PvpA蛋白在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。PvpA具有高度變異性，可通過(guò)變異編碼不同抗原蛋白，在協(xié)助MG逃逸方面起重要作用[2]。MG含有大小為105 ku的蛋白(GapA)，利用GapA抗體Fab片段特異性阻斷GapA后MG的侵染能力下降，表明GapA蛋白具有促進(jìn)MG定植的作用[3]。人們還發(fā)現(xiàn)GapA+的ts-11菌株比GapA-菌株需要更少的劑量便達(dá)到同樣的免疫效果，說(shuō)明了GapA蛋白在促進(jìn)免疫反應(yīng)方面具有重要作用[4]。至今為止，研究人員不斷發(fā)現(xiàn)MG的重要蛋白，還未發(fā)現(xiàn)MG產(chǎn)生毒素。

2　檢測(cè)技術(shù)

盡早準(zhǔn)確檢測(cè)MG直接影響著家禽健康與經(jīng)濟(jì)效益，關(guān)系到我國(guó)現(xiàn)代化家禽業(yè)發(fā)展，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，大量基于DNA及蛋白的先進(jìn)檢測(cè)方法取得了明顯進(jìn)展。

2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是伴隨著單克隆抗體(MAb)技術(shù)產(chǎn)生的一種血清檢測(cè)技術(shù)，特異性和敏感性明顯提高。Rocha T S等[5]利用重組的二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶重要蛋白r-E2，獲得兔多抗血清后進(jìn)行rec-ELISA檢測(cè)MG，該方法具有高特異性，且未發(fā)現(xiàn)MS和MI的抗原交叉性。我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT553中采用的間接熒光抗體試驗(yàn)(IFA)，也是將熒光檢測(cè)與血清學(xué)方法結(jié)合。寧官保等[6]通過(guò)膠體金試紙條技術(shù)實(shí)現(xiàn)了MG的快速檢測(cè)，精確度達(dá)到94.5%?？傮w看來(lái)，血清學(xué)診斷相關(guān)技術(shù)雖未能做到對(duì)MG的準(zhǔn)確診斷，但在MG患禽的篩選與輔助診斷中具有重要意義。

2.2分子生物技術(shù)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在MG的檢測(cè)中越來(lái)越廣泛。PCR技術(shù)利用TaqDNA聚合酶等實(shí)現(xiàn)樣本微量DNA的快速擴(kuò)增，借助于熒光等標(biāo)記實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)便、高效等優(yōu)點(diǎn)。16 S rRNA基因序列中存在的V3和V4高變區(qū)，有人將其作為細(xì)菌鑒定的分子依據(jù)，只是16 S rRNA PCR技術(shù)檢測(cè)MG的特異性仍待提升。real-time PCR技術(shù)是對(duì)特定的DNA序列定量檢測(cè)最靈敏的方法之一，Raviv Z等[7]利用對(duì)mgc2、16-23 S進(jìn)行基因檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)MG、MS、MM和MI等支原體，具有非常高的特異性和準(zhǔn)確性。趙杰等[8]設(shè)計(jì)了gapA-F/gapA-R、mgc2-F1/mgc2-R1、mgc2-F2/mgc2-R2等5對(duì)引物進(jìn)行MG的套式PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)mgc2引物的檢測(cè)靈敏度高達(dá)57.6 pg/μL，且與MS無(wú)交叉性。同樣，隨意擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析(random amplified polymorphic DNA，RAPD)和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)，可根據(jù)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度實(shí)現(xiàn)鑒別[9]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，以MG丙酮酸脫氫酶復(fù)合體PDHa基因?qū)G進(jìn)行LAMP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)靈敏度比現(xiàn)有PCR方法高10倍以上[10]。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)(splicing by overlap extension polymerase chain reaction，SOE-PCR)是用來(lái)插入特定突變?cè)谔囟c(diǎn)的序列或拼接較小的DNA片段到1個(gè)較大的多核苷酸，也是檢測(cè)MG感染的重要手段[11]。

3　疫苗研發(fā)

3.1滅活疫苗

滅活疫苗具有安全、穩(wěn)定和易保存等優(yōu)點(diǎn)，解決了MG感染帶來(lái)的產(chǎn)蛋率下降問(wèn)題。MG滅活疫苗是通過(guò)加熱或化學(xué)(如甲醛)方法將MG滅活后，刺激動(dòng)物產(chǎn)生體液免疫。目前我國(guó)市場(chǎng)上主要滅活疫苗3G呼凈威，疫苗株為MG的F36株，通過(guò)2次～3次頸部皮下注射免疫后，家禽可獲得較好的免疫保護(hù)效果。MG油乳劑滅活苗能引起機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，安全、不散毒，該疫苗可護(hù)衛(wèi)雞群免受強(qiáng)毒株(R株)的攻擊，在一定程度上可防止MG經(jīng)蛋傳播。然而疫苗使用降低了MG排放量從而減輕CRD癥狀，但不能抑制MG的水平傳播。Tan L等[12]將MG GroEL蛋白重組成功表達(dá)在大腸埃希菌BL21(DE3)與pET-28a(+)載體后具有ATP酶活性，補(bǔ)體依賴(lài)性殺菌試驗(yàn)表明，兔抗血清rGroEL具有類(lèi)似于MG誘導(dǎo)雞抗血清的良好殺菌效果，提示GroEL作為一種新型候選滅活疫苗。

3.2弱毒疫苗

弱毒疫苗是目前用于預(yù)防CRD的主流疫苗，具有免疫反應(yīng)快、用量少等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)外已開(kāi)發(fā)了MG ts-11株、MG6/85株和F株等，我國(guó)也有MG活苗F36株。F株是應(yīng)用時(shí)間最長(zhǎng)和最廣泛的疫苗，能明顯提高患病雞的產(chǎn)蛋量。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)其具有引發(fā)感染的潛在威脅，F(xiàn)株免疫沒(méi)有取代其他毒株反而感染未接種的雞群，MG F株可經(jīng)蛋傳方式傳播給子代雞[13]。

在安全性方面，MG 6/85株和MG ts-11株對(duì)非目標(biāo)雞群的水平傳播能力差，其安全性要比F菌株明顯高很多。MG疫苗ts-11株是是由澳大利亞田間分離株80083株經(jīng)化學(xué)誘變和溫度敏感(33℃)篩選方式研制的疫苗，具有毒性小、傳播差的特點(diǎn)。Biro J等[14]對(duì)49 日齡雞的疫苗安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，TS-11菌株在體重、病變和臨床表現(xiàn)方面均具有良好安全性。MG6/85株是由美國(guó)研發(fā)的疫苗，主要用于預(yù)防蛋雞產(chǎn)蛋下降，對(duì)產(chǎn)蛋率、蛋重和蛋殼強(qiáng)度影響不大，是目前比較安全的活疫苗。

美國(guó)喬治大學(xué)Ferguson-noel N M等[15]在2012年研發(fā)出的MG活苗K株，接種10 d～39 d后未見(jiàn)氣囊及氣管明顯損傷，說(shuō)明其具有較好的安全性。保護(hù)性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)K株MG氣霧免疫后對(duì)R株的保護(hù)周期可達(dá)7周，5個(gè)世代的毒力測(cè)定未見(jiàn)到MG毒力返強(qiáng)。另外，K株具有表型穩(wěn)定且不會(huì)垂直傳播的優(yōu)點(diǎn)，具有較高的安全性和MG疫苗開(kāi)發(fā)潛力，因此K株在保護(hù)蛋雞和肉雞方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值[16]。目前我國(guó)市售活疫苗菌株主要是F36株，由青島易邦生物工程有限公司、浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司等多個(gè)公司生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)外常見(jiàn)疫苗株研發(fā)及特征見(jiàn)表1所示。

表1　國(guó)內(nèi)外MG相關(guān)疫苗及特征

注(Note)：IM= intramuscular injection,IH= subcutaneous injection.

4　防控技術(shù)

4.1抗菌藥物治療

抗菌藥物是目前預(yù)防和治療MG感染的主要手段之一，為養(yǎng)殖企業(yè)減少了經(jīng)濟(jì)損失。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物為首選，如紅霉素、羅紅霉素和阿奇霉素等，氟喹諾酮類(lèi)如左氧氟沙星、加替沙星和莫西沙星等，四環(huán)素類(lèi)也用于MG的治療。近年來(lái)，MG耐藥性菌株的交叉耐藥越來(lái)常見(jiàn)，甚至分離到了對(duì)8種抗生素同時(shí)耐藥的超級(jí)MG[17]。有研究比較了S6、ts-11、6/85及本地MG株的耐藥性，表明除土霉素、金霉素和硫姆林外，恩諾沙星、林可霉素等均具一定敏感性[18]。研究稱(chēng)MG對(duì)多西環(huán)素(0.20 μg/mL)和硫姆林(0.10 μg/mL) 最敏感，恩諾沙星、金霉素和林可霉素表現(xiàn)出耐藥性。最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)是用來(lái)評(píng)價(jià)MG對(duì)藥物敏感性的重要指標(biāo)。劉軼秋等[19]將S6株和R株在含替米考星的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行耐藥MG篩選，發(fā)現(xiàn)經(jīng)6代～8代培養(yǎng)后MIC便可升至128 μg/mL。研究發(fā)現(xiàn)替米考星耐藥菌株R株、PG31株和S6均對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物表現(xiàn)交叉耐藥性，MG僅對(duì)沃尼妙林敏感。

近年來(lái)，MG交叉耐藥性機(jī)理研究越來(lái)越深入，耐藥結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生成為MG耐藥機(jī)理研究熱點(diǎn)。喹諾酮類(lèi)藥物耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining regions，QRDRs)是影響MG對(duì)喹諾酮藥物敏感性的重要結(jié)構(gòu)，與DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV基因序列及氨基酸序列緊密相關(guān)[20]。Reinhardt A K等[21]對(duì)MG突變株QRDRs的氨基酸測(cè)序結(jié)果表明Ser、Gln等8個(gè)氨基酸互換，與gyrA基因81、83、84和87處出現(xiàn)4個(gè)突變點(diǎn)有關(guān)，導(dǎo)致QRDRs蛋白構(gòu)相發(fā)生變化。23 S RNA靶位的Ⅴ和Ⅱ區(qū)域蛋白結(jié)構(gòu)變異是引起大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗藥性的重要原因，與2 058、2 059和2 611等位點(diǎn)堿基突變有關(guān)[22]。GTS序列測(cè)定對(duì)比表明耐藥性菌株23 S rRNA出現(xiàn)了2 058、2 059、2 061、2 447和2 503等關(guān)鍵堿基位點(diǎn)堿基突變[19,22]，機(jī)理可能涉及堿基轉(zhuǎn)換改變導(dǎo)致密碼子、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的變異而隱蔽了氯霉素和氟苯尼考等的結(jié)合位點(diǎn)[23]。在中藥治療方面，陳美安等[24]體外研究表明兩面針、板藍(lán)根、黃連等提取物對(duì)MG具有抑制作用，對(duì)MG中藥防治進(jìn)行了有益的探索。

4.2疫苗免疫接種

疫苗免疫接種是提高機(jī)體抗MG感染的最有效手段，在禽業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著重要的地位。MG油乳劑滅活疫苗不僅可保護(hù)R株等強(qiáng)毒株侵襲，還可提高商品蛋雞產(chǎn)蛋率；在控制RCD發(fā)病和降低染病禽MG排毒量方面效果明顯。Merial、MSD和Zoetis等國(guó)外疫苗公司先后開(kāi)發(fā)出F株、ts-11、S6和6/85菌株等弱毒疫苗，保護(hù)力和安全性不斷提高，顯著降低了因產(chǎn)蛋率下降和氣囊炎所帶來(lái)的損失。近年來(lái)，雖無(wú)直接證據(jù)表明F株、ts-11、S6和6/85株等疫苗的致病性，弱毒疫苗在生物安全上存在返強(qiáng)的可能性。因此，相關(guān)工作者應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)豈G毒株類(lèi)型有選擇地進(jìn)行疫苗免疫。

4.3管理措施

有效的生物安全措施是控制MG的基礎(chǔ)，也是切斷MG傳播途徑非常有效的手段，浸蛋法和加熱法(46.1℃)就是通過(guò)切斷MG的蛋-蛋垂直傳播途徑起作用的。MG的檢測(cè)依賴(lài)于PCR、RAPD等先進(jìn)的技術(shù)，目前美國(guó)執(zhí)行的NPIP在原種雞上取得的MG凈化成績(jī)得益于此。隨著MG Rlow株的全基因測(cè)序完成，結(jié)合先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)實(shí)施凈化程序，有利于無(wú)支原體感染種雞群的培育。MG研究中也發(fā)現(xiàn)QRDRs等耐藥結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，WHO、歐盟先后制定了相關(guān)政策對(duì)治療用抗菌藥物生長(zhǎng)促進(jìn)劑(AGP)使用，可見(jiàn)抗生素合理使用也是重要的防控手段。

5　小結(jié)

綜上所述，MG作為對(duì)禽類(lèi)威脅最大的支原體，其綜合防控與凈化是一項(xiàng)系統(tǒng)工程。首先，準(zhǔn)確而快速的診斷技術(shù)是做好MG防控工作的基礎(chǔ)，NPIP和巴西國(guó)家家禽健康計(jì)劃(plano nacionalde sanidade avícola,PNSA)都說(shuō)明了快速檢測(cè)的重要意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)借助先進(jìn)檢測(cè)手段達(dá)到防控MG的目的。單一或多重PCR技術(shù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)、RAPD等分子生物學(xué)方法越來(lái)應(yīng)用越多，對(duì)保障禽業(yè)健康發(fā)展起到了重要作用。疫苗免疫在控制CRD和提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)收益方面非常重要，但應(yīng)做好疫苗特異性與安全監(jiān)測(cè)工作。由于全球抗菌藥物的研發(fā)速度遠(yuǎn)低于MG耐藥性產(chǎn)生的速度，ts-11株等疫苗株的研發(fā)與更新仍然是保障禽業(yè)安全的重要手段。

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收稿日期：2015-12-28

基金項(xiàng)目：綿陽(yáng)市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(14N-03-2)；綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院科技創(chuàng)新項(xiàng)目基金

作者簡(jiǎn)介：王育偉(1982-)，男，山東濟(jì)南人，助理研究員，博士，主要從事畜禽疫病防控及品種選育工作。

中圖分類(lèi)號(hào):S852.62

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)07-0106-05

Introduction toMycoplasmagallisepticum

WANG Yu-wei,YUE Hua,ZHANG Xiao-hui,ZHOU Ai-min,LI Ting-jian,MAO Dong-lin,XIAO Long

(MianyangAcademyofAgriculturalSciences,Mianyang,Sichuan,621000,China)

Abstract:Mycoplasma gallisepticum (MG) is the most dangerous pathogen of Mycoplasma in poultry,which mainly cause the Chronic Respiratory Disease(CRD) with the symptom of conjunctivitis,decreased egg production,feed conversion rate and carcasses.MG can be spreaded through the vertical and horizontal transmission in the chicken group,seriously restricting the development of poultry breeding and industrialization each year.In recent years,many researches on the structure and function of protein of MG adhesion (pMGA),PvpA and GapA were did,promoting the development of gene detection technology.With the abuse of antibiotics,drug resistance mutations，QRDRs and other drug resistant structures were also found in MG,with new characteristics in drug resistance.This article mainly focused on the research of drug resistance and detection technology,hoping to provide a theoretical basis for the comprehensive prevention and control of poultry MG.

Key words:Mycoplasma gallisepticum; detection; vaccine; prevention and control; drug resistance