胡　凌，林星宇，盧　鵬，陳有才，張　軍，胡衛(wèi)杰，武　剛

（1.四川省自貢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川　自貢　643000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院；3.西南交通大學(xué)）

抗菌肽的研究進(jìn)展

胡凌1，林星宇2，盧鵬3，陳有才1，張軍1，胡衛(wèi)杰1，武剛1

（1.四川省自貢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川自貢643000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院；3.西南交通大學(xué)）

1　概述

隨著傳統(tǒng)抗生素的大量使用，藥物殘留和菌株耐藥性等問題變得越來越嚴(yán)重，尋找新型抗生素替代品已迫在眉睫?？咕囊云洫?dú)特的抗菌機(jī)制及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，引起了學(xué)界的廣泛關(guān)注，學(xué)者們普遍認(rèn)為其在替代傳統(tǒng)抗生素、減少菌株耐藥性等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。1972年，Boman等首先從果蠅中發(fā)現(xiàn)了抗菌肽。1974年，Boman等又從天蠶蛾蛹的血液淋巴中發(fā)現(xiàn)了具有抗菌活性的多肽；1980年，Huhmark等從惜古比天蠶蛹中分離到3種抗菌多肽，后來將其發(fā)現(xiàn)的抗菌肽命名為Cecropin（天蠶素）；1981年，Steiner等在Nature上發(fā)表了CecropinA和CecropinB的氨基酸序列，這被認(rèn)為是第一個(gè)真正意義上的抗菌肽。此后，抗菌肽被分離、純化和鑒定的種類數(shù)量越來越多，至今已有兩千多種抗菌肽及其類似物被發(fā)現(xiàn)。

抗菌肽（antibacterialpeptides）又被稱為抗微生物肽（antimicrobialpeptides，AMPs），是一類具有抗微生物活性的小分子多肽，動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌都能產(chǎn)生，一般由12～50個(gè)氨基酸組成，是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。AMPs首先是作為抗生素替代品被人們所知的，相比于傳統(tǒng)抗生素，細(xì)菌對(duì)AMPs不易產(chǎn)生抗性、耐藥性。因?yàn)锳MPs主要通過與細(xì)胞膜相互作用來殺菌而不是抑菌，而傳統(tǒng)抗生素一般是抑菌而不是殺菌。且AMPs的抗菌機(jī)制除了破壞細(xì)胞膜外，還能進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)去抑制一系列的生理生化反應(yīng)；有些AMPs兼具破壞膜完整性和抑制生理生化反應(yīng)的雙重作用機(jī)制。值得注意的是，AMPs的本質(zhì)是多肽，因此其生物活性與其理化性質(zhì)密切相關(guān)，相關(guān)理化因素的改變將會(huì)導(dǎo)致AMPs生物活性的變化。

2　抗菌肽的分類

AMPs的來源廣泛、數(shù)量眾多，因而AMPs的分類方法多種多樣，下面介紹幾種目前常用的分類方法。人們依據(jù)AMPs的來源不同，將其分為哺乳動(dòng)物AMPs、昆蟲AMPs、水生動(dòng)物AMPs、兩棲類AMPs、禽類AMPs、植物AMPs、真菌AMPs和細(xì)菌AMPs等。依據(jù)合成形式的不同，將其分為核糖體合成的AMPs和非核糖體合成的AMPs。依據(jù)所帶電荷的不同，又可分為陽離子AMPs和陰離子AMPs。

依據(jù)AMPs的二級(jí)結(jié)構(gòu)不同，將其分為α-螺旋型AMPs、β-折疊型AMPs、環(huán)形結(jié)構(gòu)AMPs和富含某些氨基酸殘基的AMPs。

3　抗菌肽的作用機(jī)理

3.1抗菌肽的抗菌機(jī)制

由于AMPs大多都帶正電荷，其首先通過靜電引力與細(xì)胞膜上的負(fù)電荷區(qū)域相互作用，再經(jīng)一系列的過程最終在細(xì)胞膜上形成孔洞或者進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到殺死細(xì)菌的作用。無論如何，AMPs與細(xì)胞膜之間相互作用是其發(fā)揮抗菌機(jī)制的第一步。有些AMPs還能穿透胞膜到細(xì)胞內(nèi)，作用于DNA、RNA、酶和蛋白質(zhì)等分子，除了直接抑制細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的合成，還可以抑制細(xì)胞的呼吸作用和細(xì)胞壁的合成。

3.2抗菌肽的抗病毒機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)，AMPs不僅能夠殺死細(xì)菌，而且還能抑制病毒，這為抗病毒藥物的研發(fā)提供了新的途徑。其抑制病毒的機(jī)理為：①直接與病毒衣殼蛋白相互作用，阻斷病毒的吸附侵入；②抑制病毒基因表達(dá)和病毒蛋白合成，從而抑制病毒的復(fù)制；③上調(diào)干擾素和趨化因子的表達(dá)，刺激宿主細(xì)胞的抗病毒免疫系統(tǒng)從而間接發(fā)揮其抗病毒活性。

3.3抗菌肽的抗真菌機(jī)制

AMPs對(duì)真菌也有一定的殺傷作用，其作用機(jī)理為：①妨礙真菌細(xì)胞壁的正常合成，從而殺死真菌；②與細(xì)胞內(nèi)線粒體及核酸等細(xì)胞器相互作用，比如其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致ATP外流，從而導(dǎo)致真菌死亡；③胞膜攻擊作用，與抗菌機(jī)制相似，其可以破壞真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使得重要內(nèi)容物外漏，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這也是AMPs殺傷真菌細(xì)胞的最基本的作用機(jī)制。

3.4抗菌肽的抗腫瘤機(jī)制

AMPs除了能對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌等有抑制作用外，還具有抑制或者殺滅腫瘤的作用，這一發(fā)現(xiàn)引起了學(xué)者們的關(guān)注，對(duì)其作用機(jī)制的研究也越來越多。目前，發(fā)現(xiàn)的作用機(jī)制有：①通過攻擊腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而在其細(xì)胞膜上形成孔道，引起細(xì)胞內(nèi)容物大量滲出，最終使腫瘤細(xì)胞不能維持滲透壓而死亡；②破壞腫瘤細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，主要使腫瘤細(xì)胞染色體DNA斷裂，從而達(dá)到破壞細(xì)胞骨架的目的；③通過線粒體途徑和死亡受體途徑等誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

4　抗菌肽的基因工程研究

AMPs以其獨(dú)特的抗菌機(jī)制及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，在替代傳統(tǒng)抗生素、減少菌株耐藥性等方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景。但AMPs的獲得途徑有限，限制了AMPs產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用。因此利用基因工程技術(shù)來獲得AMPs具有重要意義，其不僅可使生產(chǎn)AMPs的成本降低、還可以使其產(chǎn)量提高。但由于AMPs為具有生物學(xué)活性的小分子多肽，因而其容易被蛋白酶降解，且其表達(dá)產(chǎn)物通常會(huì)殺傷宿主，這使得利用基因工程技術(shù)來獲得AMPs較為困難。為解決這些問題，科學(xué)家們做了許多的探索，最終找到了一些途徑來避免這些問題的發(fā)生。比如可通過融合表達(dá)的方式來獲得AMPs以避免其對(duì)宿主的傷害，或者用真核表達(dá)系統(tǒng)來替代原核表達(dá)系統(tǒng)保證AMPs的順利表達(dá)。目前，一般使用原核表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)來獲得AMPs。

5　抗菌肽在畜牧業(yè)中的應(yīng)用

5.1抗菌肽在飼料添加劑中的應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，在飼料添加劑中使用AMPs能夠促進(jìn)動(dòng)物生長。此后，學(xué)者們對(duì)此進(jìn)行了大量的試驗(yàn)。汪以真等研究發(fā)現(xiàn)，重組豬乳鐵蛋白（rPLF）不僅對(duì)豬腸道微生物菌群有類似于抗生素的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)其還能促進(jìn)益生菌的生長，從而促進(jìn)動(dòng)物的生長。馬衛(wèi)明等研究發(fā)現(xiàn)，豬小腸AMPs能夠使雛雞小腸對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收增加，從而促進(jìn)雛雞的生長發(fā)育。陳曉生等用CADYP飼喂肉鴨，發(fā)現(xiàn)CADYP能顯著提高肉鴨的日增重和凈肉率。綜上表明，AMPs用作飼料添加劑有良好的應(yīng)用前景。隨著AMPs的生產(chǎn)成本降低，在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用也將會(huì)越來越廣泛。

5.2抗菌肽在疫病防治中的作用

大量研究表明，AMPs具有廣譜的抗菌活性，可在一定程度上減少抗生素的臨床用量，減少耐藥菌株的出現(xiàn)。陳曉生等比較了蠶抗菌肽-AD制劑與金霉素對(duì)鴨腸道菌群（大腸桿菌和乳酸菌）的影響情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMPs對(duì)這兩種細(xì)菌都有明顯的抑制作用，而金霉素只對(duì)乳酸菌有顯著抑制作用，對(duì)大腸桿菌抑制作用并不顯著，初步證明AMPs調(diào)節(jié)雛鴨腸道菌群平衡能力優(yōu)于金霉素。馬衛(wèi)明等研究發(fā)現(xiàn)，豬小腸AMPs對(duì)多種致病菌均有不同程度的抑制作用，其殺菌率由59.5%～98.5%不等。汪以真等比較了7種 AMPs（cecropinP1、cecropinA、magainin2、defensin1、bactenecin、lactoferricin和indolicidin）與4種抗生素（鹽酸金霉素、去甲萬古霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素）體外對(duì)大腸桿菌K88、大腸桿菌（ATCC25922）、豬霍亂沙門氏菌（ATCC50020）、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌（ATCC25923）的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)AMPs對(duì)幾種革蘭氏陽性菌和陰性菌有不同程度的抗菌效果，盡管抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果要好于AMPs，但某些AMPs對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果優(yōu)于抗生素。馬曉艷等研究發(fā)現(xiàn)，新疆家蠶抗菌肽（CecropinXJ）對(duì)革蘭氏陽性球菌的生長有抑制作用，而對(duì)大腸桿菌抑制作用不明顯。其抑菌效果雖沒有抗生素抑菌效果好，但可與抗生素聯(lián)合使用來減少耐藥性。王芳等的體外抑菌試驗(yàn)表明，Nisin在普通肉湯和牛奶中對(duì)奶牛乳房炎的主要致病菌金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌均有良好的抑制作用，且對(duì)青霉素耐藥的菌株也具有較好的抑制作用。

6　面臨的問題

隨著AMPs在臨床上的應(yīng)用，必將為生物醫(yī)藥領(lǐng)域帶來一場(chǎng)新的革命。但如果要將AMPs藥物全面推向市場(chǎng)可能還要面臨許多的挑戰(zhàn)，還需解決以下幾個(gè)問題。

6.1抗菌肽的安全性問題

目前，我們?nèi)鄙貯MPs藥效動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)（包括潛在的免疫毒性）等方面的研究數(shù)據(jù)；異源性的AMPs應(yīng)用于動(dòng)物或在人類全身用藥時(shí)可能會(huì)引起過敏反應(yīng)；許多天然AMPs都有溶血作用，不利于AMPs的藥物開發(fā)。因此，如何在保持AMPs生物學(xué)活性的同時(shí)，降低其細(xì)胞毒性是急需解決的問題之一。

6.2抗菌肽的體內(nèi)穩(wěn)定性問題

AMPs雖具有一定的熱穩(wěn)定性，但其一級(jí)結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)堿性氨基酸殘基（如賴氨酸、精氨酸），因而容易被蛋白酶降解，從而限制了AMPs作為藥物在體內(nèi)的使用。因此，如何使AMPs在體內(nèi)避免被蛋白酶降解也是需要解決的問題，這直接關(guān)系到AMPs藥物的應(yīng)用效果。

6.3抗菌肽的耐藥性問題

從進(jìn)化的觀點(diǎn)來看，既然有些細(xì)菌可以產(chǎn)生AMPs，因此其也必然存在逃避自身AMPs的作用機(jī)制。從生物學(xué)的觀點(diǎn)來看，雖然AMPs對(duì)細(xì)菌有多種作用機(jī)制，但一般以細(xì)胞膜為其主要的作用靶點(diǎn)，進(jìn)而改變膜完整性或干擾胞內(nèi)生理生化反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)菌死亡。因此，細(xì)菌可以通過減弱與AMPs結(jié)合、降低AMPs有效濃度等方式產(chǎn)生對(duì)AMPs的耐受。研究證實(shí)，病原微生物可通過分泌蛋白酶降解胞外AMPs；降低細(xì)胞外膜負(fù)電荷從而減少與AMPs結(jié)合；修飾細(xì)胞外膜屏蔽AMPs；排出已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的AMPs；改變膜流動(dòng)性等方式來抵御AMPs的作用。□