朱紅芳，潘群，李春霞，王麗瓊

(武漢市武昌醫(yī)院，武漢430063)

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miR-425對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其機(jī)制

朱紅芳，潘群，李春霞，王麗瓊

(武漢市武昌醫(yī)院，武漢430063)

目的 探討miR-425對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其機(jī)制。 方法 RT-PCR測定卵巢細(xì)胞系SKOV3及正常卵巢細(xì)胞系HOSE中miR-425表達(dá)水平，將SKOV3細(xì)胞分為lent-shmiR-425和lent-shvector組，分別轉(zhuǎn)染lent-shmiR-425和lent-shvector，24 h后行細(xì)胞劃痕試驗(yàn)和Transwell侵襲小室試驗(yàn)。應(yīng)用TargetScan預(yù)測miR-425與PTEN因子3′端非翻譯區(qū)結(jié)合位點(diǎn)。將SKOV3細(xì)胞分成3組:野生型質(zhì)粒組、突變型質(zhì)粒組、陰性對照組，分別共轉(zhuǎn)染miR-425及野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-PTEN 3′UTR，miR-425和突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-PTEN 3′WT，miR-425和對照熒光素酶質(zhì)粒，用熒光素酶試驗(yàn)檢測各組熒光素酶活性。結(jié)果 在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中miR-425相對表達(dá)量為2.1，正常卵巢細(xì)胞系HOSE為1.0，兩者比較，P<0.05。lent-shmiR-425組劃痕愈合率為27.56%±2.14%，lent-shvector組劃痕愈合率為89.15%±6.24%，兩組比較，P<0.05。lent-shmiR-425組侵襲細(xì)胞數(shù)為(75±10)個(gè)/200倍視野，lent-shvector組侵襲細(xì)胞數(shù)為(160±20)個(gè)/200倍視野，兩組比較，P<0.05。TargetScan預(yù)測miR-425與PTEN因子3′端非翻譯區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合；野生型質(zhì)粒組、突變型質(zhì)粒組、陰性對照組熒光素酶活性分別為23.70±0.93、99.27±5.90、104.00±4.02。野生型質(zhì)粒組低于突變型質(zhì)粒組和陰性對照組(P均<0.05)。突變型質(zhì)粒組與陰性對照組比較，P>0.05。結(jié)論 miR-425水平升高可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲，其機(jī)制可能與miR-425靶向調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)有關(guān)。

卵巢腫瘤；miR-425；遷移；侵襲

卵巢癌被認(rèn)為是腫瘤致死性疾病的第五大元兇[1],其在診斷時(shí)往往已進(jìn)入晚期[2]。如何快速早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌，監(jiān)控其侵襲轉(zhuǎn)移并實(shí)施治療，成為卵巢癌治療倍受關(guān)注的問題。微小RNA(miRNA)已被證明是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)節(jié)因子[3]，其在后轉(zhuǎn)錄水平通過部分綁定到靶標(biāo)mRNA，導(dǎo)致mRNA降解以及翻譯抑制[4]，精確調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和免疫反應(yīng)等[5]。miR-425家族包括miR-425、miR-425-3p和miR-425-5p。miR-425在乳腺癌中的功能已被報(bào)道[6]。PTEN是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙磷酸酶活性的抑癌基因，其異常廣泛存在于人類多種惡性腫瘤中[6]。然而，miR-425在卵巢癌中的表達(dá)及其與PTEN基因的關(guān)系，以及在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。2015年2月～2016年2月，本研究著重探討了miR-425對卵巢癌遷移和轉(zhuǎn)移的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和正常人卵巢上皮細(xì)胞系HOSE購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心。Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen，Carksbad，CA，USA),實(shí)驗(yàn)所需一抗(santa公司)，二抗(武漢博士德生物有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美國Hyclone公司),lent-shmiR-425和lent-shvector(RiboBio公司)。TRIzol(Invitrogen，Carksbad，CA，USA),All-in-One microRNA抽提試劑盒和All-in-One miRNA qRT-PCR檢測試劑盒 (GeneCopoeia, Carlsbad, CA, USA)，ABI Prism7700 System(ABI, Foster City,CA,USA)，SYBR Green Reagents (TaKaRa, Tokyo, Japan)

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 SKOV3和HOSE細(xì)胞系置于添加了10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。取對數(shù)期SKOV3細(xì)胞分成lent-shmiR-425組及l(fā)ent-shvector組，依照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書對兩組分別轉(zhuǎn)染lent-shmiR-425和lent-shvector，最終轉(zhuǎn)染濃度為20 nmol/L。培養(yǎng)24 h后行細(xì)胞劃痕及Transwell侵襲小室試驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞miR-425基因的相對表達(dá)量檢測 采用RT-PCR 法。采用All-in-One microRNA抽提試劑盒提取細(xì)胞總miRNA, All-in-One miRNA qRT-PCR檢測試劑盒分離miRNAs。按試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。miR-425和U6的引物由GeneCopoeia (Carlsbad, CA, USA)設(shè)計(jì),反應(yīng)體系：1×Taq Buffer 2 μL,25 mmol/L MgCl21.2 μL, 10 mmol/L dNTP 0.2 μL,10 pmol/μL上游引物0.4 μL,10 pmol/μL下游引物0.4 μL,cDNA模板 1 μL,DEPC水 14.7 μL，2.5 U/μL Taq酶0.1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性10 min, 95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，在4 ℃下共40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法定量，以U6小核RNA作為內(nèi)參，計(jì)算miR-425基因的相對表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞遷移能力的檢測 采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)。將lent-shmiR-425組和lent-shvector組細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，待細(xì)胞融合后，用無菌槍頭沿直線用力劃直線。計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(遷移前劃痕面積-遷移后劃痕面積)/遷移前劃痕面積×100%。重復(fù)3次。劃痕愈合率越高，表示遷移能力越高。

1.5 細(xì)胞侵襲能力的檢測 采用Transwell侵襲小室試驗(yàn)。lent-shmiR-425組和lent-shvector組各取5×104細(xì)胞, 種在Transwell小室的碳酸磷脂表面，含10 % FBS的 RPMI1640置于下層作為化學(xué)引誘物。孵育24 h后，移走上層細(xì)胞。遷移侵染的細(xì)胞與4%聚丙烯混合，0.2%結(jié)晶紫染色，顯影并在倒置顯微鏡200倍視野下觀察計(jì)數(shù)。隨機(jī)取10個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 生物信息學(xué)分析及預(yù)測 通過TargetScan(http://www.targetscan.org)、mirDB(http://mirdb.org)及PicTar(http://pictar.bio.nyu.edu)三種生物信息學(xué)軟件預(yù)測可能靶向作用于PTEN的miRNA。

1.7 miR-425與PTEN靶向關(guān)系的驗(yàn)證 采用熒光素酶試驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h, 將SKOV3細(xì)胞接種于24孔板中，分成野生型質(zhì)粒組、突變型質(zhì)粒組及陰性對照組，野生型質(zhì)粒組共轉(zhuǎn)染miR-425及野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-PTEN 3′UTR，突變型質(zhì)粒組共轉(zhuǎn)染miR-425和突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-PTEN 3′WT，陰性對照組共轉(zhuǎn)染miR-425和對照熒光素酶質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行熒光活性檢測。獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)3次，每次6個(gè)復(fù)孔。以海腎熒光素光吸收值作為內(nèi)參。螢光素酶活性=螢火蟲熒光素光吸收值/海腎熒光素光吸收值。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞系中miR-425的表達(dá)比較 在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中miR-425相對表達(dá)量為2.1，在正常卵巢細(xì)胞系HOSE中miR-425相對表達(dá)量為1.0，兩者比較，P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較lent-shmiR-425組與lent-shvector組miR-425表達(dá)量分別為0.16和1.98,提示lent-shmiR-425沉默表達(dá)成功。24h后，lent-shmiR-425組劃痕愈合率為27.56%±2.14%，lent-shvector組劃痕愈合率為89.15%±6.24%，兩組比較，P<0.05。lent-shmiR-425組侵襲細(xì)胞數(shù)為(75±10)個(gè)/200倍視野，lent-shvector組侵襲細(xì)胞數(shù)為(160±20)個(gè)/200倍視野，兩組比較，P<0.05。

2.3 各組熒光素酶活性比較 野生型質(zhì)粒組、突變型質(zhì)粒組、陰性對照組分別為23.70±0.93、99.27±5.9、104.00±4.02。野生型質(zhì)粒組顯著低于突變型質(zhì)粒組和陰性對照組(P均<0.05)。突變型質(zhì)粒組與陰性對照組相比，P>0.05。

3 討論

卵巢癌是起源于上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。因發(fā)現(xiàn)時(shí)往往是晚期及惡性程度高，卵巢癌預(yù)后不佳、進(jìn)展較快。明確卵巢癌的惡性腫瘤生物學(xué)特征及其機(jī)制對設(shè)計(jì)新的治療藥物和手段具有重要意義。

miRNA是含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA前體，經(jīng)過Dicer加工后的一類非編碼的小分子RNA(18～25個(gè)核苷酸)，通過與靶基因的種子區(qū)序列相互配對抑制其基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，廣泛存在于真核生物體中。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在多種腫瘤組織包括卵巢癌中均有特異性的表達(dá)譜，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的各個(gè)階段，且每一個(gè)階段都有相應(yīng)的基因發(fā)生改變，同時(shí)也有調(diào)控這些基因的miRNA發(fā)生變化。已有研究表明，miR200c、miR141、miR199a、miR145、miR130和miR101等miRNA對卵巢癌細(xì)胞生長過程均有不同程度的調(diào)控[7]。另有研究表明，miR-425可以調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖、提高肺癌細(xì)胞的侵襲性。本研究結(jié)果顯示，在卵巢癌細(xì)胞系中miR-425高表達(dá)，在SKOV3中轉(zhuǎn)染lent-shmiR-425下調(diào)miR-425表達(dá)，行細(xì)胞劃痕及遷移試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-425表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力減弱。提示miR-425促進(jìn)卵巢癌遷移和侵襲，起促癌作用。

PTEN是腫瘤抑制子家族中的一員，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，廣泛參與包括細(xì)胞增殖、再生、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過程。PTEN定位于染色體10q23，可通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控細(xì)胞周期和遷移[8]。有研究認(rèn)為，PTEN基因敲除導(dǎo)致的胃癌可被miR-236介導(dǎo)的cyclinD1/cdc25A信號通路調(diào)控。有研究顯示，miR-205通過靶向作用于PTEN調(diào)節(jié)人類鼻咽癌的抗輻射性。本研究通過TargetScan預(yù)測到miR-425與PTEN因子3′端非翻譯區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野生型質(zhì)粒組熒光素酶活性低于突變型質(zhì)粒組和陰性對照組，證實(shí)miR-425與PTEN是靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。本研究首次在卵巢癌中研究miR-425的表達(dá)及對卵巢癌遷移和侵襲的影響，是對miRNA在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)譜的有益補(bǔ)充，是對卵巢癌腫瘤生物學(xué)行為的進(jìn)一步揭示，有可能成為一種新的治療分子靶標(biāo)。

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王麗瓊(E-mail:liqiongwang@21cn.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.011

R737.31

A

1002-266X(2016)45-0037-03

2016-06-08)