劉亮

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教師教學(xué)發(fā)展中心，沈陽　110847）

葛根芩連湯對糖尿病大鼠早期視網(wǎng)膜病變影響的實驗研究

劉亮

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教師教學(xué)發(fā)展中心，沈陽110847）

［目的］探討葛根芩連湯對糖尿病大鼠早期視網(wǎng)膜病變的治療作用。［方法］選取45只Wistar大鼠，鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射，制作糖尿病模型，糖尿病模型建立后隨機分為DM組（糖尿病組）、DM+NS組（糖尿病生理鹽水注射組）和實驗組（DM+葛根芩連湯組）。模型建立后，DM組不做任何處理，實驗組給予葛根芩連湯8.2 g/kg，DM+NS組注射等體積的生理鹽水。對糖尿病大鼠的空腹血糖、血漿胰島素、體質(zhì)量、甘油三酯（TG）和高密度脂蛋白（HDL-C）的含量進(jìn)行檢測，以觀察葛根芩連湯降糖降脂功效；通過免疫印跡（Westem blot）法檢測視網(wǎng)膜蛋白激酶B（PKB）以及炎性相關(guān)因子——細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達(dá)情況；利用蘇木-伊紅（HE）染色觀察各組大鼠的超微結(jié)構(gòu)；采用TUNEL法檢測凋亡相關(guān)蛋白C-myc的凋亡指數(shù)。［結(jié)果］與DM組和DM+NS組比較，實驗組大鼠空腹血糖明顯降低、體質(zhì)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與DM組和DM+NS組比較，實驗組大鼠血胰島素含量增加，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與DM組和DM+NS組比較，實驗組大鼠TG明顯降低而HDL-C明顯升高（P＜0.05）。通過Westem blot檢測可見與DM組和DM+NS組比較，實驗組大鼠PKB的表達(dá)明顯增加、ICAM-1的表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；光鏡下HE染色觀察到各組超微結(jié)構(gòu)：DM組可見核固縮、濃染，核膜內(nèi)陷，染色質(zhì)邊集，凋亡小體出現(xiàn)，實驗組變化明顯減輕（P＜0.05）；與DM組和DM+NS組比較，實驗組中凋亡相關(guān)蛋白C-myc明顯減少（P＜0.05）。［結(jié)論］葛根芩連湯能夠改善大鼠空腹血糖、血漿胰島素及體質(zhì)量等的變化，具有較好的降糖降脂作用，能通過增加PKB的表達(dá)及抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的炎癥反應(yīng)減輕或延緩糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。

葛根芩連湯；糖尿??；大鼠；早期視網(wǎng)膜病變；PKB；ICAM-1

中醫(yī)學(xué)家張仲景在其《傷寒雜病論》中記載葛根芩連湯具有降糖和改善糖尿病病變程度的功效［1-3］。葛根芩連湯主治表證未解，邪熱入里證，由葛根、黃芩、黃連和炙甘草4味中藥組成。實驗研究表明葛根芩連湯不僅能夠降低多種糖尿病動物模型的血糖值，還能夠改善糖尿病并發(fā)癥［4-7］。葛根芩連湯各單味藥及全方中，成分均較復(fù)雜，其含有小分子化合物及微米、納米尺度的顆粒物質(zhì)，能表現(xiàn)出不同的細(xì)胞活性［8-9］。本研究通過制作鏈脲佐菌素（STZ）糖尿病模型，探討中醫(yī)藥在改善糖尿病大鼠血糖、血清胰島素及血脂等指標(biāo)中的作用，以期觀察葛根芩連湯對糖尿病大鼠早期視網(wǎng)膜病變的治療作用，為葛根芩連湯的應(yīng)用提供實驗依據(jù)，也為糖尿病視網(wǎng)膜病變的防治提供一種新方法。

1　實驗動物與主要試劑

1.1實驗動物健康SD大鼠45只，鼠齡為1月齡，雌雄不限，體質(zhì)量（220～260）g，于恒溫下飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，實驗前1天禁食不禁水。實驗中對動物處置方法符合動物倫理學(xué)要求。SD大鼠購自遼寧醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（遼）20050002。

1.2主要試劑STZ由北京北京萊博賽斯生物科技有限公司購進(jìn)；甘油三酯（TG）測定試劑盒由美國Sigma公司提供；高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）與測定試劑盒（PTA-Mg2+沉淀法）均購自美國Santa cruz公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒購自大連寶生生物公司；羅氏血糖儀由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司提供；Optium試紙（Abbott Diabetes Care Ltd）由美國SANTA公司產(chǎn)品提供，免疫印跡（Western blot）法反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由杭州博日提供；ICAM-1抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；PKB抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；石蠟切片機購自北京天根生化有限公司；超凈工作臺由蘇州安泰空氣技術(shù)公司提供；眼科顯微器械購自Thermo Forma公司；熒光倒置顯微鏡由德國Leica公司提供；葛根、黃芩、黃連、甘草購自北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司提供。

作者簡介：劉亮（1982-），男，碩士，主要從事中醫(yī)內(nèi)科學(xué)研究。

2　方法

2.1大鼠糖尿病模型制備及實驗分組將45只SD大鼠給予高脂高糖飼料4周后，按45 mg/kg的劑量腹腔1次性經(jīng)尾靜脈注射STZ（用前溶于檸檬酸鹽緩沖液，pH 4.5），注射后2周內(nèi)用快速血糖儀連續(xù)2次、間隔至少2 d測大鼠尾端空腹血糖，血糖連續(xù)兩次≥16 mmol/L，且出現(xiàn)多飲、多食、多尿表現(xiàn)，體質(zhì)量減輕者為糖尿病模型成功。建立后采用隨機數(shù)字表法分為DM組（糖尿病組）、DM+NS組（糖尿病生理鹽水注射組）和實驗組（DM+葛根芩連湯組）。模型建立后，DM組不做任何處理，實驗組給予葛根芩連湯8.2 g/kg，DM+NS組注射等體積的生理鹽水。

2.2各組糖尿病大鼠血糖、體質(zhì)量、血胰島素、TG 和HDL-C含量變化檢測對大鼠體質(zhì)量進(jìn)行動態(tài)測定。隔夜禁食10 h后采用羅氏血糖儀進(jìn)行大鼠尾端空腹血糖的檢測。血胰島素由遼寧醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心生化室及核醫(yī)學(xué)同位素室檢測。抽取各組大鼠尾靜脈血，離心后取血清，測定血清中TG和HDL-C的含量，方法見試劑盒說明書。

2.3Westem blot法檢測蛋白激酶B（PKB）以及細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1）的表達(dá)情況于顯微鏡下去除眼前節(jié)，然后小心分離視網(wǎng)膜，將視網(wǎng)膜組織放入1 mL EP管中，棄去上清，加入1 μL的苯甲基磺酰氟（PMSF）裂解液，搖勻置于冰上超聲裂解，裂解30 min，4℃條件下14 000 r/min（r=8 am）離心5 min。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞3次，提取總蛋白，應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度。吸取50 μg總蛋白，去離子水補至20 μL，入等體積2×上樣緩沖液，以5%濃縮膠40 V衡壓1 h，以10%分離膠60 V恒壓3.5 h，濕轉(zhuǎn)14 V恒壓14 h，37℃下?lián)u床封閉2 h，分別加入1∶1 000稀釋的PKB及ICAM-1一抗4℃過夜，次日，膜用三乙醇胺緩沖鹽水溶液（TBS-T）洗滌3次，每次10 min，洗膜后加入二抗放入1∶5 000 HRP標(biāo)記的二抗及 GAPDH，37℃搖床孵育60 min。TBST洗膜5 min，4次。二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，實驗重復(fù)3次。用超敏ECL法檢測。最后暗室曝光X線片，沖洗膠片，Image-Pro Plus 8.0軟件軟件分析條帶灰度值檢測，PKB及ICAM-1與GAPDH的比值作為PKB及ICAM-1相對表達(dá)量。

2.4糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)觀察大鼠于乙醚麻醉狀態(tài)下斷髓處死，以碘酒3點位標(biāo)記，迅速摘除眼球，清除眼前段組織，小心分離視網(wǎng)膜，將視網(wǎng)膜組織用4%戊二醛固定固定24 h，4℃保存，做石蠟切片，用二甲苯脫蠟后，依次浸入梯度乙醇（70%、80%、95%、無水乙醇）中進(jìn)行脫水處理。然后用蒸餾水清洗切片2 min，放置于蘇木素染液中浸泡10 min，再用蒸餾水清洗切片，隨后浸入梯度乙醇，用伊紅乙醇溶液染色后，通過二甲苯透明。樹膠封片，放置于恒溫箱中干燥后于顯微鏡下觀察，并攝像。顯微鏡下每張切片于受損腦組織區(qū)取不重復(fù)的5個視野，觀察各組腦組織病理學(xué)形態(tài)變化。

2.5TUNEL法檢測凋亡相關(guān)蛋白C-myc的凋亡指數(shù)將石蠟切片脫臘后，用梯度乙醇進(jìn)行脫水處理，采用PBS液清洗5min，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，再經(jīng)PBS液清洗2次每次清洗時間為5min，用20 mg/L Proteinase K通透細(xì)胞15 min，PBS浸洗5 min，浸入4%多聚甲醛固定5 min。加入100 μL的平衡液平衡10 min，于37℃下與TUNEL混和液反應(yīng)60 min，經(jīng)PBS清洗5 min共3次，加入DAB混合液避光顯色，用蘇木素復(fù)染后自來水沖洗，利用梯度乙醇脫水。采用二甲苯透明1 min，2次，中性樹膠封片，拍照，顯微鏡下于每張切片選取5個視野（×400）計數(shù)500個細(xì)胞，求得陽性細(xì)胞百分率，計算細(xì)胞凋亡指數(shù)。

2.6統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。比較治療前后用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，重復(fù)測量設(shè)計采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1各組糖尿病大鼠血糖、體質(zhì)量、血胰島素的變化給藥后6周，與DM組和DM+NS組比較，實驗組大鼠空腹血糖明顯降低、體質(zhì)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與DM組和DM+NS組比較，實驗組大鼠血胰島素含量增加，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

3.2各組大鼠TG和HDL-C含量變化比較給藥后2周，與DM組和DM+NS組比較，實驗組大鼠TG明顯降低（P＜0.05）。與DM組和DM+NS組比較，實驗組HDL-C明顯升高，見表2。

3.3Westem blot法檢測PKB以及ICAM-1的表達(dá)情況給藥后2周，通過Westem blot檢測可見與DM組和DM+NS組比較，實驗組大鼠PKB的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與DM組和DM+NS組比較，實驗組大鼠ICAM-1的表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。見圖1。

表1　各組糖尿病大鼠血糖、體質(zhì)量、血胰島素的變化Tab.1　Changes of blood glucose，body weight and blood insulin of diabetic rats in each group

表2　各組大鼠TG和HDL-C含量變化比較Tab.2　Comparison of TG and HDL-C contents of rats in each group

圖1　PKB與ICAM-1的表達(dá)情況Fig.1　PKB and the expression of ICAM-1

3.4糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)觀察給藥后2周，對視網(wǎng)膜切片HE染色行超微結(jié)構(gòu)的檢查：DM組可見細(xì)胞水腫，核固縮、濃染，核膜內(nèi)陷，染色質(zhì)邊集，可見大部分或全部的嵴消失，凋亡小體出現(xiàn)，部分雙側(cè)膜融合。DM+NS組：可見細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)水腫，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張明顯，脫顆粒明顯。與DM組和DM+NS組比較，實驗組細(xì)胞水腫程度減輕，各種視網(wǎng)膜病變程度明顯減輕（P＜0.05），見圖2。

圖2　各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化Fig.2　Morphological changes of the retina of rats in each group

3.5TUNEL法檢測凋亡相關(guān)蛋白C-myc的凋亡指數(shù)TUNEL法結(jié)果可見，各組大鼠視網(wǎng)膜凋亡相關(guān)蛋白C-myc的表達(dá)變化比較，與DM組和DM+NS組比較，實驗組中凋亡相關(guān)蛋白C-myc明顯減少（P＜0.05）。表明糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織表達(dá)的C-myc可能參與了視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。C-myc凋亡指數(shù)的改變，可能與糖尿病視網(wǎng)膜病變密切關(guān)聯(lián)。各組大鼠不同時間點C-myc的表達(dá)變化比較，見表3。

表3　各組大鼠C-myc的凋亡指數(shù)比較Tab.3　Comparison of C-myc apoptotic index of rats in each group

4　討論

糖尿病作為一種復(fù)雜的代謝性疾病，常常會導(dǎo)致多系統(tǒng)、多臟器損害［10-12］。STZ誘導(dǎo)的大鼠糖尿病模型是目前公認(rèn)的經(jīng)典動物模型，此模型能夠誘導(dǎo)出與人類2型糖尿病有許多共同特征的大鼠糖尿病模型，該模型選取的SD大鼠來源豐富，易于飼養(yǎng)，實驗成本低，其視網(wǎng)膜血管與人類相似，可用于糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)研究［13-17］。本研究以經(jīng)典藥方葛根芩連湯為研究對象，采取STZ模型，觀察了葛根芩連湯對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的良好治療效果［18-20］。

糖尿病視網(wǎng)膜病變的病因較為復(fù)雜，目前為止尚缺乏有效的治療方法［21-22］。傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療糖尿病視網(wǎng)膜病歷史悠久，不良反應(yīng)小，溫和持久，且能很好的緩解并發(fā)癥的發(fā)生［23-24］。有研究報道稱葛根芩連湯有降低血糖及抗胰島素抵抗作用，方中黃芩具有清肺胃實熱、解血中糖毒作用，黃連具有清熱燥濕、泄火解毒、治消渴病的功效，葛根中含有的黃酮類、生物堿類等化合物等具有調(diào)節(jié)糖代謝、調(diào)節(jié)脂代謝、改善胰島素抵抗、改善氧化應(yīng)激等療效，甘草次酸、甘草黃酮抗氧化劑對胰島β細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用［25］。

另有研究發(fā)現(xiàn)［26-27］，葛根芩連湯能顯著降低2型糖尿病動物的TG、TC、低密度脂蛋白等的水平。在潘競鏘的研究中，探討了葛根芩連湯降低動物血糖的作用機制，研究結(jié)果證明了葛根芩連湯具有磺脲類藥物和雙胍類藥物的降糖作用［28］。宋艷敏等［29］的研究證明了葛根素具有夠保護(hù)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的作用。

本研究通過葛根芩連湯干預(yù)STZ模型視網(wǎng)膜病變，結(jié)果顯示，與DM組和DM+NS組比較，實驗組大鼠空腹血糖明顯降低。與DM組和DM+NS組比較，實驗組大鼠血胰島素含量增加。與DM組和DM+NS組比較，實驗組大鼠TG明顯降低而HDLC明顯升高。這些結(jié)果均證明葛根芩連湯可對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變發(fā)揮較好療效。通過Westem blot檢測得知與DM組和DM+NS組比較，實驗組大鼠PKB的表達(dá)明顯增加、ICAM-1的表達(dá)明顯下降，與DM組和DM+NS組比較，實驗組中凋亡相關(guān)蛋白C-myc明顯減少，因此推測葛根芩連湯可通過抑制炎癥因子以及凋亡相關(guān)蛋白C-myc的表達(dá)從而抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。光鏡下觀察到實驗組視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)病變明顯減輕，提示使用此方能減輕視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的損害，延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)程。

總之，葛根芩連湯能對大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變從多向性、多層面的發(fā)揮治療作用，其所具有的優(yōu)勢是不可比擬的。相信隨著對中藥復(fù)方研究的深入，葛根芩連湯將會以其良好的臨床療效，逐步被廣泛推廣應(yīng)用。但本研究僅做了初步的探索，還需要進(jìn)一步的探討研究來加以完善。

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（本文編輯：馬英，滕曉東）

Experimental study of Gegen Qinlian Tang on the impact of early retinopathy in diabetic rats

LIU Liang
（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China）

［Objective］To investigate the therapeutic effect of Gegen Qinlian Tang early stage of diabetic retinopathy in rats.［Methods］The 45 Wistar rats，streptozotocin（STZ）intraperitoneal injection，making diabetes were randomly divided into DM group，DM+NS group （saline injection group diabetes diabetic model）and the experimental group（DM+Gegen Qinlian group）.After modeling，DM group received no treatment，and the experimental group was given Gegen Qinlian 8.2 g/kg，and DM+NS group was injected with an equal volume of saline.Diabetic rats，fasting blood glucose，plasma insulin，body weight，triglyceride（TG）and high density lipoprotein（HDL-C）content were detected to observe Gegen Qinlian hypoglycemic lipid-lowering efficacy；by Western blot method retinal protein kinase B （protein kinaseB，PKB）and inflammation-related factors between a cell adhesion molecule 1（intercellular adhesion molecule1，ICAM-1）expression；HE staining used ultrastructure of rats in each group；with TUNEL assay of apoptosis-related protein C-myc in the apoptotic index.［Results］Compared with DM group and DM+NS，the experimental group was significantly lower fasting blood glucose，body weight increased significantly，statistically significant difference（P＜0.05）；the DM and DM+NS group，the experimental group of rats blood insulin content increased，the difference between groups was statistically significant（P＜0.05）；the DM and DM+NS group，the rats in the experimental group was significantly lower TG and HDL-C was significantly increased（P＜0.05）.By Western blot detection of visible and DM and DM+NS group，and PKB expression in rat experimental group increased significantly，and ICAM-1 expression was significantly decreased.The difference was statistically significant（P＜0.05）.HE staining was observed under light microscope ultrastructure groups: DM group pyknosis，stain，nuclear membrane retraction，chromatin margination，apoptotic bodies，changes in the experimental group was significantly reduced（P＜0.05）.The DM and DM+NS group，the experimental group of apoptosis-related protein C-myc decreased（P＜0.05）.［Conclusion］Gegen Qinlian Tang can improve fasting blood glucose，plasma insulin，and the change of body weight，with good blood glucose and lipids，by increasing the expression of PKB and suppress inflammation in diabetic rat retinopathy to reduce or delay the occurrence and development of diabetes.

Gegen Qinlian Tang；diabetes；rat；early retinopathy；PKB；ICAM-1

R774

A

1672-1519（2016）07-0425-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.07.11

2016-02-05）