陳建平，楊曙梅，丁　燁，王惠民，鞠少卿，叢　輝△

(1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇南通 226001；2.南通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，江蘇南通 226019)

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·論著·

免疫比濁法檢測血清游離輕鏈的方法學(xué)評價*

陳建平1，楊曙梅1，丁燁2，王惠民1，鞠少卿1，叢輝1△

(1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇南通 226001；2.南通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，江蘇南通 226019)

目的對Beckman Immage 800全自動特種蛋白分析儀檢測血清游離κ、λ輕鏈(sFLC)進行方法學(xué)評價。方法通過Beckman Immage 800定量測定sFLC，探討其精密度、正確度、分析測量范圍、干擾和攜帶污染率，同時對其參考區(qū)間進行驗證。結(jié)果κFLC低、高值批內(nèi)精密度的變異系數(shù)(CV)分別為7.84%、2.95%，批間精密度的CV分別為7.38%、5.57%；λFLC低、高值批內(nèi)精密度(CV)分別為4.59%、3.94%，批間精密度CV分別為3.97%、2.01%；測定κFLC、λFLC定值質(zhì)控血清與靶值的偏倚小于5%；κFLC、λFLC分析測量范圍分別為10.8～128.0 mg/L、10.1～121.0 mg/L時，a值在0.95～1.05，r2≥0.98；κFLC、λFLC攜帶污染率分別為0.411%、0.216%；干擾試驗結(jié)果顯示游離膽紅素≤342.0 μmol/L、結(jié)合膽紅素≤342.0 μmol/L、血紅蛋白≤5 g/L和乳糜≤2 400濁度時，對sFLC結(jié)果無明顯影響；40例健康體檢者中有1例κFLC測定結(jié)果超出廠家推薦的參考區(qū)間，40例λFLC檢測值均在廠家推薦的參考區(qū)間內(nèi)。結(jié)論Beckman Immage 800全自動特種蛋白分析儀檢測sFLC的主要分析性能符合質(zhì)量目標的要求，能夠為臨床提供科學(xué)、準確的診療依據(jù)。

全自動特種蛋白分析儀；方法學(xué)評價；血清游離輕鏈

血清游離輕鏈(sFLC)包含游離κ、λ輕鏈，是判斷患者體內(nèi)是否存在克隆性漿細胞的高度敏感指標。定量檢測sFLC以及計算游離κ/λ的比值有助于多發(fā)性骨髓瘤(MM)、原發(fā)性淀粉樣變(AL)、未定性單克隆丙種球蛋白病(MGUS)等疾病的診斷、療效判斷及預(yù)后評估[1]。血清κ、λ輕鏈和免疫固定電泳在一定程度上有助于MM的診斷，但均有一定的方法學(xué)局限性，如血清輕鏈測定的是血清中總輕鏈量，敏感性差；免疫固定電泳的敏感度也僅有150～500 mg/L，從而易致患者的漏診。2006年，國際骨髓瘤協(xié)作組(IMWG)將患者sFLC水平引入MM的評定標準中，作為完全緩解(sCR)的療效分類標準，確立了sFLC定量檢測在臨床應(yīng)用中的地位和價值[2]。近年來，sFLC的檢測得到了國內(nèi)越來越多臨床醫(yī)生的重視和患者的高度關(guān)注[3]。目前，我國臨床實驗室測定sFLC主要采用免疫比濁法，關(guān)于Beckman Immage 800全自動特種蛋白儀測定sFLC方法學(xué)評價的文獻較少見。本次試驗參考美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)的相關(guān)文件及文獻，探討了Beckman Immage 800散射比濁法檢測sFLC的方法學(xué)評價。

1　材料與方法

1.1一般資料選取2015年1～10月南通大學(xué)附屬醫(yī)院門診和病房多發(fā)性骨髓瘤確診患者40例及體檢中心健康體檢者血清40例。靜脈抽血5 mL，4 000 r/min離心10 min，分離血清備用。

1.2儀器與試劑美國Beckman Coulter Immage 800全自動特種蛋白分析儀；英國Binding Site公司FreeliteTM血清游離輕鏈檢測試劑盒(κFLC批號344785G，λFLC批號349269A)；FreeliteTMsFLC配套校準品(κFLC批號344965，λFLC批號347207)；FreeliteTMsFLC配套質(zhì)控品(κFLC批號351843，λFLC批號347208)；日本Sysmex A-Plus干擾試劑盒(批號ZS1001)。

1.3方法

1.3.1建立sFLC比濁法測定法根據(jù)FreeliteTMsFLC說明書設(shè)置儀器參數(shù)：標本量5 μL，Buffer 195 μL，稀釋倍數(shù)1∶10。6點校準，每個濃度校準品重復(fù)測定兩次。

1.3.3正確度評價參照NCCLS EP15-A[5]，按照檢測定值的參考物質(zhì)計算偏差進行驗證：測定高、低兩個水平質(zhì)控品，每天測定2次，連續(xù)測定5 d，計算10次檢測結(jié)果均值，將各自檢測結(jié)果與靶值進行對比，計算檢測值與靶值的相對偏倚(%)，計算公式：偏倚=(測定值-靶值)/靶值×100%。

1.3.4分析測量范圍評價參照NCCLS EP6-A[6]文件，分別選擇sFLC含量接近廠家線性范圍上限的新鮮血清標本1份作為高值濃度水平(H：κFLC 128.0 mg/L，λFLC 121.0 mg/L)，sFLC含量低的健康體檢者血清作為低值濃度水平(L:κFLC 10.8 mg/L，λFLC 10.1 mg/L)1份，按照5H、4H+L、3H+2L、2H+3L、H+4L、5L的關(guān)系分別配制6個濃度梯度，對各濃度水平進行sFLC測定，各濃度重復(fù)測定4次，對測定結(jié)果的均值和理論值進行線性回歸統(tǒng)計，計算回歸方程：Y=aX+b，進行分析測量范圍評價。a值應(yīng)在1±0.05范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(r2)≥0.950。

1.3.5攜帶污染率評價參考文獻[7]，分別選取高水平FLCs新鮮血清標本連續(xù)測定3次，測定值分別為H1、H2、H3；再分別選取低水平sFLC新鮮血清標本連續(xù)測定3次，測定值分別為L1、L2、L3，計算攜帶污染率。攜帶污染率=(L1-L3)/(H3-L3)×100%。攜帶污染率應(yīng)≤2.0%。

1.3.7參考區(qū)間驗證參照NCCLS C28-A2[9]文件選取2015年8月南通大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心健康體檢者40例。健康參考個體選擇標準：(1)男、女各20例，年齡20～60歲，無吸煙、飲酒，自覺健康者；(2)無急慢性感染、呼吸系統(tǒng)疾病、過敏性疾病、肝膽管疾病、血液性疾病、腎臟疾病、風(fēng)濕性疾病、血管病和高血壓；(3)近期未手術(shù)、輸血、大量失血和服用藥物；(4)無慢性理化損傷或接觸化學(xué)損傷。測定sFLC，將檢測結(jié)果與參考區(qū)間比較(廠家參考區(qū)間：κFLC 3.30～19.40 mg/L；λFLC 5.71～26.30 mg/L)。檢測結(jié)果若超出參考區(qū)間的數(shù)據(jù)不超過10%，則通過驗證，以判定廠家提供的生物參考區(qū)間有效。

表1　4種干擾物各管濃度表

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用Microsoft Excel 2003軟件對精密度試驗、特異性試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計及Origin75統(tǒng)計軟件對分析測量范圍數(shù)據(jù)進行回歸分析。

2　結(jié)　果

2.1sFLC精密度評價結(jié)果分別用低、高兩個濃度血清做批內(nèi)和批間精密度評價，κFLC低、高濃度血清批內(nèi)CV分別為7.84%、2.95%，批間CV分別為7.38%、5.58%；λFLC低、高濃度血清批內(nèi)CV分別為4.59%、3.94%，批間CV分別為4.00%、2.01%，見表2。

表2　sFLC批內(nèi)精密度

2.2sFLC正確度評價結(jié)果κ、λFLC正確度驗證結(jié)果見表3，κFLC相對偏倚分別為3.01%、-3.81%，λFLC相對偏倚分別為2.28%、-4.58%，結(jié)果均低于廠家說明書的偏倚值，正確度滿足要求。見表3。

表3　sFLC準確度評價試驗

2.3sFLC分析測量范圍評價結(jié)果分別測量sFLC 6個濃度混合血清，計算均值，將測定均值與理論預(yù)期值比較，偏倚均小于10%；同時將測定均值與理論值進行線性回歸分析，本系統(tǒng)κFLC測定范圍在10.8～128.0 mg/L，λFLC測定在10.1～121.0 mg/L呈線性。κFLC回歸方程及相關(guān)系數(shù)的平方為：Y=1.0441X-4.0789，r2=0.986；λFLC回歸方程及相關(guān)系數(shù)的平方為：Y=0.9887X+1.2471，r2=0.999，滿足判斷要求，散點圖見圖1、2。

圖1　κFLC線性回歸分析

圖2　λFLC線性回歸分析

2.4sFLC攜帶污染率評價κFLC的H1、H2、H3分別為117.0、118.0、119.0 mg/L；L1、L2、L3分別為9.52、8.76、9.07 mg/L，計算攜帶污染率為0.411%。λFLC的H1、H2、H3分別為119.0、118.0、114.0 mg/L；L1、L2、L3分別為21.9、22.6、21.7 mg/L，計算攜帶污染率為0.216%。FLCs攜帶污染率均小于2%。

2.5sFLC特異性評價BU≤342.0 μmol/L、BC≤342.0 μmol/L、Hb≤5 g/L、乳糜物≤2 400濁度時，對κ和λFLC的測定基本無影響，干擾值均在空白組1.96s范圍內(nèi)。

2.6sFLC參考區(qū)間驗證40例健康體檢者κFLC測定結(jié)果有1例觀察值為3.18 mg/L，在廠商提供的參考區(qū)間3.30～19.40 mg/L外；λFLC測定結(jié)果介于5.71～26.30 mg/L。在參考區(qū)間外的數(shù)據(jù)未超過10%，表明廠家提供的95%參考區(qū)間可以接受。

3　討　論

Immage 800全自動特種蛋白分析儀方法學(xué)原理為免疫比濁法，有著較高的靈敏度和特異性。為了保證臨床實驗室檢驗質(zhì)量，根據(jù)國家醫(yī)學(xué)實驗室認可(ISO15189)和美國病理學(xué)家協(xié)會(CAP)對臨床實驗室質(zhì)量管理的要求[10]和臨床實驗室認可的要求[11]，臨床實驗室在新的檢驗方法用于檢測常規(guī)患者標本、儀器重要維修或試劑更換生產(chǎn)廠家前必須對檢測系統(tǒng)的分析性能進行評價，確認檢測系統(tǒng)的分析性能符合臨床要求方可使用[12]。為了證實Immage 800全自動特種蛋白分析儀檢測sFLC分析性能的可靠性，本次試驗參考CLSI EP文件資料對Immage 800檢測sFLC進行初步的分析性能評價，評價了本法的精密度、分析測量范圍、攜帶污染率、特異性，同時還對sFLC參考區(qū)間進行了驗證。

臨床標本結(jié)果與真值間的偏離主要有不精密度、正確度、干擾。精密度是多次重復(fù)測量同一量時各測量值之間彼此符合的程度，表示測量過程中隨機誤差的大小。其是檢測系統(tǒng)主要的分析性能之一，是進行其他性能評價的基礎(chǔ)[13]。臨床檢測系統(tǒng)精密度的評價通常參考NCCLS EP5-A2文件評價方案，該方案是目前最具有統(tǒng)計效能的一種精密度評價方法。本次試驗結(jié)果顯示，κFLC低、高兩個水平批內(nèi)不精密度分別是7.84%和2.95%；批間不精密度分別是7.38%和5.58%。λFLC低、高兩個水平批內(nèi)不精密度分別是4.59%和3.94%；批間不精密度分別是4.00%和2.01%。結(jié)果表明本法檢測sFLC精密度性能高，達到CLIA′88允許誤差的1/3水平(允許不精密度<8.33%)。

在NCCLS EP9-A文件中，正確度驗證方法是使用臨床患者標本進行方法學(xué)比較和偏倚估計，這種方法需要對照，對于實驗室新開展的檢測項目來說存在一定的困難。因此，本次試驗在進行sFLC正確度評價時，參照了NCCLS EP15-A文件的評價方案，采取使用有定值的參考物質(zhì)來計算偏倚的方法來進行檢測系統(tǒng)的正確度評價。試驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)κ、λFLC檢測均值與質(zhì)控的相對偏倚均小于5.0%，偏倚水平低于廠家說明書的偏倚允許范圍，符合要求，說明本檢測系統(tǒng)對sFLC濃度檢測的正確度高。

分析測量范圍即定量檢測項目的線性范圍，是分析方法的一個重要技術(shù)指標，是判斷檢測系統(tǒng)測得的濃度與實際濃度是否呈線性的性能。分析測量范圍評價反映了整個檢測系統(tǒng)的輸出特性，有助于了解檢測結(jié)果的準確性和可靠性。NCCLS EP6-A文件要求對分析測量范圍評價時需要5～7個濃度，每個濃度至少測定2次。在本次試驗中選擇了6個濃度標本，每個標本檢測4次，對檢測系統(tǒng)進行分析測量范圍驗證。結(jié)果表明κFLC和λFLC均表現(xiàn)出較好的線性，a值和r2均滿足要求，符合臨床檢驗的要求。廠家說明書給予的κFLC線性范圍是6.0～180.0 mg/L、λFLC線性范圍是4.8～162.0 mg/L，本次試驗中由于κFLC和λFLC的高值標本一時無法獲得，因此κFLC和λFLC高值標本稍低于最高檢測值，還需要后期補充驗證。

攜帶污染是連續(xù)測量不同濃度標本間的相互影響，主要是高濃度標本對后續(xù)檢測標本的影響。影響標本攜帶污染率的因素主要是清洗劑的清洗能力、清洗劑用量、清洗次數(shù)、清洗溫度等。攜帶污染率是檢測結(jié)果準確的必要條件，是評價檢測系統(tǒng)的關(guān)鍵指標，攜帶污染率越低表明檢測結(jié)果越準確。試驗結(jié)果顯示κFLC、λFLC攜帶污染率分別是0.411%、0.216%，均小于判斷要求，表明檢測系統(tǒng)攜帶污染率低，能夠適應(yīng)實驗室常規(guī)臨床標本的檢測要求。

在EP7-A2文件中提供了兩種實驗方案進行干擾試驗評價：(1)干擾篩選；(2)利用患者標本作偏倚分析。由于第2種評價方法需要高特異性的比較方法，本實驗室難以滿足其要求。因此，本次試驗采用第1種方案，即將潛在干擾物添加到標本中來評價干擾性。將血紅蛋白、三酰甘油、膽紅素3種常見的物質(zhì)作為干擾源對sFLC檢測結(jié)果進行特異性分析。試驗結(jié)果表明膽紅素、血紅蛋白、三酰甘油對κFLC及λFLC的測定影響較小，表明該檢測系統(tǒng)檢測sFLC的抗黃疸、溶血、脂血的能力較強。臨床標本的質(zhì)量對免疫比濁法檢驗的干擾需要臨床檢驗者的重視，因此在臨床標本sFLC檢測結(jié)果報告時最好將反映溶血、脂血及黃疸程度的指數(shù)一并報告臨床醫(yī)生，使檢驗結(jié)果更嚴謹、可靠。

參考區(qū)間是臨床判斷健康與否的尺標，

合適的參考區(qū)間對疾病的預(yù)防、診斷、療效評價及預(yù)后有著重要的意義[14]。本次試驗中對廠家提供的sFLC參考區(qū)間進行了驗證。廠家提供的κFLC參考范圍是3.30～19.40 mg/L、λFLC參考范圍是5.71～26.30 mg/L。通過對40例健康體檢者進行sFLC檢測分析，結(jié)果表明廠商提供的sFLC參考區(qū)間適用于本地區(qū)、本實驗室使用。

本次研究結(jié)果表明，在Immage 800全自動特種蛋白分析儀上測定sFLC的方法精密度高，正確度高，線性良好，攜帶污染率低，抗干擾能力強。

綜上所述，Immage 800檢測sFLC的主要分析性能符合臨床質(zhì)量管理目標的要求，是一種簡便、快捷、準確、可靠的臨床檢測方法，能夠為臨床醫(yī)生在疾病的診療過程中提供可信的實驗室依據(jù)。

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Methodological evaluation on serum free light chains detected by immunoturbidimetry*

CHEN Jianping1,YANG Shumei1,DING Ye2,WANG Huimin1,JU Shaoqing1，CONG Hui1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001，China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine，SchoolofPublicHealth，NantongUniversity,Nantong,Jiangsu226019，China)

ObjectiveTo perform the methodological evaluation on Beckman Immage 800 automatic special protein analyzer for determining serum freeκ,λ light chains (sFLC).MethodsThe Beckman Immage800 automatic special protein analyzer was used to quantitatively detect sFLC values for investigating its precision and accuracy,analyzing its detecting range,interference and residual contamination rate,meanwhile verifying its reference intervals.ResultsThe low and high values of within-run precision coefficients of variation(CV) for κsFLC were 7.84% and 2.95% respectively;which of between-run precisionCVwere 7.38% and 5.57% respectively.The within-run precisionCVfor λFLC were 4.59% and 3.94% respectively,which of between-run precisionCVwere 3.97% and 2.01% respectively;bias for detecting the κFLC and λFLC fixed quality serum and the target values was less than 5%,when the analytical detection ranges of κFLC and λFLC were 10.8-128.0 mg/L and 10.1-121.0 mg/L,a value was 0.95-1.05，r2≥0.98;the carry-over rates of κFLC and λFLC were 0.411% and 0.216% respectively.The interference test results showed that when free hemoglobin≤342.0 μmol/L,conjugated bilirubin ≤342.0 μmol/L,hemoglobin≤5 g/L and chyle ≤2 400 turbidness,which had no influence on sFLC results;among 40 healthy subjects undergoing the physical examination,1 case of κFLC detection results exceeded the reference interval recommended by the manufacturer,while the λFLC detection values in these 40 cases were all within the reference interval recommended by the manufacturer.ConclusionThe main analytical performance of the Beckman Immage800 automatic special protein analyzer for detecting sFLC meets the requirements of quality objectives and can provides the scientific and precise evidence of diagnosis and treatment for clinic.

full automatic special protein analyzer；methodology evaluation；serum free light chains

2016-01-25修回日期：2016-05-04)

江蘇省衛(wèi)生廳項目(H201526)；江蘇省“六大人才高峰”基金項目(WS-066)。

陳建平，女，主管檢驗技師，從事臨床免疫檢驗工作?！?/p>

，E-mail:huicjs@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.004

A

1673-4130(2016)15-2058-03