王春蕾，蔣樹新，劉華良，馬永建*，阮　華，韋廣豐

(1.東南大學　公共衛(wèi)生學院，江蘇　南京　210009；2.江蘇省疾病預防控制中心，江蘇　南京　210009；3.江蘇輝豐農(nóng)化股份有限司，江蘇　鹽城　224100)

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在線固相萃取/高效液相色譜法檢測熏烤魚及熏烤肉制品中的多環(huán)芳烴

王春蕾1,2，蔣樹新1,2，劉華良2，馬永建1,2*，阮華3，韋廣豐3

(1.東南大學公共衛(wèi)生學院，江蘇南京210009；2.江蘇省疾病預防控制中心，江蘇南京210009；3.江蘇輝豐農(nóng)化股份有限司，江蘇鹽城224100)

基于在線凈化富集技術，建立了熏烤魚和熏烤肉制品中15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴的在線固相萃取/高效液相色譜-紫外/熒光(Online-SPE/HPLC-UV/FLD)檢測方法。對提取溶劑和流動相進行優(yōu)化，樣品采用乙腈-丙酮(6∶4)勻漿處理，超聲提取后，在線固相萃取柱ChromSpher Pi(80 mm×3 mm)凈化富集，反相C18PAH專用柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)分離，水、乙腈和異丙醇梯度洗脫，紫外和熒光檢測器檢測。結果表明，15種多環(huán)芳烴在相應的濃度范圍內(nèi)線性良好(r2>0.999)；檢出限為0.03～8.33 μg/kg；熏烤魚的回收率為67.4%～107.2%，相對標準偏差(RSD)為0.2%～7.7%；熏烤肉的回收率為71.8%～110.5%，RSD為0.8%～8.9%。經(jīng)FAPAS質控樣品驗證，所測化合物種類和濃度范圍均滿足要求。

在線固相萃取；多環(huán)芳烴；高效液相色譜；熏烤魚；熏烤肉

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一類含有兩個或兩個以上苯環(huán)結構的持久性有機污染物(Persistent organic pollutants，POPs)，部分PAHs具有遺傳毒性、致癌性或潛在致癌性，嚴重威脅人體健康，因此已被歐盟(EU)和美國環(huán)境保護署(EPA)列為優(yōu)先控制污染物，歐盟優(yōu)控PAHs比EPA優(yōu)控PAHs包含更多5～6環(huán)的毒性更大的重質PAHs[1-3]。環(huán)境污染和高溫處理的食品加工工藝會將PAHs引入食品。熏烤是最古老的食品加工工藝之一，距今已有千年歷史，因其有脫水 、殺菌和抗氧化的功能，最初是用來加強食物的保存[4-5]。熏烤魚和熏烤肉及其制品在熏烤過程中可產(chǎn)生吸引感官的活性物質(主要是酚類、有機酸和內(nèi)酯等)，帶來獨特的風味、色澤和芳香，因此深受消費者青睞[6]。但熏烤過程中木炭的不完全燃燒和有機物(如脂類、蛋白質和碳水化合物等)熱解會產(chǎn)生副產(chǎn)物——PAHs，而PAHs具有親脂性，易蓄積在脂肪組織內(nèi)[7-8]。鑒于熏烤魚和熏烤肉及其制品日益成為膳食中重要的組成部分，監(jiān)測此類食品中PAHs的含量顯得尤為重要。

1　實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

UltiMate 3000高效液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo公司)；高速勻漿機、渦旋振蕩器(德國IKA公司)；高速冷凍離心機、分析天平(德國Sartorius公司)；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2實驗條件

1.2.1提取稱取熏烤魚或熏烤肉樣品2.0 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入5 g無水硫酸鈉和10 mL乙腈-丙酮(6∶4)，勻漿處理10 min，超聲提取15 min后于5 000 r/min離心5 min，取上層清液，殘渣用10 mL乙腈-丙酮(6∶4)再提取1次，合并提取液，準確移取10 mL提取液于試管中，氮吹后用0.5 mL IPA復溶，10 000 r/min離心5 min后轉移至進樣瓶中，待測。

1.2.2色譜條件在線固相萃取柱ChromSpher Pi(80 mm×3 mm，7 μm，Agilent公司)，分析柱C18PAH專用柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters公司)，柱溫28 ℃，進樣盤溫度30 ℃，進樣量20 μL，萃取柱的流動相為水(溶劑A)、乙腈(溶劑B)和異丙醇(溶劑C)，具體洗脫程序見表1，前7 min為上樣萃取階段，7～30 min為轉移階段，30 min后是萃取柱的清洗平衡階段，待下次進樣，分別在7 min和30 min處進行六通閥的切換。分析柱的流動相為乙腈(溶劑B)和水(溶劑A)，采用梯度洗脫，具體洗脫程序見表1。

表1　萃取柱洗脫程序

2　結果與討論

2.1提取條件的優(yōu)化

檢測熏烤魚和肉類樣品中PAHs的難點在于樣品中PAHs含量低，且基質復雜，干擾嚴重，尤其是脂肪組分[16]。考察了勻漿對提取效果的影響，比較了不勻漿和勻漿后的回收率，結果表明：勻漿后的提取效率顯著增加。這是由于勻漿可以打碎機體組織，釋放組織內(nèi)部的PAHs。通過查閱文獻和相關國家標準[14,17-18]，比較了環(huán)己烷、正己烷-丙酮(1∶1)、正己烷-二氯甲烷(1∶1)、環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1)和乙腈-丙酮(6∶4) 5種溶劑的提取效率(見圖1)。結果表明，乙腈-丙酮(6∶4)的提取效果最佳，回收率為77.4%～128.6%，并且采用乙腈-丙酮勻漿后勻漿機轉頭上基本無殘留，而其余4種溶劑勻漿后轉頭上均有較多殘留，可能是這些溶劑回收率低的原因之一。同時比較了超聲提取次數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)提取2次的結果優(yōu)于提取1次。優(yōu)化的提取條件見“1.2.1”。

2.2色譜條件的優(yōu)化

在線萃取采用ChromSpher Pi柱，運用供體與受體結合的原理進行在線凈化，Waters公司的C18PAH專用柱進行分離。參考文獻[19]，用100% IPA小流速上樣，去除基質中殘留的脂肪酸和色素物質，上樣結束后切換六通閥，用ACN-H2O去除多余的IPA，過渡到分析柱的洗脫條件，以ACN-H2O梯度洗脫。采用小體積上樣，由于基質是熏烤魚或烤肉，經(jīng)簡單提取，復溶后的樣品中仍存在部分油脂成分，但不如油樣粘稠，可適當降低柱溫和進樣盤溫度，進樣盤溫度降為30 ℃，柱溫降為28 ℃，并增加一根預柱，以增加峰與峰的分離度，延長分析柱的壽命，同時優(yōu)化了洗脫梯度和流速。目前國際上較為普遍的說法是15+1種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴，增加的物質是苯并(c)芴(BCF)，本次研究發(fā)現(xiàn)BCF的最優(yōu)激發(fā)和發(fā)射波長較為普通，并且保留時間在六通閥切換前后，干擾較強，無法準確定量，故本研究未將其納為檢測對象。采用單通道FLD檢測14種熒光物質，分時間段切換波長，具體見表2。所得14種熒光PAHs的色譜圖見圖2。無熒光性的CPP采用UV檢測器進行檢測，波長設置為220 nm(見圖3)。

2.3方法學驗證

在優(yōu)化條件下，以濃度值為橫坐標，平均峰面積為縱坐標繪制標準曲線，對15種化合物標準溶液的線性范圍進行考察。結果顯示，除CPP的濃度范圍為50～1 000 ng/mL外，其余14種PAHs在1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)(r2)大于0.999。在實際熏烤樣品中進行3個水平加標回收實驗，平均相對標準偏差(RSD)和平均回收率見表3。熏烤魚的回收率為67.4%～107.2%，RSD為0.2%～7.7%；熏烤肉的回收率為71.8%～110.5%，RSD為0.8%～8.9%。實驗結果顯示，熏烤肉類的回收率普遍高于熏烤魚，有研究表明PAHs易擴散，會根據(jù)濃度梯度進入組織細胞內(nèi)部[16]，可能是熏烤魚組織細胞在勻漿過程中未被完全打碎導致回收率略低。根據(jù)3倍信噪比(S/N)以及10倍S/N分別確定各化合物的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ),CPP無熒光性，因此采用UV檢測器檢測。各化合物的LOD為0.03～8.33 μg/kg，LOQ為0.09～25.00 μg/kg(表3)。

表3　方法學驗證結果

(續(xù)表3)

2.4質控樣品的檢測

采用本方法檢測FAPAS(Food Analysis Performance Assessment Scheme)質控熏烤魚樣品(T0659QC)，可測得6種目標PAHs，測定結果均在可接受范圍內(nèi)，說明本方法具有良好的準確性，結果見表4。

表4T0659QC樣品的檢測結果

Table 4Results of quality control sample(T0659QC)w/(μg·kg-1)

*：the sum of BAA,CHR,BBF and BAP

2.5實際樣品檢測

采用本方法檢測南京市售6種熏烤魚和熏烤肉(S1～S6)中歐盟優(yōu)控15種PAHs的含量，結果見表5。實際樣品中檢出的BAP含量為 0.11～0.26 μg/kg，4種PAHs含量之和為0.74～1.05 μg /kg，含量較低，均滿足我國和歐盟的限量標準。其中CHR，SMC，BBF，BKF，BAP和BGP在所有樣品中均檢出。

表5樣品中15種PAHs的含量

Table 5PAHs contents in samples Table 5PAHs contents in samplesw/(μg·kg-1)

(續(xù)表5)

*no detected;**:the sum of BAA,CHR,BBF and BAP

3　結　論

本文建立了在線凈化富集技術檢測熏烤魚和熏烤肉中15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴的分析方法。通過優(yōu)化在線萃取和分析條件，實現(xiàn)了15種目標物的有效分離，簡化了實驗步驟，且方法重現(xiàn)性好，可以滿足我國和國際上對PAHs定量分析的要求。但實驗發(fā)現(xiàn)勻漿過程并不能保證將機體的組織細胞完全打碎，部分PAHs仍殘留在細胞內(nèi)，在今后的研究中將更深入地探討勻漿處理條件，或者嘗試新的勻漿技術。

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Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Smoked Fish and Smoked Meat by Online Solid-phase Extraction and High Performance Liquid Chromatography

WANG Chun-lei1,2，JIANG Shu-xin1,2，LIU Hua-liang2，MA Yong-jian1,2*，RUAN Hua3，WEI Guang-feng3

(1.School of Public Health，Southeast University，Nanjing210009，China;2.Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention，Nanjing210009，China;3.Jiangsu Huifeng Agrochemical Company Limited，Yancheng224100，China)

Based on on-line purification-enrichment technology，a novel method was developed for the determination of 15 polycyclic aromatic hydrocarbons in smoked fish and smoked meat by online solid-phase extraction and high performance liquid chromatography with ultraviolet/fluorescence detection(online-SPE/HPLC-UV/FL-D).Experimental parameters such as extraction solvent and mobile phase were optimized.The homogenized smoked samples were dissolved with acetonitrile-acetone(6∶4),and then extracted ultrasonically.The online purification-enrichment was performed on a solid-phase extraction ChromSpher Pi column(80 mm×3 mm),and the separation was carried out on a C18reversed-phase PAH column(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm) using ultraviolet detection at 220 nm and fluorescence detection.Isopropyl alcohol，acetonitrile and water were served as mobile phases by gradient elution.The results showed that good linearities for 15 polycyclic aromatic hydrocarbons existd in corresponding concentration ranges with correlation coefficients(r2) more than 0.999.The limits of detection(LODs) were between 0.03 μg/kg and 8.33 μg/kg.The recoveries of 15 components at three spiked levels in smoked fish samples were in the range of 67.4%-107.2% with relative standard deviations(RSD，n=6) of 0.2%-7.7%.The recoveries of 15 components at three spiked levels in smoked meat samples were in the range of 71.8%-110.5% with relative standard deviations(RSD，n=6) of 0.8%-8.9%.Verified by FAPAS quality control samples,the types and concentration ranges of analytes could meet the requirements.

online solid-phase extraction(online SPE)；polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)；high performance liquid chromatography(HPLC);smoked fish;smoked meat

2015-12-02；

2015-12-29

江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃資助項目(SJLX_0110)；江蘇省“十二·五”科教興衛(wèi)工程(ZX201109)

馬永建，碩士，主任技師，研究方向：分析化學，Tel：18915999468，E-mail：mayongjian@jscdc.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.005

O657.72;O625.15

A

1004-4957(2016)07-0805-06