汪東劍 余維濤 張曉云 劉冬萍 邱華琴 彭慧瓊

335000鷹潭，中國(guó)人民解放軍第一八四醫(yī)院輸血科

高載量標(biāo)本HBV-DNA定量檢測(cè)時(shí)稀釋液的選擇與評(píng)價(jià)

汪東劍 余維濤 張曉云 劉冬萍 邱華琴 彭慧瓊

335000鷹潭，中國(guó)人民解放軍第一八四醫(yī)院輸血科

目的 對(duì)高載量標(biāo)本HBV-DNA稀釋檢測(cè)時(shí)稀釋液進(jìn)行選擇和評(píng)價(jià)，期望篩選出較為理想適用于臨床的稀釋液。方法 以陰性質(zhì)控品作為標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，陰性血清、生理鹽水、蒸餾水作為候選稀釋液，分別對(duì)定值標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為2.00×109IU/m1）進(jìn)行10倍、100倍的稀釋檢測(cè)，比較使用候選稀釋液與標(biāo)準(zhǔn)稀釋液的檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)進(jìn)行偏差分析。結(jié)果 在10倍稀釋時(shí)，使用蒸餾水稀釋與標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋，其檢測(cè)結(jié)果間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.04，P＞0.05），偏差小于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的總允許誤差；使用陰性血清、蒸餾水時(shí)檢測(cè)結(jié)果高于標(biāo)準(zhǔn)稀釋（P＜0.05），分別有16.67%和20.00%的偏差超過(guò)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的總允許誤差。在100倍稀釋時(shí)，使用待選稀釋液，其檢測(cè)結(jié)果均高于使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且以蒸餾水作為稀釋液時(shí)的檢測(cè)結(jié)果與以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋時(shí)的檢測(cè)結(jié)果呈良好的線性關(guān)系，其公式為Y=0.963X+0.267；使用不同稀釋液時(shí)偏差均小于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的總允許誤差，以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液偏差最小，其次為蒸餾水、生理鹽水、陰性血清（P＜0.05）。結(jié)論 在10倍稀釋時(shí)，最適稀釋液為陰性質(zhì)控品與蒸餾水；在100倍稀釋時(shí)，最適稀釋液為陰性質(zhì)控品，其次為蒸餾水、生理鹽水、陰性血清，以蒸餾水作為稀釋液時(shí)，可通過(guò)公式Y(jié)=0.963X+0.267對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行校正，確保結(jié)果更為精確。

【主題詞】 稀釋液；乙型肝炎病毒；DNA；檢測(cè)

Fund program：Nanjing Mi1itary Region Medica1 Scientific Research Fund Project（MS078）

HBV-DNA定量檢測(cè)已廣被泛運(yùn)用于臨床及科研［1-2］，隨著研究的深入，高病毒載量患者的診斷、治療日益受到重視［3-7］。當(dāng)前國(guó)內(nèi)多數(shù)廠家HBVDNA定量檢測(cè)試劑盒的線性范圍在1.00×102～5.00×108IU/m1之間，然而有報(bào)道顯示國(guó)產(chǎn)試劑對(duì)于病毒載量高于107IU/m1的標(biāo)本，其檢測(cè)結(jié)果在準(zhǔn)確性方面不如進(jìn)口試劑，建議進(jìn)行稀釋檢測(cè)［8］。同時(shí)對(duì)于超過(guò)線性范圍的標(biāo)本，為精確定量，廠家也建議采用陰性質(zhì)控品對(duì)待檢標(biāo)本進(jìn)行稀釋，然后以測(cè)定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)作為最終報(bào)告結(jié)果。稀釋檢測(cè)是臨床檢驗(yàn)中常用的方法，報(bào)道顯示稀釋檢測(cè)后常需進(jìn)行校正才能得出與實(shí)際值相符的結(jié)果，而稀釋液的選擇也直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性［9-11］，但目前尚無(wú)高載量標(biāo)本HBV-DNA檢測(cè)時(shí)稀釋液的選擇與評(píng)價(jià)的相關(guān)報(bào)道。研究前期運(yùn)用在乳汁中摻入高HBV-DNA載量血清建立乳汁HBV-DNA模型時(shí)，曾用生理鹽水作為稀釋液，以期制備梯度定值標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)稀釋檢測(cè)結(jié)果高于預(yù)期理論結(jié)果［12］，提示稀釋液選擇不當(dāng)會(huì)對(duì)HBV-DNA檢測(cè)造成影響。為此我們以試劑盒提供的陰性質(zhì)控品為標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，以三種常用于臨床的陰性血清、生理鹽水、蒸餾水為候選稀釋液，通過(guò)對(duì)定值高載量HBV-DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋檢測(cè)，以期發(fā)現(xiàn)HBV-DNA稀釋檢測(cè)中的規(guī)律，為工作中稀釋液的選擇和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1定值標(biāo)準(zhǔn)品：由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供（滅活的HBV陽(yáng)性血清），濃度為2.00× 109IU/m1。

1.1.2稀釋液：標(biāo)準(zhǔn)稀釋液的陰性質(zhì)控品，由中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司提供。候選稀釋液：①自制陰性血清，收集2014年1月至9月經(jīng)HBV血清標(biāo)志物及HBV-DNA檢測(cè)均為陰性的無(wú)溶血、黃疸、脂血血清50份，充分混勻紫外線照射2 h無(wú)害化處理后-20℃保存?zhèn)溆茫虎谏睇}水，晨欣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；③無(wú)菌蒸餾水，四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1樣品稀釋：將標(biāo)準(zhǔn)血清分成30份，每份分別使用陰性質(zhì)控品、自制陰性血清、生理鹽水、蒸餾水稀釋10倍及100倍制備成對(duì)應(yīng)的稀釋樣品待檢。

1.2.2稀釋檢測(cè)：嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書提供的操作步驟對(duì)稀釋樣品進(jìn)行HBV-DNA定量檢測(cè)；對(duì)標(biāo)準(zhǔn)稀釋樣品同時(shí)使用兩個(gè)廠家提供的試劑進(jìn)行平行檢測(cè)。

1.3主要儀器和試劑 HBV-DNA核酸定量檢測(cè)使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的DA-7600核酸擴(kuò)增儀；稀釋檢測(cè)試劑使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的HBV-DNA核酸定量檢測(cè)試劑盒；平行檢測(cè)試劑分別使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司與上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)的HBV-DNA核酸定量檢測(cè)試劑盒。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有檢測(cè)結(jié)果QDNA均進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)GQ，采用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。偏差分析以《CNAS-CL36醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》規(guī)定的（靶值±0.4對(duì)數(shù)值）為允許總誤差（TEa），當(dāng)偏差小于此 TEa時(shí)可接受，否則不可接受。

2 結(jié)果

2.1稀釋檢測(cè)結(jié)果 各稀釋檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。在10倍稀釋時(shí)，稀釋理論結(jié)果為8.30，標(biāo)準(zhǔn)稀釋、陰性血清稀釋、生理鹽水稀釋、蒸餾水稀釋檢測(cè)結(jié)果分別為8.37±0.12、8.58±0.10、8.53±0.14、8.38± 0.09，使用試劑2檢測(cè)結(jié)果分別為：陰性血清稀釋、生理鹽水稀釋檢測(cè)結(jié)果均高于標(biāo)準(zhǔn)血清稀釋檢測(cè)（P＜0.05），蒸餾水稀釋檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)稀釋檢測(cè)結(jié)果基本一致，t=2.04，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在100倍稀釋時(shí)，稀釋理論結(jié)果為7.30，標(biāo)準(zhǔn)稀釋、陰性血清稀釋、生理鹽水稀釋、蒸餾水稀釋檢測(cè)結(jié)果分別為7.34±0.09、7.49±0.10、7.44± 0.08、7.35±0.09，候選稀釋液稀釋檢測(cè)結(jié)果均高于標(biāo)準(zhǔn)稀釋檢測(cè)結(jié)果（P＜0.05）。

2.2候選稀釋液與標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋檢測(cè)結(jié)果的曲線擬合 我們以標(biāo)準(zhǔn)稀釋檢測(cè)結(jié)果為Y值，候選稀釋檢測(cè)結(jié)果為X值分別在10倍稀釋、100倍稀釋時(shí)進(jìn)行曲線擬合，擬合方程均為線性（Y=aX+b），以

表1　不同稀釋度檢測(cè)Tab.1 Detection of different di1utions

表2　曲線擬合參數(shù)Tab.2 Parameters of curve fitting

a介于1.00±0.05和r2≥0.95作為是否符合線性關(guān)系的判斷標(biāo)準(zhǔn)，具體參數(shù)見(jiàn)表2。結(jié)果顯示僅在100倍稀釋時(shí)，蒸餾水稀釋檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)稀釋檢測(cè)呈良好線性關(guān)系（曲線擬合見(jiàn)圖1）。

圖1　蒸餾水稀釋檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)稀釋檢測(cè)結(jié)果的曲線擬合Fig.1 The curve fitting of disti11ed water di1uted detection and standard di1uted detection

2.3偏差分析 各稀釋檢測(cè)結(jié)果與理論結(jié)果間的偏差分析結(jié)果見(jiàn)表 1。在10倍稀釋時(shí)，靶值為8.30，允許總誤差為 ±0.40（對(duì)應(yīng)偏差為± 4.82%），當(dāng)選用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液和蒸餾水作為稀釋液時(shí)，偏差均小于TEa；選用陰性血清、生理鹽水作為稀釋液時(shí)，分別有 5例（占 16.67%）、6例（20.00%）偏差大于TEa。在100倍稀釋檢測(cè)時(shí)，靶值為7.30，允許總誤差為 ±0.40（對(duì)應(yīng)偏差為 ± 5.48%），所有稀釋檢測(cè)偏差均小于TEa，標(biāo)準(zhǔn)稀釋偏差最小，其次為蒸餾水稀釋、生理鹽水稀釋、陰性血清稀釋。

2.4平行評(píng)估 使用廠家2提供的檢測(cè)試劑對(duì)使用廠家1陰性質(zhì)控品稀釋的樣品進(jìn)行平行檢測(cè)，與使用廠家1提供檢測(cè)試劑的檢測(cè)結(jié)果比較見(jiàn)表3。

3 討論

HBV-DNA載量升高被公認(rèn)為反映HBV復(fù)制最敏感的檢測(cè)指標(biāo)，研究顯示血清HBV-DNA載量不僅與肝臟損害相關(guān)，而且是臨床藥物的選擇的重要依據(jù)［13-14］。在臨床工作中，常出現(xiàn)高載量的HBVDNA標(biāo)本，這類標(biāo)本往往接近或者超過(guò)檢測(cè)試劑盒的線性范圍如何精確定量高載量患者HBV-DNA水平在指導(dǎo)臨床用藥及預(yù)后判斷方面具有重要意義。廠家對(duì)于超過(guò)線性范圍的高載量標(biāo)本建議采用陰性質(zhì)控品將標(biāo)本稀釋到線性范圍后再檢測(cè)，然后將測(cè)定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即得出高載量標(biāo)本的實(shí)際濃度。由于國(guó)內(nèi)PCR測(cè)定主要依靠手工進(jìn)行核酸提取，模板制備、儀器設(shè)備、擴(kuò)增反應(yīng)體系、數(shù)據(jù)處理等均會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。對(duì)于高載量血清的稀釋檢測(cè)，一方面隨著操作步驟的增加，使得操作因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響增大；另一方面由于稀釋液有可能改變標(biāo)本的物理和化學(xué)性狀，可能對(duì)核酸的提取或擴(kuò)增造成影響，最終影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。廠家建議采用陰性質(zhì)控品作為稀釋液，其主要成分為HBV陰性血清，但由于試劑盒自帶陰性質(zhì)控品量少，除用于日常質(zhì)控外，難以滿足臨床稀釋檢測(cè)的需要，因而我們使用自制陰性血清、生理鹽水和蒸餾水作為稀釋液對(duì)超過(guò)線性范圍的定值血清進(jìn)行稀釋檢測(cè)，試圖尋找適合的稀釋液用于臨床工作中高載量標(biāo)本HBV-DNA的稀釋檢測(cè)。

表3　不同試劑檢測(cè)結(jié)果比較Tab.3 Detection resu1ts using different reagents

在10倍稀釋時(shí)，比較使用候選稀釋液與標(biāo)準(zhǔn)稀釋液進(jìn)行稀釋檢測(cè)的結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)采用陰性血清、生理鹽水作為稀釋液時(shí)，其結(jié)果均高于使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液進(jìn)行稀釋時(shí)的檢測(cè)結(jié)果，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而使用蒸餾水與使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液進(jìn)行稀釋檢測(cè)的結(jié)果基本一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =2.04，P＞0.05）。在偏差分析中，我們以《CNASCL36醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》規(guī)定的（靶值±0.4對(duì)數(shù)值）為允許總誤差（TEa），當(dāng)偏差小于此TEa時(shí)可接受，否則不可接受作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。我們以定值標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后的理論值作為參照，計(jì)算此時(shí)使用不同稀釋液進(jìn)行稀釋檢測(cè)的偏差，發(fā)現(xiàn)使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液和蒸餾水作為稀釋液，檢測(cè)偏差均小于TEa，滿足標(biāo)準(zhǔn)要求，且兩者偏差比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.00，P＞ 0.05）；而使用陰性血清、生理鹽水稀釋時(shí)，雖然偏差均值符合標(biāo)準(zhǔn)要求，但分別有16.67%和20.00%的偏差大于TEa，不滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。

在100倍稀釋時(shí)，使用三種候選稀釋液，檢測(cè)結(jié)果均高于標(biāo)準(zhǔn)稀釋檢測(cè)時(shí)的結(jié)果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。我們嘗試通過(guò)曲線擬合尋找使用候選稀釋液與使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液時(shí)檢測(cè)結(jié)果間的函數(shù)關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅在100倍稀釋時(shí)，蒸餾水稀釋與標(biāo)準(zhǔn)稀釋結(jié)果符合線性要求，其公式為Y=0.963X+ 0.267，r2=0.977（Y=標(biāo)準(zhǔn)稀釋檢測(cè)結(jié)果，X=蒸餾水稀釋檢測(cè)結(jié)果）。此時(shí)的偏差分析顯示，使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液與三種候選稀釋液稀釋，其偏差均小于TEa，滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。使用不同稀釋液，其偏差之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液偏差最小，蒸餾水次之，陰性血清偏差最大。

由于陰性質(zhì)控品、定值標(biāo)準(zhǔn)品與HBV陽(yáng)性定量參考品為同一廠家提供，廠家在引入機(jī)制上的質(zhì)量控制措施確保其在基本成分上的一致性，使得使用陰性質(zhì)控品對(duì)定值標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋后，對(duì)核酸提取體系及模板擴(kuò)增體系的影響最小，檢測(cè)結(jié)果更為接近稀釋樣品的真值。當(dāng)使用另一廠家提供的試劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)稀釋的樣品進(jìn)行檢測(cè)與使用原廠家試劑檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，兩者在檢測(cè)結(jié)果及與理論值之間偏差方面的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明使用陰性質(zhì)控品進(jìn)行稀釋檢測(cè)效果最好與使用同一廠家試劑有關(guān)，在稀釋檢測(cè)時(shí)如所使用的稀釋液（陰性質(zhì)控品）與試劑為不同廠家提供，易造成稀釋檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。雖然自制陰性血清（經(jīng)篩選排除攜帶HBV-DNA的可能）主要成分與臨床待檢標(biāo)本基本一致，理論上對(duì)HBV-DNA檢測(cè)不會(huì)造成大的影響。但通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)在10倍與100倍稀釋檢測(cè)時(shí)，使用自制陰性血清作為稀釋液，檢測(cè)結(jié)果高于使用陰性質(zhì)控品時(shí)，且偏差最大，這或許是自制陰性血清與陰性質(zhì)控品在蛋白、糖類、脂類及各種酶的含量上與陰性質(zhì)控品的差異導(dǎo)致其核酸提取、模板擴(kuò)增效率不同而導(dǎo)致。在使用生理鹽水作為稀釋液時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果同樣高于使用陰性質(zhì)控品時(shí)，這可能與生理鹽水干影響核酸提取試劑（主要成分為NaOH、Tris-HCL、TritonX-100、NP-40、Che1ex-100、EDTA）的離子濃度和緩沖體系，從而導(dǎo)致結(jié)果間的差異。

綜合以上分析，我們認(rèn)為對(duì)于高載量HBV-DNA標(biāo)本的稀釋檢測(cè)，試劑盒自帶的陰性質(zhì)控品是最佳稀釋液，建議廠家能夠?yàn)榕R床提供標(biāo)準(zhǔn)化的專用稀釋液，工作中應(yīng)需要注意的是稀釋液與檢測(cè)試劑應(yīng)為同一廠家提供。當(dāng)試劑盒自帶陰性質(zhì)控品不能滿足臨床稀釋檢測(cè)需要時(shí)，在10倍稀釋時(shí)可以使用蒸餾水作為替代稀釋液進(jìn)行稀釋檢測(cè)；而陰性血清與生理鹽水各有16.67%和20.00%的偏差大于TEa，不滿足標(biāo)準(zhǔn)要求，故在此時(shí)不適合作為替代稀釋液使用。在100倍稀釋時(shí)，雖然蒸餾水、陰性血清、生理鹽水作為稀釋液進(jìn)行稀釋檢測(cè)均能滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，從檢測(cè)結(jié)果與偏差的比較來(lái)看，蒸餾水仍是最佳替代稀釋液，此時(shí)，將蒸餾水稀釋檢測(cè)的結(jié)果按照公式Y(jié)=0.963X+0.267（Y=報(bào)告結(jié)果，X=檢測(cè)結(jié)果）進(jìn)行校正，可得到與使用陰性質(zhì)控品稀釋檢測(cè)相一致的結(jié)果，使得結(jié)果更為精確。

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Select and evaluate the diluents for quantitative detection of HBV DNA of high loads sample

WangDongjian，Yu Weitao，Zhang Xiaoyun，Liu Dongping，Qiu Huaqin，Peng Huiqiong No.184 Hospital of People's Liberation Army，Yingtan 335000，China

Yu Weitao，Email：dearwdj@163.com

Objective To se1ect and eva1uate the di1uents for quantitative detection of HBV DNA of high 1oads samp1e，hope to find the most app1icab1e di1uents which cou1d be used in c1inica1 test.Methods The standard substance（2.00×109IU/m1）was 10 and 100 times di1uted by different di1uents，compare the resu1t of test，and the bias was ana1ysis taking negative qua1ity contro1 as standard di1uents，negative serum，physio1ogica1 sa1ine，and disti11ed water as candidate di1uents.Results When 10 times di1uted，there was no statistica11y difference between the standard di1uents and disti11ed water as di1uents（t=2.04，P＞0.05），the bias were 1ess than the TEa regu1ated by professiona1 standard.When used negative serum and physio1ogica1 sa1ine as di1uents，the resu1ts were higher than that of standard di1uents（P＜0.05），and the ratio of the bias higher than the TEa was 16.67%and 20.00%.When 100 times di1uted，the resu1ts of candidate di1uents were higher than that of standard di1uents.In this time，the resu1t of disti11ed water di1uted detection presented a good 1inear re1ationship with the resu1t of standard di1uted detection，the formu1a was Y=0.963X+0.267（Y=resu1t of standard di1uted detection，X=resu1t of disti11ed water di1uted detection）.A11 the bias were 1ess than the TEa，the sequence of bias sort by ascending counts were negative qua1ity contro1，disti11ed water，physio1ogica1 sa1ine and negative serum.Conclusions The most app1icab1e di1uents were negative qua1ity contro1 and disti11ed water with 10 times di1ution.When 100 times di1uted was used，the most app1icab1e di1uents was negative qua1ity contro1，then was disti11ed water，physio1ogica1 sa1ine and negative serum.If using the disti11ed water to di1ute，we cou1d corrected the resu1t by the formu1a Y= 0.963X+0.267 to ensure the resu1t to be more exact1y.

Di1uents；Hepatitis B；DNA；Detection

余維濤，Emai1：dearwdj@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.028

南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金課題（MS078）

2016-01-06）