蘇秋東 郭敏卓 邱豐 賈志遠 盧學(xué)新 孟慶玲 田瑞光 高燕 畢勝利 伊瑤

102206中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所肝炎室（蘇秋東、邱豐、賈志遠、盧學(xué)新、孟慶玲、田瑞光、高燕、畢勝利、伊瑤）；100026北京出入境檢驗檢疫局保健中心（郭敏卓）

自發(fā)生物素化風(fēng)疹病毒重組診斷抗原的制備

蘇秋東 郭敏卓 邱豐 賈志遠 盧學(xué)新 孟慶玲 田瑞光 高燕 畢勝利 伊瑤

102206中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所肝炎室（蘇秋東、邱豐、賈志遠、盧學(xué)新、孟慶玲、田瑞光、高燕、畢勝利、伊瑤）；100026北京出入境檢驗檢疫局保健中心（郭敏卓）

目的 獲取原核表達過程中自發(fā)生物素化的風(fēng)疹病毒（Rube11a Virus，RV）重組抗原E1（RV-E1），并初步評價其抗原性。方法 將2×BirA酶底物（BSP）插入到RV-E1抗原優(yōu)勢表位區(qū)域aa 148-295的羧基端，硫氧還蛋白（Thioredoxin，TRX）插入到RV-E1的氨基端，密碼子優(yōu)化后全基因合成；在大腸埃希進行表達，并利用親和層析和離子交換層析純化獲取生物素化的RV-E1抗原；利用Western B1otting技術(shù)對目的蛋白進行鑒定，并建立風(fēng)疹病毒IgM抗體檢測方法，初步評價此方法對陰陽血清樣本的鑒別能力。結(jié)果 獲取高度均質(zhì)的生物素化的可溶性RV-E1抗原，WB實驗表明目的蛋白不但可以被RV-E1抗原和TRX抗原單克隆抗體識別，而且可以被標記HRP的鏈霉親和素所識別。分別對50份風(fēng)疹病毒感染陽性血清、陰性血清和健康人血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)一致性優(yōu)異。結(jié)論 RV-E1診斷抗原攜帶BSP，可以在大腸埃希菌表達過程中自發(fā)共價結(jié)合生物素分子，并可以作為新型診斷抗原應(yīng)用于生物素-親和素ELISA血清學(xué)檢測中。

【主題詞】 BirA酶底物；風(fēng)疹病毒E1抗原；原核表達；生物素化抗原

生物素-蛋白連接酶（BirA酶）是由大腸埃希菌組成性基因BirA編碼的一個雙功能蛋白，它可以通過識別蛋白質(zhì)序列的特異位點對目的蛋白進行生物素化。作為一種關(guān)鍵代謝酶，BirA酶可以催化生物素共價偶聯(lián)到乙酰輔酶A羧化酶生物素羧基載體蛋白（BCCP）賴氨酸殘基的ε-氨基上，這個反應(yīng)通過一種酶聯(lián)腺苷酸（bio-5'-AMP）的?；罨瘷C制推動［1］。只要目的蛋白的氨基或羧基端攜帶生物素化的肽底物序列（BSP）基因，使其在富含BirA酶的大腸埃希菌中進行融合表達，就能產(chǎn)生共價偶聯(lián)生物素分子的目的蛋白［2-4］。

D.Beckett等［5］確定了 BirA酶催化生物素化反應(yīng)的最小底物序列為GLNDIFEAQKIEW H，并且證實其生物素化程度與自然底物BSP相近。本研究就是利用這段肽序列能被BirA酶特異識別的特性，將其排布在RV-E1診斷抗原的羧基端，使其在大腸埃希菌中表達出生物素化的RV-E1診斷抗原，并依托生物素-親和素系統(tǒng)建立風(fēng)疹病毒感染IgM抗體診斷ELISA方法，有效地避免了因為酶偶聯(lián)目的蛋白引起抗原效價降低以及提高了診斷靈敏度。

風(fēng)疹病毒（Rube11a virus）屬于披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬，成年人群中風(fēng)疹病毒感染率一般在80%～90%，一般為輕微的、自限型疾病，但妊娠期前三個月感染將會導(dǎo)致胎兒損傷，嬰兒出生后伴隨著先天性風(fēng)疹綜合癥畸形。風(fēng)疹病毒的三個結(jié)構(gòu)蛋白（核心衣殼蛋白C、兩個膜糖蛋白E1和E2）均可以引發(fā)抗體應(yīng)答，但只有E1蛋白為免疫顯性的［6］。已鑒定出E1糖蛋白的幾個表位，如aa 245-285、aa 213-239、aa 214-240。Bosma等［4］提出 E1蛋白的aa195-296包含了血凝素和中和抗原決定簇，并對比分析這個區(qū)域在氨基酸水平上高度保守。免疫沉淀和免疫印跡技術(shù)已經(jīng)證實，大部分抗RV抗體應(yīng)答主要由E1蛋白誘發(fā)，血凝素活性和病毒中和活性都歸于E1蛋白的 aa 208-239、aa 213-239、aa 214-240［7-9］。三個另外的血凝素和中和表位被認為在E1蛋白的aa245-285［10］。伊瑤［11］將RV-E1 aa 148-295區(qū)域與硫氧還蛋白（TRX）融合表達，以此抗原建立血清學(xué)檢測方法檢測200份來自我國廣西省的未知血清樣本發(fā)現(xiàn)陽性率為93%，與文獻報道的我國其他地區(qū)風(fēng)疹病毒抗原陽性率基本一致。但長期實驗發(fā)現(xiàn)［12］，此蛋白經(jīng)過HRP偶聯(lián)后極易失活或抗原效價降低，因此本研究希望通過偶聯(lián)鏈霉親和素來避開偶聯(lián)診斷抗原，并利用生物素-親和素系統(tǒng)提高診斷的靈敏度。

本研究選用的RV-E1抗原片段為aa 148-295，將其羧基端添加2×BSP，并且保留TRX前綴，并在TRX氨基端添加His標簽，進而構(gòu)建可以應(yīng)用親和層析的自發(fā)生物素化的RV-E1診斷抗原。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑 E.coli BL21（DE3）為科室現(xiàn)存，限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI以及T4 DNA連接酶購自日本TaKaRa公司，pET43.1a載體購自美國Novagen公司，Che1ating Sepharose Fast F1ow和DEAE Sepharose Fast F1ow層析介質(zhì)購自美國GE公司，兔anti-Thioredoxin po1yc1ona1 antibody，鼠抗anti-Rube11avirusE1monoc1ona1antibody以 及Streptavidin-HRP均購自Abcam公司。風(fēng)疹病毒感染急性期血清50份、陰性血清50份均來源于臨床和實驗室確診人群，健康人群血清50份來源于全國乙肝流行病調(diào)查人群。

1.2基因合成 按圖1所示排布氨基酸序列，并根據(jù)大腸埃希菌偏好密碼子表進行基因優(yōu)化，并在5'端引入NdeI酶切位點，3'端引入XhoI酶切位點，TRX與抗原表位之間引入NcoI酶切位點，抗原表位與2×BSP之間引入HindIII酶切位點，XhoI酶切位點前引入“TAA”終止密碼子，交由日本TaKaRa公司合成，基因片段大小為954 bp，命名為H32。

1.3表達質(zhì)粒的構(gòu)建 基因片段H32人工合成后存于pMD-19T載體上，用限制性內(nèi)切酶 NdeI和XhoI將目的片段酶切下來（注意：pMD-19T載體固有的XhoI酶切位點，選擇大小為954 bp的片段進行回收），連接到相同酶切處理的pET43.1a載體上，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞。次日挑取單克隆菌落進行小量表達，提取陽性克隆質(zhì)粒后進行測序和雙酶切鑒定。

1.4目的蛋白的表達和純化 將新鮮轉(zhuǎn)化H32表達質(zhì)粒的BL21（DE3）菌液接種（1∶1000）于含氨芐霉素（50 μg/m1）的LB培養(yǎng)基（10 g/1蛋白胨，5 g/1酵母提取液，10 g/1 NaC1）中，32℃振蕩培養(yǎng)16 h后等倍擴菌。37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h后將溫度調(diào)至37℃，IPTG終濃度0.8 mmo1/L誘導(dǎo)3 h后離心收菌（3，000 g，10 min，4℃）。普通裂解液（10 mmo1/L Tris-HC1，0.5%Triton X-100，pH 8.0）重懸菌體沉淀后超聲破碎，離心（174，000 g，10 min，4℃）收集上清。上清中加入終濃度為500 mmo1/L的NaC1后上樣于用基液I（10 mmo1/L Tris-HC1，pH 8.0）平衡的Che1ating Sepharose Fast F1ow層析介質(zhì)中。待上樣完畢，用 0 mmo1/L、30 mmo1/L、60 mmo1/L、300 mmo1/L咪唑（溶于基液I中）進行梯度洗脫，并收集相應(yīng)洗脫液。分別取樣SDS-PAGE觀察目的蛋白的含量以及分布情況，將目的蛋白含量最高，純度最好的洗脫液于基液I中進行徹底透析備用。DEAE Sepharose Fast F1ow層析介質(zhì)用基液I平衡后將透析液上樣，待上樣完畢，用0 mmo1/L、100 mmo1/L、200 mmo1/L、400 mmo1/L NaC1（溶于基液I中）進行梯度洗脫并收集相應(yīng)洗脫液。分別取樣SDS-PAGE觀察目的蛋白的含量以及分布情況。將目的蛋白含量最高，純度最好的洗脫液于PBS中徹底透析后，加入終體積為20%甘油，于-20℃保存。

1.5目的蛋白的鑒定 利用Western B1ot技術(shù)對H32抗原性進行初步鑒定。將最終純化的H32上樣13.5%SDS-PAGE進行電泳，恒流40 mA，45 min后進行半干轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜（NC）（恒壓15 V，30 min）上。封閉液（含5%脫脂奶粉的PBST）處理NC膜（過夜，4℃），次日分別加入封閉液稀釋的Rabbit anti-Thioredoxin po1yc1ona1 antibody，mouse anti-Rube11avirusE1monoc1ona1antibody以及Streptavidin-HRP（1∶500）作為捕獲抗體，常溫孵育1 h后用PBST洗膜5次。檢測抗體分別為封閉液稀釋的兔源，鼠源二抗-HRP（1∶5000），常溫孵育1 h 后PBST洗膜5次，最后DAB顯色，清水終止顯色。

1.6目的蛋白診斷效能的評價 利用H32診斷抗原來建立風(fēng)疹病毒血清IgM抗體診斷ELISA試劑盒，并對臨床和實驗室確診的血清樣本進行檢測，評價試劑盒對陰陽性血清標本的鑒別能力。簡單而言，碳酸鹽包被緩沖液稀釋抗μ-二抗后封閉液封閉非特異性位點；加入檢測血清（1∶10稀釋），置37℃孵育1 h，然后洗滌；加入H32蛋白（1∶1000稀釋），置37℃孵育1 h，然后洗滌；加入Streptavidin-HRP（1 ∶2000稀釋），置37℃孵育1 h，然后洗滌；加入A、B液顯色，用酶標儀在450 nm和630 nm下測定各孔吸光度值（A值）。

2 結(jié)果

2.1目的蛋白的構(gòu)建與表達純化H32的構(gòu)建 如圖1.A，目的蛋白的氨基端帶有His標簽，緊跟著是硫氧還蛋白前綴，然后是RV-E1，后綴為BSP二倍體，間隔中添加了必要的限制性酶切位點，方便以后進行表達質(zhì)粒的改造。雙酶切處理（NdeI和XhoI）pET43.1a載體和H32全基因合成片段獲取帶有相同粘性末端的載體（約5500 bp）和片段（約954 bp）（圖2.B），經(jīng)過連接轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞后提取質(zhì)粒，測序和雙酶切鑒定結(jié)果（圖1.C）顯示目的片段已經(jīng)成功插入表達質(zhì)粒中，并將正確質(zhì)粒命名為H32質(zhì)粒。

A H32構(gòu)建示意圖；B雙酶切處理獲取載體（泳道1）和片段（泳道2）；C H32表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定（泳道3 NdeI-XhoI）圖1　H32表達質(zhì)粒的構(gòu)建A Schematic diagram of H32 construction；B Doub1e-enzyme dea1ing with vector（1ane 1）and fragment（1ane 2）；C Restriction endonuc1ease ana1ysis of the expression p1asmid（1ane 3，NdeI?XhoI）Fig.1 The construction of H32 expression p1asmids

1.陰性對照；2-9.8個陽性單克隆菌落；10.全菌；11.沉淀；12.上清；13.穿柱；14.60 mmo1/L咪唑洗脫液；15.300 mmo1/L咪唑洗脫液；16.200 mmo1/L NaC1洗脫液圖2　H32蛋白小量表達（A），親和純化（B）及陰離子交換純化結(jié)果（C）Lane 1，negative contro1；1ane 2-9，expression of 8 sing1e-co1onies；1ane 10，tota1 bacteria1 proteins after sonication；1ane 11，so1ub1e fraction of the homogenate；1ane 13，f1ow-through；1ane 14，e1utes washed with 60 mmo1/L imidazo1e；1ane 15，e1utes washed with 300 mmo1/L imidazo1e；1ane 16，e1utes washed with 200 mmo1/L NaC1Fig.2 The prokaryotic expression（A）and purification of H32 protein by affinity（B）and DEAE chromatography（C）

挑取8個新鮮轉(zhuǎn)化H32質(zhì)粒的BL21（DE3）單克隆菌落培養(yǎng)適當時間后進行誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE電泳結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，對比對照組，在約40 kDa處有明顯表達條帶（圖2.A），而實際的目的蛋白大小約為35 kDa。經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn)目的蛋白中大量堿性氨基酸的存在，讓目的蛋白大小在電泳圖上表現(xiàn)為偏大，因此40 kDa目的條帶處即為H32蛋白，表明H32蛋白可以在大腸埃希菌中有效表達。大量表達后發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要存在于超聲菌體沉淀重懸液的上清中（圖2.B），目的蛋白含量達到36.17%。將上清液進行處理后利用His親和層析進行純化，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要存在于300 mmo1/L咪唑洗脫液中（圖2.B），并且目的蛋白含量達到了87.21%，濃度為2.2 mg/m1。300 mmo1/L咪唑洗脫液經(jīng)過完全透析后，上DEAE陰離子交換層析柱，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要分布于200 mmo1/L NaC1洗脫液中，并且目的蛋白的含量達到了95.31%，濃度為2.1 mg/m1。最后將200 mmo1/L NaC1洗脫液在PBS中進行完全透析，加入終濃度為20%的甘油后-20℃保存。

2.2目的蛋白的鑒定 根據(jù)目的蛋白中包含硫氧還蛋白、RV-E1表位以及 BirA酶底物等特征，對H32蛋白的抗原性進行初步鑒定。Western B1ot結(jié)果顯示，利用針對RV-E1抗原表位的單克隆抗體作為捕獲抗體，在NC膜上相應(yīng)位置可以出現(xiàn)目的條帶（圖3.A）；直接利用生物素配體鏈霉親和素偶聯(lián)HRP作為捕獲抗體和檢測抗體，NC膜上相應(yīng)位置也可以出現(xiàn)目的條帶（圖3.B）；利用針對硫氧還蛋白抗原表位的單克隆抗體作為捕獲抗體，在NC膜上相應(yīng)位置同樣可以出現(xiàn)目的條帶。表明了H32蛋白包含了硫氧還蛋白、RV-E1抗原表位、以及共價結(jié)合了生物素的BSP。

A捕獲抗體為mouse anti-Rube11a virus E1 monoc1ona1 antibody，檢測抗體為鼠源二抗-HRP；B捕獲抗體和檢測抗體為Streptavidin-HRP；C捕獲抗體為Rabbit anti-Thioredoxin po1yc1ona1 antibody，檢測抗體為兔源二抗-HRP圖3　H32的Western B1otting分析A Mouse anti-Rube11a virus E1 monoc1ona1 antibody as capture antibody；mouse anti-IgG-HRP as detection antibody；B Streptavidin-HRP as capture and detection antibody；C Rabbit anti-Thioredoxin po1yc1ona1 antibody as capture antibody；rabbit anti-IgG-HRP as detection antibodyFig.3 Western B1otting ana1ysis of H32 protein

2.3目的蛋白診斷效能的評價 利用H32蛋白作為診斷抗原、生物素-親和素系統(tǒng)為依托建立的風(fēng)疹病毒IgM抗體檢測ELISA試劑盒，分別對50份陽性血清、陰性血清和健康人群血清樣本進行檢測。從圖4可以看出，陽性血清樣本與陰性血清樣本、健康人群血清樣本A值分布明顯不同（P＜0.01），而陰性血清樣本與健康人群血清樣本A值分布無明顯區(qū)別（P＞0.05）。可以得出，新型風(fēng)疹病毒IgM抗體診斷試劑盒可以很好地鑒別陰陽性血清樣本。

圖4　H32抗原診斷效果評價Fig.4 The eva1uation of the diagnostic effect of H32

3 討論

生物素-親和素系統(tǒng)是一種生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。生物素廣泛分布于動植物組織中?；罨纳锼乜乖诘鞍踪|(zhì)交聯(lián)劑的介導(dǎo)下，可以與幾乎所有已知的生物大分子偶聯(lián)，包括蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂類等。本研究為確保原核表達體系中充足的生物素分子，添加了生物素入表達體系，確保每個新表達的目的蛋白分子都偶聯(lián)了充足的生物素。親和素亦稱抗生物素蛋白、軟白素，是從軟白蛋白中提取的一種由4個相同亞基組成的堿性糖蛋白。生物素與親和素在作用是目前已知強度最高的非共價鍵作用，結(jié)合穩(wěn)定性好專一性強。本實驗中ELISA檢測方法將鏈霉親和素-HRP偶聯(lián)物與RV-E1-親和素組成檢測復(fù)合物，依托生物素-親和素系統(tǒng)建立而成。此方法有效避免了由于HRP偶聯(lián)診斷抗原帶來的抗原效價降低或失活，偶聯(lián)反應(yīng)只涉及鏈霉親和素，有效提高了針對不同病毒的檢測方法的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。構(gòu)建中（圖1.A）包含連續(xù)重復(fù)BSP序列目的是確保BirA酶的準確定位識別，原核表達體系中生物素分子的添加是增加目的蛋白的生物素化程度，WB實驗（圖3.B）以及ELISA檢測實驗證實了生物素化RV-E1的穩(wěn)定性以及此生物素-親和素系統(tǒng)在ELISA檢測中的實用性。

硫氧還蛋白作為融合蛋白前綴有效提高目的蛋白在原核表達系統(tǒng)中表達量的同時（圖2.B），也在一定程度上增強了目的蛋白的可溶性表達。目前尚未研究證明是否生物素化反應(yīng)與原核系統(tǒng)中蛋白表達過程同時發(fā)生，在這種情況下目的蛋白的可溶性對于生物素化反應(yīng)是至關(guān)重要的。本研究所制備的生物素-RV-E1診斷抗原是可溶性的，避免了由于包涵體的形成破壞了生物素化反應(yīng)的發(fā)生。下一步研究將集中于生物素化反應(yīng)的空間和時間問題。另外ELISA構(gòu)建中，下一步研究將集中于進行診斷抗原與鏈酶親和素-HRP的配比實驗，即酶結(jié)合物的制備方案，這樣可以使檢測工作更加快捷省時。

我們通過在RV-E1抗原氨基端添加BirA酶最小底物連續(xù)重復(fù)序列，讓其在富含BirA酶的原核表達細胞中進行表達，成功獲取了自發(fā)生物素化的診斷抗原，并將其應(yīng)用于風(fēng)疹病毒感染早起診斷，證實了此生物素-親和素系統(tǒng)在ELISA檢測技術(shù)中的可用性，很好地解決了風(fēng)疹病毒抗原在偶聯(lián)HRP過程中造成的抗原失活或抗原效價降低，并且為其他病原體檢測方法的建立提供了一條廣譜技術(shù)路線。

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The preparation of recombinant Rubella virus E1 diagnostic antigen biotinylated spontaneously

SuQiudong，Guo Minzhuo，Qiu Feng，Jia Zhiyuan，Lu Xuexin，Meng Qingling，Tian Ruiguang，Gao Yan，Bi Shengli，Yi Yao National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China（Su QD，Qiu F，Jia ZY，Lu XX，Meng QL，Tian RG，Gao Y，Bi SL，Yi Y）Inspection and Quarantine Technical Centre of Beijing Entry?exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China（Guo MZ）

Yi Yao，Email：yyao112@163.com

ObjectiveTo prepare recombinant Rube11a virus E1（RV-E1）biotiny1ated spontaneous1y and eva1uate its antigenicity pre1iminari1y.Methods With 2×BSP sequence in the C-termina1 and thioredoxin（TRX）in the N-termina1，aa 148-295 of RV-E1 was expressed in Escherichia coli （E.coli）and purified by affinity and anion exchange chromatography；using biotiny1ated RV-E1，we constructed and eva1uated a nove1 ear1y diagnostic ELISA for Rube11a virus based on biotin-avidin system. Results The so1ub1e biotiny1ated RV-E1 antigen with high homogeneity was obtained；the target protein cou1d bind with monoc1ona1 antibodies for RV-E1 and TRX antigens justified by WB ana1ysis，and streptavidin-HRP conjugate by ELISA ana1ysis；by testing 50 positive and negative sera of Rube11a virus infection and 50 hea1thy peop1e serum，the nove1 ELISA disp1ayed the exce11ent consistency.Conclusions The recombinant RV-E1 carrying BSP cou1d cova1ent1y bind biotin mo1ecu1es spontaneous1y in E.coli，which，as a nove1 diagnostic antigen，cou1d be app1ied for sero1ogica1 detection of Rube11a virus ear1y infection based on biotin-avidin system.

BirA enzyme substrate（BSP）；Rube11a Virus E1 antigen（RV-E1）；prokaryotic expression；biotiny1ated antigen

伊瑤，Emai1：yyao112@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.031

2015-08-08）