安貴峰　王明月

【摘要】 目的 探討骨礦化蛋白LMP-3促進(jìn)骨形成及骨修復(fù)重建的分子機(jī)制。方法 通過腺病毒LMP-3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞， RT-PCR法檢測LMP-3、BMP-2、OSX表達(dá)變化， 檢測相關(guān)因子表達(dá)情況。結(jié)果 腺病毒LMP-3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞， 發(fā)現(xiàn)BMP-2 mRNA、OSX mRNA的表達(dá)增高， 促進(jìn)骨形成。結(jié)論 LMP-3作用機(jī)制是通過上調(diào)BMP、OSX等骨誘導(dǎo)因子的基因表達(dá)， 促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟， 從而促進(jìn)骨形成， LMP在骨形成研究方面具有一定潛力。

【關(guān)鍵詞】 LMP-3， 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；表達(dá)情況

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.22.207

LMP作為一種新發(fā)現(xiàn)的骨礦化蛋白， 為骨組織工程及骨科重建提供新的途徑。研究者應(yīng)用腺病毒LMP-3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞， 檢測BMP-2 mRNA、OSX mRNA的表達(dá)情況， 探討骨礦化蛋白LMP-3促進(jìn)骨形成的可能機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 主要試劑：PCR引物（上海生物）；兔抗大鼠LMP-3抗體（Santa Cruz） ；二抗羊抗鼠FITC標(biāo)記IgG（中杉金橋）；胰酶（GIBCO）；RT-PCR試劑盒（Takara）；胎牛血清（HYCLONE）；DMEM（HYCLONE）；引物（上海生工）；質(zhì)粒抽提試劑；MSC 誘導(dǎo)藥物（Sigma）；腺病毒LMP-3表達(dá)載體前期自行構(gòu)建。主要儀器：超凈工作臺（蘇凈）；恒溫CO2孵箱（Hera Cell ）；倒置顯微鏡（日本 Olympus）；熒光顯微鏡（Olympus）；PCR儀（Bio-Rad）；垂直電泳儀（Bio-Rad）；轉(zhuǎn)印電泳儀（Amersham）；可調(diào)溫?fù)u床（哈爾濱東聯(lián)）；臺式低溫離心機(jī)（Eppendorf公司）；酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃）。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 取3周齡SD大鼠， 處死， 取股骨和脛骨， 注入PBS， 離心管收集， 250×g， 離心10 min， 加入100 g/L 高糖DMEM 10 ml。接種于2 個25 cm2 培養(yǎng)瓶中， 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48 h換液， 10 d 后細(xì)胞80%匯合， 胰蛋白酶消化傳代， 繼續(xù)培養(yǎng)， 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1. 2. 2 實(shí)驗(yàn)組感染復(fù)數(shù)（MOI=100）；對照組：未加病毒轉(zhuǎn)染作為陰性對照組， LacZ 轉(zhuǎn)染組作為陽性對照。

1. 2. 3 轉(zhuǎn)染過程 將第3 代MSC 傳代與12 個6 孔板中（5×104 cells /孔）， 加入病毒液， 輕搖1 min， 繼續(xù)培養(yǎng)， 12 h 后換液， 2 d后更換新鮮培養(yǎng)基， 5 d后更換新鮮培養(yǎng)基， 換液并留取檢測。8 d后更換培養(yǎng)液， 12 d后再次換液并留取檢測。

1. 2. 4 RT-PCR檢測LMP-3、BMP-2、OSX在MSC 中的表達(dá)情況 總RNA的提取， 實(shí)驗(yàn)分組A Ad-LMP-3組B Ad-LacZ組C陰性對照組。細(xì)胞裂解， 離心并棄上清液， 溶解RNA后進(jìn)行RNA的定量及保存， 測量光密度值并計算濃度。首先合成第一鏈cDNA， 并以第一鏈cDNA為模版繼續(xù)PCR擴(kuò)增， 反轉(zhuǎn)錄操作按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作， 30個循環(huán)；以β-actin為內(nèi)參照；LMP-3引物序列如下：Forward： 5-GCCTCGAGGAAGATG CAC CCATGT CCTC-3；Reverse： 5-GCGAATTCCTACATC CTGTAGTTCTTGTTTC -3。瓊脂糖凝膠電泳檢測， 取實(shí)驗(yàn)組及對照組PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測， 電泳結(jié)束后取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行染色并進(jìn)行灰度掃描， 檢測信號強(qiáng)度依據(jù)電泳條帶面積及灰度強(qiáng)度進(jìn)行比較， 檢測LMP-3、BMP-2、OSX和β-actin灰度比值表示LMP-3、BMP-2 mRNA、OSX mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果

腺病毒LMP-3載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞后， 可見長多角形細(xì)胞生長， 增殖旺盛。進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR法檢測LMP-3 mRNA、BMP-2 mRNA、OSX mRNA的表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示， 序貫轉(zhuǎn)染Ad-LMP-3組存在特異性條帶， 大小1200 bp， 表達(dá)的濃度顯著高于對照組。序貫轉(zhuǎn)染Ad-LMP-3組在456 bp

的位置存在特異性條帶， 表明BMP-2 mRNA表達(dá)增高， 表達(dá)的濃度高于對照組。Ad-LMP-3組特異性條帶， 大小488 bp， 顯示 OSX mRNA表達(dá)較高， 對照組未見特異性條帶， 表明無OSX mRNA表達(dá)。研究結(jié)果表明腺病毒LMP-3載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞， LMP-3表達(dá)增高， 表明轉(zhuǎn)染成功， 轉(zhuǎn)染組BMP-2 mRNA、OSX mRNA的表達(dá)增高表明LMP-3促進(jìn)了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中BMP-2、OSX表達(dá)， 從而促進(jìn)了骨形成。

3 討論

LIM礦化蛋白是新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞內(nèi)非分泌蛋白， 具有骨生成誘導(dǎo)的作用， 能夠正性調(diào)節(jié)骨形成誘導(dǎo)， 在骨礦化過程中促進(jìn)骨結(jié)節(jié)的形成。LIM礦化蛋白LIM礦化蛋白已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3種亞型， 具有成骨作用包括LIM礦化蛋白-1和LIM礦化蛋白-3 [1]。LIM礦化蛋白能夠促進(jìn)骨形成的作用， 可能是再骨形成細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的， 并通過下游細(xì)胞調(diào)節(jié)因子發(fā)揮骨形成作用， 但其確切促進(jìn)骨形成分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究證明 [2]。

研究者成功應(yīng)用腺病毒LMP-3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞， 并檢測LMP-3轉(zhuǎn)染后各組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中相關(guān)目的基因mRNA表達(dá)情況， 研究發(fā)現(xiàn)BMP-2 mRNA、OSX mRNA的表達(dá)增高。骨礦化蛋白LMP-3是通過上調(diào)BMP、OSX骨誘導(dǎo)因子的基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)LMP-3的促進(jìn)骨形成作用， 促進(jìn)骨鈣化結(jié)節(jié)形成， 在骨形成及骨礦化過程中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果表明 LMP-3是OSX的上游調(diào)節(jié)因子， 通過上調(diào)BMP-2、OSX表達(dá)， 通過細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟， 促進(jìn)骨鈣化結(jié)節(jié)形成。LMP-3通過細(xì)胞內(nèi)調(diào)控及信號傳導(dǎo)， 不受成骨前體細(xì)胞表面受體數(shù)量和活性的限制， 不受細(xì)胞外因子作用濃度及數(shù)量限制， 在促進(jìn)骨形成作用更強(qiáng)， 可能同時促進(jìn)BMP-4， BMP-6等其他細(xì)胞因子分泌， 激聯(lián)促進(jìn)骨形成， 作用時間更加持久， 作用強(qiáng)度更強(qiáng)， 受細(xì)胞外因子影響更小。通過對LIM礦化蛋白的促進(jìn)骨形成進(jìn)一步分子機(jī)制研究， 以及進(jìn)一步進(jìn)行基因敲除及實(shí)驗(yàn)動物的體內(nèi)成骨研究， 對進(jìn)一步探索其在骨形成、骨缺損及脊柱融合等方面的作用奠定基礎(chǔ)， 對骨礦化蛋白LMP-3促進(jìn)骨形成的作用研究及進(jìn)一步臨床應(yīng)用具有重要意義。

本研究表明， LMP通過作用骨誘導(dǎo)因子BMP-2、OSX共同通過細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路促進(jìn)成骨， 促進(jìn)骨鈣化結(jié)節(jié)形成， 在骨形成過程中具有重要作用， 其促進(jìn)骨形成的作用更強(qiáng)， 但仍需要進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究來闡明確切生物學(xué)機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1] Minamide A， Boden SD， Viggeswarapu M， et al. Mechanism of bone formation with gene transfer of the cDNA encoding for the intracellular protein LMP-1. J Bone Joint Surg Am， 2003， 85-A（6）：1030-1039.

[2] Pola E， Gao W， Zhou Y， et al. Efficient bone formation by gene transfer of human LIM mineralization protein-3. Gene Ther， 2004， 11（8）：683.

[收稿日期：2016-03-09]