張?jiān)柒?，梅玲玲，張俊彥，占　利，陳建才，陳鴻鵠，張　政，楊　勇

?

O3∶K6血清型副溶血性弧菌三重PCR檢測(cè)方法的建立

張?jiān)柒?，梅玲玲，張俊彥，占利，陳建才，陳鴻鵠，張政，楊勇

目的建立副溶血性弧菌O3∶K6血清型三重PCR檢測(cè)方法。方法基于副溶血性弧菌種特異性基因toxR, O3血清群特異性基因vp0209，K6血清型特異性基因vp0230，建立O3∶K6血清型副溶血性弧菌三重PCR檢測(cè)方法。對(duì)該方法的檢測(cè)特異性和靈敏度進(jìn)行分析。結(jié)果與結(jié)論該方法對(duì)O3∶K6血清型副溶血性弧菌具有很好的檢測(cè)特異性，靈敏度可以達(dá)到102CFU/PCR反應(yīng)體系。

副溶血性弧菌；O3∶K6血清型；三重PCR

副溶血性弧菌為革蘭氏陰性桿菌或稍彎曲弧菌，主要存在于近海的海水、海底沉積物和魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)等海產(chǎn)品中。自1950年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，該菌已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)因食用污染海產(chǎn)品而導(dǎo)致食物中毒的最主要的致病菌[1-2]。感染患者有腹瀉、腹痛、惡心、發(fā)燒等典型胃腸炎和食物中毒癥狀[3]。在我國(guó)沿海地區(qū)，副溶血性弧菌引起的食源性疾病暴發(fā)在全部食源性疾病暴發(fā)中已占首位[4]。

副溶血性弧菌屬于典型的多血清型致病菌，1996年在印度爆發(fā)了大規(guī)模副溶血性弧菌感染引發(fā)的流行病事件，并且迅速傳播到了亞洲、南美洲、北美洲、非洲和歐洲的多個(gè)國(guó)家，波及上萬(wàn)民眾。其中50%的臨床分離株屬于O3∶K6 血清型[5-6]。在全球傳播過(guò)程中，O3∶K6 血清型快速進(jìn)化出20多種衍生血清型(包括O4∶K68, O1∶K25,O1∶KUT等)。此后的研究發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌的某些血清型在臨床和環(huán)境分離株中都存在，而某些血清型目前發(fā)現(xiàn)只存在于環(huán)境分離株中，說(shuō)明某些血清型菌株與人類(lèi)疾病的相關(guān)性更強(qiáng)[7]，在我國(guó)的副溶血性弧菌臨床分離株中，O3∶K6和O4∶K8血清型菌株占據(jù)主導(dǎo)地位。目前，副溶血性弧菌的血清學(xué)分型方法是使用O-抗原和K-抗原的特異性抗血清和菌體進(jìn)行玻片凝集反應(yīng)，但存在交叉凝集反應(yīng)，菌株血清型難以判斷；檢測(cè)O血清群時(shí)，需通過(guò)高溫高壓去除胞外莢膜，過(guò)程繁瑣耗時(shí)；某些分離菌株經(jīng)過(guò)多次莢膜處理仍不能正常凝集，因此無(wú)法判斷其O血清群；臨床分離株中常有K抗原生長(zhǎng)不良的現(xiàn)象，也會(huì)導(dǎo)致無(wú)法凝集分型等問(wèn)題。在本文中，我們建立了O3∶K6血清型的三重PCR檢測(cè)方法。該方法不需要莢膜處理過(guò)程；基于檢測(cè)對(duì)象為核酸，可以避免因K抗原生長(zhǎng)不良而導(dǎo)致的K抗原無(wú)法檢出的問(wèn)題，是玻片凝集檢測(cè)法的有效補(bǔ)充。

1　材　料

1.1菌株本文中所使用的標(biāo)準(zhǔn)菌株：EscherichiacoliATCC25922、PseudomonasaeruginosaATCC27853、StaphylococcusaureusATCC25923、ListeriamonocytogenesCMCC54006、VibriovulnificusATCC27526、Salmonellaenteritidis ATCC50041，ShigellaflexneriATCC12022、BacilluscereusATCC11778。不同血清型的副溶血性弧菌分離菌株V.parahemolyticuszj12W297(O1∶K20)、V.parahemolyticuszj12W269(O1∶K25)、V.parahemolyticuszj12W211(O1∶K26)、V.parahemolyticuszj12W239(O1∶K32)、V.parahemolyticuszj11W202(O1∶K38)、V.parahemolyticuszj12W238(O2∶K3)、V.parahemolyticuszj12W210(O2∶K28)、V.parahemolyticuszj12Y73(O3∶K5)、V.parahemolyticuszj12W06(O3∶K6)、V.parahemolyticuszj13Y174(O3∶K29)、V.parahemolyticuszj13W113(O3∶K33)、V.parahemolyticuszj12W68(O3∶K54)、V.parahemolyticuszj12W176(O3∶K56)、V.parahemolyticuszj12Y74(O4∶K8)、V.parahemolyticuszj12W219(O4∶K34)、V.parahemolyticuszj13W14(O4∶K42)、V.parahemolyticuszj12Y6(O4∶K68)、V.parahemolyticuszj13W118(O5∶K17)、V.parahemolyticuszj12W107(O5∶K30)、V.parahemolyticuszj12W134(O6∶K46)、V.parahemolyticuszj13W16(O7∶KUT)、V.parahemolyticuszj12W225(O8∶KUT)、V.parahemolyticuszj11W211(O9∶KUT)、V.parahemolyticuszj13W27(O10∶K24)、V.parahemolyticuszj12W155(O11∶KUT)均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

2　方　法

2.1DNA提取和多重PCRDNA模板使用熱裂解方法提取。多重PCR擴(kuò)增引物：vp-0209 F：GCATCAACCCCATTTCAACTT，vp-0209 R：TTCCATACTTGGGTTGAGTTTTC；vp-toxR F: GTCTTCTGACGCAATCGTTG，vp-toxR R: ATACGAGTGGTTGCTGTCATG；vp-0230 F： TCCTGTTGTGATAAAGTTGGCATT，vp-0230 R: CCGAATCAAGAACTAACCCACA。引物委托上海生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增使用TaKaRa TaqTM(TaKaRa，China)體系：Taq 酶 0.625U，10 × PCR緩沖液 2.5 μL， MgCl2溶液1.5 mmol/L，d NTP混合液各0.2 mmol/L，上下游引物各0.4 μmol/L，DNA模板2 μL，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為： 95 ℃，2 min； 95 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，1 min；30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物使用1%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，使用Bio-Rad ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)進(jìn)行圖像分析。根據(jù)電泳條帶判斷結(jié)果，若觀察到3個(gè)目的條帶(vp0209: 240 bp、toxR: 368 bp、 vp0230：623 bp)，則待測(cè)樣品為O3∶K6血清型副溶血性弧菌，若觀察到vp0209、toxR 兩個(gè)基因擴(kuò)增條帶，則待測(cè)樣品為O3血清群副溶血性弧菌，若觀察到toxR單個(gè)條帶，則待測(cè)樣品為未知血清型副溶血性弧菌，若無(wú)任何條帶則不是副溶血性弧菌。

2.2檢測(cè)特異性分析選擇大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、創(chuàng)傷弧菌、沙門(mén)氏菌，志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，不同血清型副溶血性弧菌菌株進(jìn)行三重PCR方法檢測(cè)特異性分析，上述菌株信息見(jiàn)材料和方法1部分。

2.3檢測(cè)靈敏度分析副溶血性弧菌zj2012W6菌株(O3∶K6)接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，取適量菌重懸于生理鹽水中制成菌懸液，使用平板澆注法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，將菌懸液分別稀釋至105、104、103、102、10CFU/ PCR反應(yīng)體系。分別進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，確定該多重PCR檢測(cè)方法的靈敏度。

2.4多重PCR對(duì)副溶血性弧菌食源性和臨床分離菌株的檢測(cè)使用該多重PCR檢測(cè)方法對(duì)2011-2013年浙江省各地收集的食源性和臨床分離的50株O3∶K6血清型副溶血性弧菌菌株和50株非O3∶K6血清型副溶血性弧菌菌株進(jìn)行檢測(cè)。

3　結(jié)　果

3.1vp0209、vp0230基因特異性分析vp0209、vp0230在副溶血性弧菌中均為糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因，在以不同血清型副溶血性弧菌DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增過(guò)程中，vp0209、vp0230基因分別表現(xiàn)出O3、K6血清型特異性(圖1)。

A: vp0209 gene; B: vp0230 gene; M: 100 bp Ladder; lines 1-25: V.parahemolyticus zj12W297(O1∶K20), V.parahemolyticus zj12W269(O1∶K25), V.parahemolyticus zj12W211(O1∶K26), V.parahemolyticus zj12W239(O1∶K32), V.parahemolyticus zj11W202(O1∶K38), V.parahemolyticus zj12W238(O2∶K3), V.parahemolyticus zj12W210(O2∶K28), V.parahemolyticus zj12Y73(O3∶K5), V.parahemolyticus zj12W06(O3∶K6), V.parahemolyticus zj13Y174(O3∶K29), V.parahemolyticus zj13W113(O3∶K33), V.parahemolyticus zj12W68(O3∶K54), V.parahemolyticus zj12W176(O3∶K56), V.parahemolyticus zj12Y74(O4∶K8), V.parahemolyticus zj12W219(O4∶K34), V.parahemolyticus zj13W14(O4∶K42), V.parahemolyticus zj12Y6(O4∶K68), V.parahemolyticus zj13W118(O5∶K17), V.parahemolyticus zj12W107(O5∶K30), V.parahemolyticus zj12W134(O6∶K46), V.parahemolyticus zj13W16(O7∶KUT), V.parahemolyticus zj12W225(O8∶KUT), V.parahemolyticus zj11W211(O9∶KUT), V.parahemolyticus zj13W27(O10∶K24), V.parahemolyticus zj12W155(O11∶KUT).圖1　不同血清型副溶血性弧菌vp0209、vp0230基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1　PCR products of vp0209, vp0230 genes from V. parahemolyticus with various serotypes

M: 100 bp Ladder; A: lines 1-9: V.parahemolyticus zj12W06, Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Staphylococcus aureus ATCC25923, Listeria monocytogenes CMCC54006, Vibrio vulnificus ATCC27526, Salmonella enteritidis ATCC50041，Shigella flexneri ATCC12022, Bacillus cereus ATCC11778; B: lines 1-24 V.parahemolyticus zj12W297(O1∶K20), V.parahemolyticus zj12W269(O1∶K25), V.parahemolyticus zj12W211(O1∶K26), V.parahemolyticus zj12W239(O1∶K32), V.parahemolyticus zj11W202(O1∶K38), V.parahemolyticus zj12W238(O2∶K3), V.parahemolyticus zj12W210(O2∶K28), V.parahemolyticus zj12Y73(O3∶K5), V.parahemolyticus zj13Y174(O3∶K29), V.parahemolyticus zj13W113(O3∶K33), V.parahemolyticus zj12W68(O3∶K54), V.parahemolyticus zj12W176(O3∶K56), V.parahemolyticus zj12Y74(O4∶K8), V.parahemolyticus zj12W219(O4∶K34), V.parahemolyticus zj13W14(O4∶K42), V.parahemolyticus zj12Y6(O4∶K68), V.parahemolyticus zj13W118(O5∶K17), V.parahemolyticus zj12W107(O5∶K30), V.parahemolyticus zj12W134(O6∶K46), V.parahemolyticus zj13W16(O7∶KUT), V.parahemolyticus zj12W225(O8∶KUT), V.parahemolyticus zj11W211(O9∶KUT), V.parahemolyticus zj13W27(O10∶K24), V.parahemolyticus zj12W155(O11∶KUT).圖2　不同菌株vp0209、vp0230、toxR基因三重PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2　Triplex PCR products of vp0209, vp0230, toxR genes of various bacteria strains

3.2三重PCR檢測(cè)特異性分析當(dāng)以大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、創(chuàng)傷弧菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，3個(gè)目的條帶均未檢出，PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性(圖2A)。O3∶K6血清型副溶血性弧菌(zj2012W6)3個(gè)基因的目的條帶均檢出。以不同血清型副溶血性弧菌DNA為模板，5株O3群副溶血性弧菌有toxR、vp0209目的條帶檢出，其他血清型副溶血性弧菌均只有toxR基因檢出(圖2B)。該三重PCR方法對(duì)O3∶K6血清型副溶血性弧菌具有較好的檢測(cè)特異性。

3.3三重PCR檢測(cè)靈敏度分析105、104、103、102CFU/反應(yīng)體系均可檢出3個(gè)目的基因條帶，10CFU/反應(yīng)體系中沒(méi)有目的條帶檢出(圖3)，該方法的檢測(cè)靈敏度為102CFU/反應(yīng)體系。

M: 100 bp Ladder; lines: 1-5 the concentration of DNA template were 105, 104, 103, 102, 10 CFU/reaction system,respectively.圖3　三重PCR靈敏度檢測(cè)Fig.3　Detection sensitivity of triplex PCR

3.4三重PCR對(duì)副溶血性弧菌食源性和臨床分離菌株的檢測(cè)使用該P(yáng)CR檢測(cè)方法對(duì)2011-2013年浙江省各地分離的食源性和臨床副溶血性弧菌進(jìn)行檢測(cè)，其中50株O3∶K6血清型菌株，50株非O3∶K6血清型菌株。結(jié)果顯示O3∶K6血清型菌株均顯示陽(yáng)性，非O3∶K6血清型菌株均為陰性，符合率達(dá)到100%。圖4、圖5分別為部分O3∶K6血清型菌株和非O3∶K6血清型菌株P(guān)CR產(chǎn)物檢測(cè)電泳圖。

A: O3:K6 serotype strains; B: non-O3:K6 serotype strains; M: 100 bp Ladder; A lines 1-5: O3:K6 serotype strains; B lines 1-5: non-O3:K6 serotype strains.圖4　部分副溶血性弧菌三重PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4　Triplex PCR products of V. parahemolyticus strains

4　討　論

血清學(xué)分型是對(duì)副溶血性弧菌致病性和流行性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要參數(shù)。在我國(guó)2008年修訂的《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)—副溶血性弧菌檢驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.7-2008》中，血清學(xué)分型成為副溶血性弧菌的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。副溶血性弧菌血清型眾多，目前共有13個(gè)O血清群和70個(gè)K血清型[8]，副溶血性弧菌的血清學(xué)分型是以脂多糖(LPS)O-抗原和莢膜多糖(CPS)K-抗原的雙抗原系統(tǒng)為基礎(chǔ)進(jìn)行。目前。常用的血清型鑒定方法是玻片凝集法，根據(jù)凝集情況判斷菌株血清型。該方法已經(jīng)在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)、臨床檢驗(yàn)、科研等相關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但是在分型工作中也存在一些問(wèn)題，針對(duì)這些問(wèn)題，我們擬建立血清型的PCR檢測(cè)方法。本文中建立的O3∶K6血清型三重PCR檢測(cè)方法基于副溶血性弧菌種特異性基因toxR、O3血清群特異基因vp0209和K6血清型特異基因vp0230，可以同時(shí)檢

測(cè)菌株的種、O3血清群和K6血清型。該方法操作簡(jiǎn)便快捷，整個(gè)過(guò)程可在2 h內(nèi)完成。單個(gè)菌落即可進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到102CFU/反應(yīng)體系。具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度。是目前廣泛使用的血清玻片凝集方法的補(bǔ)充。

[1] Yeung PS, Boor KJ. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborneVibrioparahaemolyticusinfections[J]. Foodborne Pathog Dis, 2004, 10(1): 74-88. DOI: 10.1089/153531404323143594

[2] Su YC, Liu C. Vibrio parahaemolyticus: a concern of seafood safety[J]. Food Microbiol, 2007, 5(24): 549-558. DOI: 10.1016/j.fm.2007.01.005

[3] Kodama T, Hiyoshi H, Kazuyoshi G, et al. Identification of two translocon proteins ofVibrioparahaemolyticustype III secretion system 2[J]. Infect Immun, 2008, 1(9): 4282-4289. DOI:10.1128/IAI.01738-07

[4] Chen HY, Chen M, Sheng YY, et al. Distribution of serotype, ribotype and virulence gene ofVibrioparahaemolyticusisolated from foodborne disease outbreaks[J]. Chin J Food Hyg, 2011, 10(2): 114-118. (in Chinese)

陳洪友，陳敏，盛躍穎.副溶血性弧菌食源性疾病暴發(fā)分離株的血清型、核糖型及毒力基因研究[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2011, 10(2):114-118.

[5] Nair GB, Ramamurthy T, Bhattacharya SK, et al. Global dissemination ofVibrioparahaemolyticusserotype O3∶K6 and its serovariants[J]. Clin Microbiol Rev, 2007, 20(1): 39-48. DOI:10.1128/CMR.00025-06

[6] Nair GB, Hormazabal JC. TheVibrioparahaemolyticuspandemic[J]. Rev Chilena Infectol, 2005, 22(2): 125-130. DOI: 10.4067/S0716-10182005000200002

[7] Caburlotto G, Gennari M, Ghidini V, et al. Serological and molecular characterization ofVibrioparahaemolyticusmarine strains carrying pandemic genetic markers[J]. ISME J, 2010, 4(8): 1071-1074. DOI: 10.1038/ismej.2010.34

[8] Okura M, Osawa R, Tokunaga A, et al. Genetic analyses of the putative O and K antigen gene clusters of pandemicVibrioparahaemolyticus[J]. Microbiol Immunol, 2008, 52(5): 251-264. DOI: 10.1111/j.1348-0421.2008.00027.x

Triplex PCR method forVibrioparahemolyticusserotype O3∶K6 strains detection

ZHANG Yun-yi, MEI Ling-ling, ZHANG Jun-yan, ZHAN Li, CHEN Jian-cai,CHEN Hong-hu, ZHANG Zhen, YANG Yong

(ZhejiangProvincialCenterforDiseasePreventionandControl,Hangzhou310005,China)

Based on theVibrioparahemolyticusspecies specific genetoxR, the serogroup O3 specific genevp0209 and the serovar K6 specific genevp0230, a triplex PCR method was developed to detectVibrioparahemolyticusserotype O3∶K6 strains. High detection specificity was demonstrated and detection limit attained 102CFU/PCR reaction.

Vibrioparahemolyticus；O3∶K6 serotype；triplex PCR

Supported by the Public Welfare Project of Zhejiang Province (No. 2015C37058)

Mei Ling-ling, Email: llmei@cdc.zj.cn

梅玲玲，Email:llmei@cdc.zj.cn

浙江省疾病預(yù)防控制中心，杭州310005

R378.3

A

1002-2694(2016)07-0632-04

2016-04-28；

2016-06-21

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.008

浙江省公益類(lèi)科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2015C37058)