袁超文，江馗語，張力國，劉文鑫

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遼寧地區(qū)腹瀉患者大腸桿菌分離株II型不耐熱腸毒素的檢測及測序分析

袁超文1，江馗語2，張力國2，劉文鑫3

目的對遼寧地區(qū)人源性腹瀉樣本中致病性大腸桿菌(PathogenicEscherichiacoli)的毒力因子進(jìn)行檢測，掌握產(chǎn)II型不耐熱腸毒素(Type II heat labile enterotoxin, LT-II)大腸桿菌在我國北方地區(qū)的流行現(xiàn)狀并闡明LT-II與其他致病因子間的關(guān)系。方法于2014年3月至2015年3月收集遼寧地區(qū)人源性腹瀉糞便樣品，用麥康凱培養(yǎng)基和生化試驗的方法分離出大腸桿菌，并用多重PCR方法對毒力基因(elt-II、elt-I、sta、stb、K88、K99等)進(jìn)行檢測，對分離到的LT-II陽性大腸桿菌中elt-II基因進(jìn)行測序及分型。結(jié)果354份腹瀉樣品中共分離到攜帶有毒力因子的大腸桿菌139株，檢出率為39.2%。毒力因子陽性大腸桿菌中，有12株攜帶elt-II(8.6%)基因。在12株攜帶elt-II的大腸桿菌中，2株單獨攜帶elt-II，6株攜帶F1，1株攜帶K88，1株攜帶astA，2株攜帶irp2/astA；測序結(jié)果表明12株elt-II陽性大腸桿菌中有10株攜帶elt-IIc1亞型，2株攜帶elt-IIc4亞型。結(jié)論在引起人源性腹瀉的毒力因子中有大腸桿菌II型不耐熱腸毒的存在，且主要以LT-IIc1為主要流行型。

大腸桿菌 II型不耐熱腸毒素；PCR檢測；測序分析

致病性大腸桿菌(pathogenicE.coli)是引起人類和動物腸內(nèi)外疾病的重要病原微生物，其中腸產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicE.coli, ETEC)更是引起嬰幼兒、幼齡動物和旅行者腹瀉的主要病原菌[1]。腸毒素和菌毛是ETEC發(fā)揮致病作用的主要活性物質(zhì)。首先，致病菌經(jīng)口進(jìn)入人或動物體的腸道后，通過菌毛(F1、K88、K99、987P、F18、F41)或非菌毛粘附素(AIDA-1、Paa)發(fā)揮定植作用將菌體固定在腸壁上，然后，ETEC可單獨或同時合成耐熱腸毒素(heat-stable enterotoxin，ST)或不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin，LT)刺激腸上皮細(xì)胞分泌出大量的電解質(zhì)和水，最終導(dǎo)致機(jī)體腹瀉[2-3]。致病性大腸桿菌除了產(chǎn)生腸毒素及菌毛外，還可以表達(dá)其他毒力因子，如非菌毛黏附素、毒力島(pathogenicity islands，PAIs)、志賀毒素(Shiga toxin)、細(xì)胞外絲氨酸轉(zhuǎn)運蛋白酶(Serine Extracellular Protease Autotransporter, sepA)；腸聚集性大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素1(astA)等。這些毒力因子可單獨或協(xié)同存在于致病性大腸桿菌中，產(chǎn)生致病作用[4]。

大腸桿菌II型不耐熱腸毒素(Type II heat labile enterotoxin，LT-II)于1983年首次被國外學(xué)者分離并命名，其后的很長一段時間里，對該毒素的研究一直未見進(jìn)展，直到近幾年，研究者才把目光重新放在該毒素上[5-6]。LT-II根據(jù)其氨基酸序列的不同可被分為3個亞型，即LT-IIa、LT-IIb和LT-IIc，其中LT-IIc家族又包含LT-IIc1、LT-IIc2、LT-IIc3、LT-IIc4、LT-IIc5、LT-IIc6這6個分型[7]。目前，該毒素已在奶牛、人、水牛、肉牛、山羊和非哺乳動物(鴕鳥)的腹瀉糞便中相繼分離出來，經(jīng)證明該毒素具有很強(qiáng)的致病力，可以使人或動物發(fā)生嚴(yán)重的水樣腹瀉[8-9]。

同大腸桿菌I型不耐熱腸毒素(LT-I)相比，LT-II的國內(nèi)外研究尚處于起步階段，之前的研究中，本研究團(tuán)隊首次分離到了牛源的產(chǎn)LT-II大腸桿菌，并對其進(jìn)行了序列分析[10]。本研究中，繼續(xù)深入研究人源腹瀉大腸桿菌中LT-II的流行情況，通過對沈陽地區(qū)嬰幼兒腹瀉樣品中LT-II毒力基因和其他主要致病基因進(jìn)行流行病學(xué)檢測，闡明目前LT-II的流行趨勢及其與其他毒力基因的相互關(guān)系，為大腸桿菌腹瀉疾病的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑及參考菌株大腸桿菌參考菌株C83903(K88+, LT-I+,stb+,astA+)，C83920(K99+, F41+,sta+)，C83915(987P+,sta+)， C83684(F18ab+,stx2e+)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸桿菌HD-16-A(stx1+)、HD-49-A(ler+,eae+,hlyA+)、HD-03-C(ler+,sepA+)、HD-12-B(F1+,irp2+)、HD-13-A(sta+,stx2+,astA+)、HD-50-B(CS31A+,astA+)及DH5a為本研究室保存；OS-1(lt-II+)由美國Baffalo大學(xué)Terry教授饋贈、Trans 2k plus II DNA Marker、pMD18-Tsimple vector購自寶生物工程(大連)有限公司；EasyTaqDNA聚合酶、dNTPs(2.5 mmol/L)、DNA膠回收試劑盒、大腸桿菌生化微量管均購自全式金生物公司。

1.2菌株分離及鑒定收集遼寧地區(qū)2014年9月至2015年3月沈陽市婦幼保健醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院354例感染性腹瀉病人的糞便樣品，感染性腹瀉病例定義為每日排便3次或以上，且大便性狀有改變(呈稀便、水樣便、粘膿便或膿血便等)的門診病例，無菌收集樣品至EP管中并于12 h內(nèi)將樣品無菌劃線接種到麥康凱瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18 h后生長出典型的粉紅色菌落, 菌落經(jīng)涂片鏡檢為革蘭陰性桿菌后進(jìn)行純培養(yǎng)，將其再次劃線于MC瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18 h，選取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)18 h，將菌液保存于20%甘油環(huán)境中并進(jìn)行生化試驗檢測[11]。

1.3DNA模板的制備將保存于-20 ℃的大腸桿菌待測樣品和本研究所用的模板菌株分別接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。然后挑取單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min 振蕩培養(yǎng)16～18 h。取1 mL培養(yǎng)物，經(jīng)10 000×g離心5 min，去上清，加入100 μL滅菌去離子水重懸，100 ℃煮沸10 min后立即置冰浴中冷卻5 min，10 000×g離心5 min，取上清于-4 ℃保存作為DNA模板備用[12]。

1.4大腸桿菌的PCR檢測應(yīng)用PCR方法(單重或多重)檢測菌毛基因(K88、K99、987P、F1、F18、F41)、非菌毛粘附素基因(AIDA-I、paa、eae)、腸毒素基因(sta、stb、elt-I、elt-II)、志賀毒素基因(stx1、stx2、stx2e)、HPI和LEE毒力島基因、hlyA、afa8(afa8D、afa8E)、sepA和astA等基因。應(yīng)用Primer 5.0軟件重新為elt-II設(shè)計引物，而elt-II、sta、stb；irp2、eae；stx1、stx2e、stx2；K88、F41、K99、987P；AIDA-I、paa和afaD、afaE分別用多重PCR進(jìn)行檢測，其余則使用單重PCR檢測，所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(表1)。

表1PCR擴(kuò)增引物

Tab.1The PCR primers for amplification reaction

VirulencefactorForwardprimerReverseprimerSizeofproduct(bp)giaccessionnumberReferenceLT-IICTTCTTCCTAACGAAA-CATCATTACTGACATAT-CAACTTTCTCTTACGC920CP013112.1ThisstudyLT-ITAGAGACCGGTATTA-CAGAAATCTGATCATCCCGAATTCTGT-TATATATGTC282AB011677[13]staGGGTTGGCAATTTT-TATTTCTGTAATTACAACAAAGTTCA-CAGCAGTA183M25607[13]stbATGTAAATACCTA-CAACGGGTGATTATTTGGGCGCCAAAG-CATGCTCC360M35729[13]astAATGCCATCAACACAG-TATATCTCAGGTCGCGAGT-GACGG117ECU82533[14]K88GATGAAAAAGACTCT-GATTGCAGATTGCTACGTTCAGCG-GAGCG841M29374[13]K99CTGAAAAAAACACT-GCTAGCTATTCATATAAGTGACTA-AGAAGGATGC543M35282[13]987PGTTACTGCCAGTCTAT-GCCAAGTGTCGGTGTACCTGCT-GAACGAATAG463U50547[13]F41GATGAAAAAGACTCT-GATTGCATCTGAGGTCATCCCAAT-TGTGG682X14354[13]F18ATGAAAAGACTAGT-GTTTATTTCTTTTACTTGTAAGTAAC-CGCGTAAGCC520M61713[13]F1GGGCTGACAGAGGAG-GTGGGGCCCCGGCGACAACTTCAT-CACCGG411L77091.1[15]AIDA-IACAGTATCATATG-GAGCCATGTGCGCCAGAACTAT-TA586X65022[14]paaCCATAAAGACAGCT-TCAGTGAAAAGTATTACTGGTACCAC-CACCATCA162ECU82533[14]afaDGTTGAACTGAGTCTTA-ATACCAGTGTGAGCATTCTCCGCTA-ACTGATAAT354AF072900[16]afaECTAACTTGCCATGCTGT-GACAGTATTATCCCCTGCGTAGTT-GTGAATC302AF072901[16]eaeATATCCGTTTTAATGGC-TATCTAATCTTCTGCGTACTGT-GTTCA425Z11541[13]lerAACAAGCCCATACAT-TCAGCGCCATCATCAGGCA-CATTAG169AF135406Thisstudyirp2AAGGATTCGCTGTTAC-CGGACTCGTCGGGCAGCGTTTCT-TCT287L18881[13]Stx1ATTCGCTGAATGTCAT-TCGCTACGCTTCCCAGAATTG-CATTA664AB030485[13]Stx2GAATGAAGAAGATGTT-TATAGCGGGGTTATGCCTCAGTCAT-TATTAA281Z50754[13]Stx2eGAATGAAGAAGATGTT-TATAGCGGTTTTATGGAACGTAGG-TATTACC454M21534[13]hlyAGCATCATCAAGCG-TACGTTCCAATGAGCCAAGCTGGT-TAAGCT533EU118026.1[17]sepATAAAACCCGCCGCCT-GAGTATGCCGGTGAACAGGAG-GTTT611AY604009[18]續(xù)表(1)

1.5LT-II的克隆測序及分析根據(jù)GenBank所公布的所有elt-II序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計8對特異性引物，可分別用于擴(kuò)增elt-IIa,elt-IIb,elt-IIc1,elt-IIc2,elt-IIc3,elt-IIc4,elt-IIc5,elt-IIc6的全長操縱子(見表1)。利用以上8對引物分別擴(kuò)增所分離到的12株產(chǎn)elt-II毒素大腸桿菌。所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，連接于pMD18-Tsimple載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并送英駿生物技術(shù)有限公司測序。將測序結(jié)果與GenBank公布的序列進(jìn)行交叉比對并分析。

2　結(jié)　果

2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)及生化鑒定2014-2015年，從沈陽市婦幼保健醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院共采集354例感染性腹瀉病例的糞便樣品，無菌劃線于麥康凱瓊脂固體培養(yǎng)基上分離純化，隨機(jī)挑取大小不一、表面光滑、邊緣整齊、圓形、隆起的紅色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)；經(jīng)純化培養(yǎng)細(xì)菌用革蘭氏染色鏡檢，可見有大量散在排列、兩端鈍圓、形態(tài)均一、無芽胞的中等大小紅色桿菌；經(jīng)大腸桿菌生化微量管檢測并判定后，最終得到大腸桿菌312株。

2.2大腸桿菌毒力基因的檢測對生化鑒定得到的312株大腸桿菌菌株進(jìn)行黏附因子(F1、K88、K99、987p、F41、F18、AIDA-1、Paa、afaE-8)、毒素(elt-II、sta、stb、elt-I、stx1、stx2、stx2e、astA、afaD-8)、毒力島(eae、ler、irp2)、hlyA、sepA基因的PCR檢測，檢測前驗證各陽性模板和PCR引物特異性(見圖1)。檢測后合并同一糞便樣本克隆出的相同菌株，最后分離到致病性大腸桿菌139株。在分離的139株致病性大腸桿菌中58.3%(81株)攜帶至少一種菌毛或非菌毛黏附素，其中以F1(66/139)的檢出率最高，其次是afaE-8(11/139)和K88(4/139)。沒有檢測到K99、987P、F18和F41菌毛相關(guān)基因；139株致病性大腸桿菌中有105(75.5%)株攜帶至少一種毒素。其中以astA(39/139)檢出率最高，其次是elt-II(12/139)、sta(9/139)和stb(5/139)。沒有檢測到elt-I和stx2e基因。對于檢測的毒力島基因，irp2基因在人源大腸桿菌上普遍流行，檢出率高23.1%(32/139)，相較之下，ler和eae基因的檢出率分別為7.2%(10/139)、4.3%(6/139)，其他相關(guān)毒力基因檢測率則較低(表2)。

2.3LT-II與其他毒力基因的相關(guān)性本研究中大腸桿菌elt-II基因的檢出率高達(dá)8.6%(12/139)，其中單獨攜帶elt-II基因的有2株(1.4%)；6株攜帶F1菌毛，1株攜帶K88菌毛，1株攜帶astA和2株攜帶irp2/astA基因。此外，根據(jù)結(jié)果還顯示出F1菌毛檢測率高并普遍存在于人源致病性大腸桿菌上，該菌毛可單獨攜帶elt-II、sta和stb等毒力基因；K88菌毛常在人源與動物源腸致病性大腸桿菌中存在，是引起人和動物大腸桿菌性腹瀉的重要菌毛之一，而本研究中也檢測到1株elt-II和K88的組合。

表2LT-II及其相關(guān)毒力因子的檢測率

Tab.2Prevalence of the LT-II and its relationship with other virulence factors

F1K88K99AIDA-1PaaafaE-8K88/afaE-8F1/afaE-8NoneTotalelt-II61?29(6.5%)astA81?1827(19.4%)sta11?68(5.6%)stb5?5(3.6%)eae4?4(2.9%)ler2?46(4.3%)irp27?1219(13.7%)afaD-8123?6(4.3%)elt-II/astA?11(0.7%)hlyA/ler1?1(0.7%)sepA/ler1?1(0.7%)eae/ler1?12(1.4%)sta/stx2?11(0.7%)ler/irp2?11(0.7%)stx1/afaD-81?1(0.7%)irp2/astA3?58(5.6%)irp2/afaD-82?2(1.4%)elt-II/irp2/astA?22(1.4%)sta/stx1/astA1?1(0.7%)None3112?34(24.5%)

1: positive for elt-II; 2, 4, 12, 14, 20: negative control; 3, 13, 21: Tran2K Plus II DNA marker; 5-8: positive for sepA gene, astA gene, ler gene, hlyA gene, respectively; 9: positive for stb, elt-I and sta genes, respectively; 10: positive for LEE and HPI islands, respectively; 11: positive for stx1, stx2e and stx2 genes, respectively; 15: positive for K88, F41, K99 and 987P genes, respectively; 16: positive for F1 gene; 17:positive for AIDA-I and paa genes, respectively; 18: positive for afaD and afaE genes, respectively; 19: positive for F18 gene.圖1　PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　Result from the PCR amplification

2.4LT-II毒素基因的測序分型 用表1中設(shè)計8對分別擴(kuò)增elt-IIa,elt-IIb,elt-IIc1,elt-IIc2,elt-IIc3,elt-IIc4,elt-IIc5,elt-IIc6基因的特異性引物，以分離到的12株elt-II陽性大腸桿菌為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，膠回收基因片段與PMD18-T simple載體連接測序結(jié)果顯示，有10株攜帶elt-IIc1毒力基因，2株攜帶elt-IIc4毒力基因。將PCR產(chǎn)物測序后與GenBank中的參考序列進(jìn)行比對， 其同源性為100%(圖2)。

M：Trans DNA 8000 Marker; 1-12, PCR products of LT-II positive of E. coli strains, respectively; -, PCR negative control. A-H, the specific PCR products of elt-IIa, elt-IIb, elt-IIc, elt-IIc2, elt-IIc3, elt-IIc4, elt-IIc5 and elt-IIc6 genes, respectively.圖2　LT-II各亞型的PCR檢測結(jié)果 Fig.2　Result of PCR detection to each subtype of elt-II

3　討　論

致瀉性大腸桿菌是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原之一，給發(fā)展中國家或不發(fā)達(dá)國家的兒童健康帶來極大的威脅[19]。本研究對大腸桿菌可能攜帶的常見菌毛或非菌毛黏附因子進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在嬰幼兒腹瀉樣品中有elt-II基因的存在，但卻未檢測到elt-I基因，有研究認(rèn)為致病性大腸桿菌所攜帶的毒力因子流行情況復(fù)雜，即便在相同地區(qū)，不同的年份所分離到致病性大腸桿菌所攜帶的毒力因子是不同的；即使是在相同時間段，不同國家地區(qū)所分離到的致病性大腸桿菌所攜帶的毒力因子也是不同的[4]。故而本次流行病學(xué)調(diào)查中，所有菌株elt-I均陰性。而所分離的12株陽性LT-II大腸桿菌中，僅有2株單獨攜帶elt-II基因，共有6株攜帶有F1菌毛基因，1株攜帶有K88菌毛基因，這似乎表明LT-II發(fā)揮毒性作用主要與F1菌毛密切相關(guān)，攜帶有菌毛和elt-II基因的致病性大腸桿菌進(jìn)入機(jī)體內(nèi)后，菌毛便可發(fā)揮黏附作用使細(xì)菌特異性的與小腸細(xì)胞上的受體牢固結(jié)合，最終促使LT-II發(fā)揮生物學(xué)作用引起嚴(yán)重腹瀉。目前關(guān)于F1菌毛的研究仍處于不完善階段，只有該菌毛G蛋白研究較為深入，對于該菌毛其他結(jié)構(gòu)蛋白的進(jìn)一步研究可對揭示LT-II如何發(fā)揮毒性作用起著重要的意義。此外，本研究中irp2的檢出率高達(dá)23.1%，且有1株為同時攜帶astA和elt-II基因，irp2作為HPI毒力島核心保守區(qū)的主要結(jié)構(gòu)基因，與鐵攝取能力密切相關(guān)，應(yīng)予以高度重視。

elt-II基因于1983年首次成功分離至今，30多年來只有少數(shù)學(xué)者從事該毒素的研究工作，并且研究大多集中在elt-IIa和elt-IIb。直到近幾年，有學(xué)者陸續(xù)的從埃及、英國等國家的人和動物糞便中分離到elt-II基因[20]。LT-IIc家族自2010年首次被分離發(fā)現(xiàn)并且命名以來，已有很多專家學(xué)者對其開展相關(guān)研究，并且通過在南美各地LT-IIc家族已逐漸取代了LT-IIa和LT-IIb成為了主要流行致病基因。本研究通過對沈陽地區(qū)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該毒素目前的流行趨勢以LT-IIc家族為主，并無LT-IIa和LT-IIb出現(xiàn)，似乎預(yù)示著隨著時間的推移LT-IIa、LT-IIb毒力基因或已經(jīng)逐漸消失，并與國外報道的流行趨勢一致。與此同時，Jobling等人通過對elt-IIa、elt-IIb和elt-IIc家族8種基因的基因進(jìn)化分析，其結(jié)果表明，LT-IIc家族是近年來進(jìn)化出的一支不同與LT-IIa和LT-IIb的新型不耐熱腸毒素，其氨基酸同源性與后者相差較大，與之結(jié)合的受體類型也有很大的區(qū)別，蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能卻十分類似[7]。盡管LT-IIc家族含有6種或者甚至更多的亞型，其氨基酸序列的同源性卻高達(dá)96%以上，因此其結(jié)構(gòu)和功能上都無太大的異同，并且隨著時間和空間的推移，不排除會有更多新類型的LT-II出現(xiàn)的可能，及時有效的對腹瀉病例病原檢測對食品安全和疾病防控都具有重要的意義。

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Sequence analysis on type II heat labile enterotoxin ofEscherichiacolifrom diarrhaea patients in Liaoning Province, China

YUAN Chao-wen1, JIANG Kui-yu2, ZHANG Li-guo2, LIU Wen-xin3

(1.CollegeofLifeandHealthSciences,NortheastUniversity,Shenyang110819,China;2.LiaoningCenterforAnimalDiseaseEmergency,Shenyang110161,China;3.LaboratoryofHematology,theAffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,China)

In this study, we aimed to investigate the prevalence of type II heat labile enterotoxin (LT-II) producing PathogenicEscherichiacoli, and to further analyzed the relationship betweenelt-IIand other virulence factors. From 2014 to 2015, a total of 354 human fecal samples were collected from Liaoning Province, and then 354E.colistrains were isolated from the fecal samples by using MacConkey agar and biochemical test. The isolated strains were further detected by using PCR method for detecting the virulence factors (elt-II,elt-I,sta,stb, K88, K99, etc.), and theelt-IIgene was sequenced in LT-II positiveEscherichiacoli. Results showed that 139(39.2%) virulence factor positiveE.coliwere isolated from 354 fecal samples. Of the 139 virulence factor positiveE.coli, 12(8.6%) harbored theelt-IIgene. Of the 12elt-IIpositive strains, 2 harbored theelt-IIas the only virulence factor, 6 harbored F1 besides theelt-IIgene, 1 harbored K88 besides theelt-IIgene, 1 harboredastAbesides theelt-IIgene, and 2 harboredirp2/astAbesides theelt-IIgene. The result of sequencing showed that 10 of the 12elt-IIpositive strains harbored theelt-IIc1 subtype, and 2 of the 12elt-IIpositive strains harbored theelt-IIc4 subtype. Results indicated that LT-II existed in human resource fecal samples, and LT-IIc1 was the mainly subtype.

Escherichiacolielt-II; PCR detection; sequencing and analysis

Liu Wen-xin, Email: liuwenxin2009@163.com

劉文鑫， Email: liuwenxin2009@163.com

1.東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院，沈陽110819；2.遼寧省重大動物疫情應(yīng)急中心，沈陽110161；3.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，血液疾病研究中心，湛江524001

R183.3

A

1002-2694(2016)07-0644-07

2015-10-15;

2016-04-23

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.011