張平，馬惠琴，龍冬梅，賀志昊，王蕓華，楊廷軍（貴州省畢節(jié)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州畢節(jié)551700）

豬藍(lán)耳病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

張平，馬惠琴，龍冬梅，賀志昊，王蕓華，楊廷軍
（貴州省畢節(jié)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州畢節(jié)551700）

2015年8月,畢節(jié)市某豬場(chǎng)發(fā)生一起以發(fā)病豬體溫升高、母豬流產(chǎn)、仔豬高死亡率為特點(diǎn)的傳染病。當(dāng)?shù)孬F醫(yī)根據(jù)臨床癥狀指導(dǎo)用了大量的藥物治療，但效果不佳。通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀、剖檢病變,初步診斷為疑似高致病性豬藍(lán)耳病,為確診病原,對(duì)病死豬的組織進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。通過(guò)R T-PCR試驗(yàn)檢測(cè)，確診為高致病性豬藍(lán)耳病毒陽(yáng)性。

豬藍(lán)耳病病毒；實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)；實(shí)時(shí)熒光R T-PCR

高致病性豬藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）變異毒株引起的一種急性、高傳染性、高致病性的疫病，目前已成為危害全球養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一。豬藍(lán)耳病病毒于2005年發(fā)生變異后引起高致病性豬藍(lán)耳病，發(fā)病率、致死率均顯著增高。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告疫病，我國(guó)列為二類動(dòng)物疫病。由于最先在歐洲的臨床病例出現(xiàn)特有的豬的耳朵藍(lán)灰色病變，我國(guó)學(xué)者、飼養(yǎng)人員和臨床獸醫(yī)將其簡(jiǎn)稱為豬藍(lán)耳病或藍(lán)耳病[1-5]。該病有美洲株和歐洲株兩大類型，美洲株最早在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)90年代后傳入我國(guó)。2015年8月,畢節(jié)市某豬場(chǎng)發(fā)生一起以發(fā)病豬體溫升高、母豬流產(chǎn)、仔豬高死亡率為特點(diǎn)的傳染病。當(dāng)?shù)孬F醫(yī)根據(jù)臨床癥狀指導(dǎo)用了大量的藥物治療，但效果不佳。通過(guò)臨床癥狀、剖檢病變,初步診斷為疑似高致病性豬藍(lán)耳病,綜合流行病學(xué)信息、臨床表現(xiàn)及剖檢病變懷疑為豬藍(lán)耳病病毒或豬瘟病毒感染，也可能為二者混合感染，為對(duì)該病例作出確切性診斷，特進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。對(duì)畢節(jié)某規(guī)模豬場(chǎng)出現(xiàn)的妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及部分仔豬發(fā)病的情況,為確診病原，本文利用實(shí)驗(yàn)室實(shí)時(shí)熒光RT-PCR診斷技術(shù)，最終確診為豬偽狂犬病毒感染引起。

一、材料與方法

（一）材料

1.病料。采集病死豬只組織（脾臟、淋巴結(jié)）放在雙抗PBS溶液中，低溫冷藏保存運(yùn)至畢節(jié)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室。

2.主要試劑。世紀(jì)元亨豬繁殖與呼吸綜合征病毒(NSP2 1594-1680變異株)檢測(cè)試劑盒，豬藍(lán)耳病病毒熒光定量PCR試劑盒。

（二）方法

1.樣品的處理。取病死豬只組織（脾臟、淋巴結(jié)），用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于組織勻漿機(jī)中研磨，加入2mL去離子水，研磨均勻后離心取500μL上清液于滅菌離心管中。

2.RNA提取。按照豬藍(lán)耳病病毒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3.實(shí)時(shí)熒光RP-PCR檢測(cè)。反應(yīng)采用25μL體系，反應(yīng)體系為：無(wú)菌無(wú)核酸水2.7μL，RT-PCR反應(yīng)液10μL，酶混合液0.4μL，熒光探針1.9μL，RNA模板10μL。反應(yīng)條件為：45℃15min，95℃1min；95℃5s，60℃35s，在每個(gè)循環(huán)第二步收集FAM熒光信號(hào)，共40循環(huán)（報(bào)告基因“FAM”，淬滅基團(tuán)“NONE”）

二、試驗(yàn)結(jié)果

（一）臨床癥狀及藥物治療情況

采樣時(shí)共有13頭左右發(fā)病，死亡3頭。主要臨床癥狀為:食欲不振、流產(chǎn)、嘔吐、病程短的6～12h死亡，病程長(zhǎng)的死亡前四肢劃動(dòng)，有神經(jīng)癥狀。發(fā)病母豬有流產(chǎn)死胎現(xiàn)象腹部發(fā)紅。剖檢主要表現(xiàn)為:肺臟肉變，肝臟充血，腎臟表皮有點(diǎn)狀出血，腸系膜淋巴結(jié)嚴(yán)重腫大。交替使用青鏈霉素、頭孢類、磺胺類等藥物肌肉注射治療，使用多量維生素和干擾素混水飲用，但治療效果不佳。

（二）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)畢節(jié)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心采集該場(chǎng)病死豬樣品進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示，病死豬只組織均檢出疑似高致

圖1　PRV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果A1：陽(yáng)性對(duì)照；E1：陰性對(duì)照；B1/C1/D1：待檢樣品

三、討論

豬群一旦發(fā)生高致病性豬藍(lán)耳病后極易混合感染或繼發(fā)豬瘟、圓環(huán)病毒、細(xì)菌性疾病等，特別是豬瘟，可以說(shuō)是豬病的萬(wàn)惡之源，所以必須搞好豬瘟的預(yù)防和凈化工作[6-9]。其他疾病能使用疫苗免疫預(yù)防的，按免疫程序按時(shí)開(kāi)展，如果沒(méi)有疫苗免疫預(yù)防的，可提前采用一些藥物進(jìn)行預(yù)防[10]。高致病性豬藍(lán)耳病臨床上多表現(xiàn)為母豬的流產(chǎn)和仔豬的腹瀉、神經(jīng)癥狀，僅從臨床表現(xiàn)和剖檢很難將其與有相似癥狀的豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等區(qū)分開(kāi)來(lái)，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能確診。本文采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)流產(chǎn)胎兒組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的檢測(cè)，確診了該次疫病由豬偽狂犬病毒引起。為今后實(shí)驗(yàn)室確診豬偽狂犬病提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

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（編輯：張瓊瓊）

S858.28

B

1673-9019(2016)13-0034-02

2016-06-06

張平（1988-），女，安徽阜陽(yáng)人，主要從事獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作。病性豬藍(lán)耳病病毒核酸陽(yáng)性，沒(méi)有檢出豬瘟、圓環(huán)病。（見(jiàn)圖1）。由圖可知病死豬組織樣品DNA均呈出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線。