孫德彬　熊雪芳　周家峰▲　蘭　芬.浙江省麗水市中心醫(yī)院呼吸科，浙江麗水　33000；.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院呼吸科，浙江杭州　30009

哮喘患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th1/Th2的變化及其與哮喘病情的關(guān)系

孫德彬1熊雪芳1周家峰1▲蘭芬2
1.浙江省麗水市中心醫(yī)院呼吸科，浙江麗水323000；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院呼吸科，浙江杭州310009

目的探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和Th1/Th2水平變化與哮喘病情的關(guān)系，初步揭示哮喘的發(fā)病機(jī)制。方法選取2014年12月～2015年12月在呼吸科收治的150例患者和健康職工50例，檢測哮喘患者（急性期和緩解期）和健康職工外周血中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th1/Th2的變化，通過SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果哮喘患者Treg顯著低于健康對照組［（2.3±0.3）%］（t=9.043，P=0.0032）。急性期組患者顯著低于緩解期組和對照組（t=3.289，P=0.0321，t=9.884，P=0.0011），重度患者［（0.8±0.3）%］低于輕度患者［（1.5±0.4）%］，且具有顯著性差異（t=8.945，P= 0.0055），緩解期組與健康組比較，無顯著性差異（t=0.487，P=0.3291）。Th1/Th2水平在哮喘急性患者組顯著低于對照組（11.8±0.8）和哮喘緩解期組（8.5±0.6）（t=12.884，P=0.0008；t=13.289，P=0.0007），表明在哮喘發(fā)作期時，Th亞群出現(xiàn)明顯的失衡。哮喘患者急性期組重度患者Th1/Th2水平（4.8±0.9）顯著低于輕度患者（9.5±0.8），具有顯著性差異（t=8.432，P=0.0041）。Spearman相關(guān)性分析顯示Treg水平越低，哮喘患者病情越嚴(yán)重，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r= -0.854，P=0.025）；Th1/Th2水平越低，哮喘患者的病情也越嚴(yán)重，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.635，P=0.035）。且Treg水平和Th1/Th2水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.889，P=0.013）。結(jié)論哮喘患者的發(fā)病機(jī)制可能是隨著患者病情的加重，過敏原對機(jī)體的刺激程度加劇，進(jìn)而引起外周血中Treg所占比例降低，免疫調(diào)節(jié)功能受到損傷，Th2細(xì)胞開始大量增殖活化，而Th1細(xì)胞則受到抑制，導(dǎo)致Th1/Th2表現(xiàn)失衡，從而引起哮喘的發(fā)作。

哮喘；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；發(fā)病機(jī)制；免疫調(diào)節(jié)；過敏原

［Abstract］Objective To discuss the re1ations between changes of Treg and Th1/Th2 and asthma.Methods 150 patients treated from December 2014 to December 2015 in our department and 50 hea1thy vo1unteers were se1ected to detect the changes of Treg and Th1/Th2 in periphera1 b1ood of asthma patients（at acute stage and remission stage）and hea1thy subjects.The data was ana1yzed by SPSS22.0.Results The 1eve1 of Treg was significant1y 1ower in the asthma patients than in the hea1thy contro1 group［（2.3±0.3）%］（t=9.043，P=0.0032），a1so significant1y 1ower in the acute stage group than in the remission stage group and the hea1thy contro1 group（t=3.289，P=0.0321，t=9.884，P=0.0011），and was significant1y 1ower in severe patients［（0.8±0.3）%］than in mi1d patients［（1.5±0.4）%］.There was no significant difference in Treg between the remission stage group and the hea1thy contro1 group（t=0.487，P=0.3291）.The 1eve1 of Th1/Th2 was significant1y 1ower in the acute asthma patients（4.8±0.9）than in the hea1thy contro1 group（11.8±0.8）and the remission stage group（8.5±0.6）（t=12.884，P=0.0008；t=13.289，P=0.0007），indicating significant unba1ance of Th subgroup in the onset period of asthma.In the acute stage group，the Th1/Th2 1eve1 of severe patients（4.8±0.9）was significant1y 1ower than that in mi1d patients（9.5±0.8），（t=8.432，P=0.0041）.Spearman corre1ation ana1ysis showed a negative corre1ation that a 1ower 1eve1 of Treg meant a severer condition of asthma（r=-0.854，P=0.025），a1so a negative corre1ation that a 1ower 1eve1 of Th1/Th2 meant a severer condition of asthma（r=-0.635，P=0.035），and a positive corre1ation between 1eve1 of Treg and 1eve1 of Th1/Th2.Conclusion Pathogenesis of asthma is possib1e to be that a1ong with the severity of disease，the stimu1ation of a11ergen is aggravating，causing proportion decrease of Treg in periphera1 b1ood and damage to the immune modu1ating function，1eading to pro1iferation and activation of Th2 ce11s and inhibition of Th1 ce11s，resu1ting in unba1ance of Th1/Th2 and causing onset of asthma.

［Key words］Asthma；Regu1atory T ce11；Pathogenesis；Immunoregu1ation；A11ergen

哮喘作為一種常見的慢性疾病，其主要病理學(xué)特征主要是呼吸道炎性反應(yīng)和氣道重塑［1，2］。在哮喘發(fā)病中，Th1/Th2功能失調(diào)扮演重要角色［2］。因子IFN-γ由細(xì)胞Th1分泌，IL-4由細(xì)胞Th2分泌［3］。近期文獻(xiàn)多報道引起哮喘的重要環(huán)節(jié)是免疫耐受受到破壞［4］。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regu1atory T ce11，簡稱Treg）作為可以控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)的一類細(xì)胞，具有以下兩個特點(diǎn)：一是能表達(dá)胞外表面分子CD4和CD25，二是可以表達(dá)細(xì)胞核內(nèi)蛋白Foxp3，Treg的特異性標(biāo)志就是這個Foxp3蛋白［5］。已有文獻(xiàn)報道Foxp3突變的小鼠常會出現(xiàn)敏性氣道炎癥，IgE和嗜酸性粒細(xì)胞出現(xiàn)明顯增高，且Th1/Th2表現(xiàn)出失衡［6］。在2003年，美國醫(yī)學(xué)家 Fontenot等研究發(fā)現(xiàn) CD4+CD25+Treg數(shù)目在Foxp3突變鼠和Foxp3缺失的鼠體內(nèi)顯著減少［7］。在T細(xì)胞的亞群和細(xì)胞因子的相互作用方面，科研工作者展開了大量的研究，本文希望通過檢測哮喘患者和正?；颊咄庵苎狢D4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）以及Th1/Th2比值變化，從而探討哮喘病情與其的關(guān)系，以期能夠在診斷和治療哮喘患者方面提供一定的數(shù)據(jù)支持，為進(jìn)一步發(fā)掘哮喘的發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2014年12月～2015年12月在本院呼吸科收治的150例患者，其中男90例，女60例，年齡35～60歲，平均年齡（41.4±3.4）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）按照中國醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組指定的《支氣管哮喘防治指南》［8］，確診為哮喘的患者；（2）患者入組前1周未使用糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑；（3）無急性感染，無其他慢性病史；（4）患者及其家屬知情并且積極配合參與本項目。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）確診為哮喘但伴隨其他嚴(yán)重慢性疾?。唬?）患者無法配合完成整個項目。入選的150例患者，按照臨床的表現(xiàn)又被分為急性期組（100例）和緩解期組（50例）。其中急性期組又分為重度組（50例）和輕度組（50例）。本研究選取本院各項體檢正常的職工作為對照組，共50例，其中男30例，女20例，年齡36～61歲，平均（42.0±3.3）歲，對照組職工均無過敏性疾病，并且近期無呼吸道感染。分別對各組患者外周血中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和Th1、Th2的比例進(jìn)行檢測觀察。

1.2實驗試劑和設(shè)備

1.2.1實驗試劑 所用試劑均從美國的eBioscience公司和BD Phar Mingen公司采購獲得。其中采購自美國的eBioscience公司試劑有：異硫氰酸光素（FITC）標(biāo)記的鼠抗人CD4單克隆抗體、藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體以及其相匹配的同型對照。藻藍(lán)蛋白（APC）標(biāo)記的鼠抗人Foxp3單克隆抗體和Fixation/ Perm以及刺激劑（Leukocyte Activation Cocktai1）。采購自BD PharMingen公司的試劑有：PE-CY5（PC5）標(biāo)記的鼠抗人CD3單克隆抗體、PC7標(biāo)記的鼠抗人CD8單克隆抗體、FITC標(biāo)記的鼠抗人IFN-γ單克隆抗體和PE標(biāo)記的鼠抗人IL-4單克隆抗體，F(xiàn)ix&Perm。自配0.83%的氯化銨作為紅細(xì)胞裂解液，0.5%小牛血清PBS作為洗滌液。

1.2.2設(shè)備流式細(xì)胞儀，型號為FACSCanto，廠家為美國的BD公司。

1.3方法

1.3.1全血制備 清晨空腹抽取哮喘患者和健康對照組的1 mL靜脈血于使用肝素抗凝的管中，然后備用。

1.3.2Treg檢測方法調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測使用美國BD公司的流式細(xì)胞儀，其型號為FACSCanto，數(shù)據(jù)分析使用Ce11quest軟件，對CD4+細(xì)胞中Foxp3+細(xì)胞百分率進(jìn)行計算。其檢測過程如下：首先取100 μL 1.3.1制備的全血，然后加入CD4-FITC與CD25-PE刺激劑10 μL，在4℃避光條件下孵育30 min；之后直接加入1 mL氯化銨紅細(xì)胞裂解，保持10 min，結(jié)束后使用PBS進(jìn)行洗滌，共3次，離心條件為：轉(zhuǎn)速12 000 rpm/min，時間為5 min；1 mL Fixation/Perm緩沖液穿膜45 min，取10 μL APC標(biāo)記的鼠抗人Foxp3單克隆抗體直接加進(jìn)洗滌緩沖液，在4℃下，避光孵育30 min。將破膜液洗滌2次，然后直接加入300 μL流式細(xì)胞染色緩沖液，重懸，進(jìn)而Treg檢測［9］。

1.3.3Th1/Th2檢測方法 取100 μL 1.3.1制備的全血，按照1：1等體積加入RPMI1640進(jìn)行稀釋，然后加入刺激劑10 μL，培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。結(jié)束后混勻，然后加入10 μL CD3-PC5 和10 μL CD8-PC7，在室溫條件下，避光孵育15 min；結(jié)束后加入100 μL Fix&Perm中的固定液：Reagent1，將其固定，然后在室溫條件下避光孵育15 min；孵育結(jié)束后加入3 mL PBS清洗，在轉(zhuǎn)速為12 000 rpm條件下離心5 min，倒掉上清。然后取100 μL Fix&Perm中的破膜和溶血液：Reagent2，加入，同時再加入10 μL IFN-γ-FITC和IL-4-PE于各管中，在室溫條件下避光孵育15 min［10］。結(jié)束后取3 mL PBS加進(jìn)各管中，在轉(zhuǎn)速為12 000 rpm條件下離心5 min，倒掉上清。最后再取0.5 mL PBS加入，將細(xì)胞重懸，進(jìn)行檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)描述［11］，測定數(shù)值的方差齊性檢驗采用Levene's Test，若方差齊行t檢驗，若方差不齊采用 Satterthwaite近似t檢驗［12］，使用Spearman相關(guān)分析法對數(shù)據(jù)相關(guān)性進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01表示差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1哮喘患者與健康對照組CD4+CD25+Foxp3+Treg水平比較

哮喘患者CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T比例達(dá)（1.6±0.4）%，顯著低于對照組［（2.3±0.3）%］（t=9.043，P=0.0032）。哮喘患者急性期組患者CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T比例為（1.1±0.4）%，顯著低于緩解期組和對照組（t=3.289，P=0.0321；t=9.884，P=0.0011）。緩解期組與對照組對比，無顯著性差異（t=0.487，P= 0.3291）。急性期組重度患者［（0.8±0.3）%］低于輕度患者［（1.5±0.4）%］，且具有顯著性差異（t=8.945，P=0.0055）。見表1。

表1　兩組CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分率比較（±s，%）

表1　兩組CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分率比較（±s，%）

注：a急性期組與對照組比較，b緩解期組與急性期組比較，c緩解期組與對照組比較

組別　CD4+CD25+Foxp3+Treg對照組哮喘患者組急性期組重度輕度緩解期組t值t值a t值b t值c 2.3±0.3 1.6±0.4 1.1±0.4 0.8±0.3 1.5±0.4 1.9±0.3 9.043（P=0.0032）9.884（P=0.0011）3.289（P=0.0321）0.487（P=0.3291）

2.2哮喘患者與健康對照組Th1/Th2比較

Th1/Th2水平在哮喘急性期患者組顯著低于對照組 （11.8±0.8）和哮喘緩解期組 （8.5±0.6）（t= 12.884，P=0.0008；t=13.289，P=0.0007），表明在哮喘發(fā)作期時，Th亞群出現(xiàn)明顯的失衡。哮喘患者急性組重度患者Th1/Th2水平（4.8±0.9）顯著低于輕度患者（9.5±0.8），具有顯著性差異（t=8.432，P=0.0041）。見表2。

表2　兩組Th1/Th2水平比較（±s）

表2　兩組Th1/Th2水平比較（±s）

注：a急性期組與對照組比較，b緩解期組與急性期組比較，c緩解期組與對照組比較

組別Th1/Th2對照組哮喘患者組　急性期組重度輕度緩解期組t值a t值b t值c 11.8±0.8 6.5±0.4 4.8±0.9 9.5±0.8 8.5±0.6 12.884（P=0.0008）13.289（P=0.0007）10.345（P=0.0015）

2.3哮喘患者Treg水平和Th1/Th2變化與哮喘病情關(guān)系

通過Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示出Treg水平越低，哮喘患者病情越嚴(yán)重，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.854，P=0.025）；Th1/Th2水平越低，哮喘患者的病情也越嚴(yán)重，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.635，P=0.035）。且Treg水平和Th1/Th2水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.889，P=0.013）。

3　討論

支氣管哮喘作為一種慢性氣管炎疾病，有多種炎癥細(xì)胞參與和介導(dǎo)［13，14］。近年來其在世界各地發(fā)病率和致死率呈現(xiàn)遞增趨勢［15］，嚴(yán)重威脅著人類的健康［16］，由于其反復(fù)發(fā)作，并且難以根治，給患者帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和巨大的精神壓力［17］。Treg是近些年來研究發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制效應(yīng)的T細(xì)胞［18］，在維持機(jī)體和抑制自身免疫疾病方面起著重要作用，研究顯示大部分Treg細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞，可以使機(jī)體通過調(diào)節(jié)免疫外周耐受來控制免疫性疾?。?9］。隨著研究的進(jìn)一步深入，輔助性T細(xì)胞（Th1/Th2）在哮喘患者當(dāng)中的研究越來越受重視［20］。Th1和Th2可以通過分泌細(xì)胞因子，彼此之間進(jìn)行相互交叉作用［21］。

本研究通過檢測哮喘患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th1/Th2的變化，探討了其與哮喘患者病情的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T比例達(dá)（1.6±0.4）%，顯著低于健康對照組［（2.3± 0.3）%］（t=9.043，P=0.0032）。哮喘患者急性期組患者CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T比例為（1.1±0.4）%，顯著低于緩解期組和對照組（t=3.289，P=0.0321；t=9.884，P=0.0011）。緩解期組與健康組對比，無顯著性差異（t=0.487，P=0.3291）。急性期組重度患者［（0.8±0.3）%］低于輕度患者［（1.5±0.4）%］，且具有顯著性差異（t= 8.945，P=0.0055）。Th1/Th2水平在哮喘急性期患者組顯著低于對照組（11.8±0.8）和哮喘緩解期組（8.5±0.6）（t=12.884，P=0.0008；t=13.289，P=0.0007），表明在哮喘發(fā)作期時，Th亞群出現(xiàn)明顯的失衡。哮喘患者急性組重度患者Th1/Th2水平（4.8±0.9）顯著低于輕度患者（9.5±0.8），具有顯著性差異（t=8.432，P=0.0041）。Spearman相關(guān)性分析顯示出Treg水平越低，哮喘患者病情越嚴(yán)重，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.854，P=0.025）；Th1/Th2水平越低，哮喘患者的病情也越嚴(yán)重，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.635，P=0.035）。且Treg水平和Th1/Th2水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.889，P=0.013）。

綜上，目前關(guān)于哮喘患者Treg水平和Th1/Th2與病情的關(guān)系的報道比較少，本研究發(fā)現(xiàn)哮喘在發(fā)作期時，重度患者外周血的Treg水平和Th1/Th2比值明顯降低，且在病情發(fā)展過程中保持了較強(qiáng)的一致性?？梢酝茰y出，哮喘患者的發(fā)病機(jī)制可能是隨著病情的加重，機(jī)體受到過敏原的刺激加劇，導(dǎo)致患者外周血中Treg所占比例降低，免疫調(diào)節(jié)功能受到損傷，Th2細(xì)胞開始大量增殖活化，而Th1細(xì)胞則受到抑制，從而導(dǎo)致Th1/Th2表現(xiàn)失衡，大量制炎因子開始產(chǎn)生，從而引起哮喘的發(fā)作。

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Changes of peripheral blood regulatory T cells and Th1/Th2 and their relations with asthma

SUN Debin1XIONG Xuefang1ZHOU Jiafeng1LAN Fen2
1.Department of Respiration，Lishui Centra1 Hospita1 in Zhejiang Province，Lishui323000，China；2.Department of Respiration，the Second Affi1iated Hospita1 of Zhejiang University，Hangzhou310009，China

R562.25

A

1673-9701（2016）16-0006-04

浙江省自然科學(xué)基金（LY15H010002）

2016-03-04）