劉元?jiǎng)P

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150060）

植物人工免疫的抗病性可以遺傳Ι.給大白菜免疫TyMV病毒病

劉元?jiǎng)P

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150060）

人工免疫的抗病性能夠遺傳，一直是農(nóng)醫(yī)科學(xué)工作者的一個(gè)夢(mèng)！作者經(jīng)過32年研究，發(fā)現(xiàn)了生物突變和進(jìn)化的機(jī)制，是生物體受不利于生存因素刺激產(chǎn)生的應(yīng)對(duì)信息，恰遇其精卵兩性細(xì)胞融合時(shí)，便進(jìn)入其中，作為下代抵抗同樣因素的“記憶”，從而建立了圓夢(mèng)的理論根據(jù)。在實(shí)驗(yàn)中，第一次在大白菜的二牛心品種上，用TyMV病毒免疫病毒病，使一個(gè)常遭毀滅性危害的品種，在病毒病大流行年也不發(fā)病，并穩(wěn)定遺傳，在生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。第二次實(shí)驗(yàn)在大白菜724品系上做TuMV免疫處理后，連續(xù)鑒定5代病情指數(shù)都不超過10.49，把一個(gè)原來近于高感的品系免疫到了高抗標(biāo)準(zhǔn)，就認(rèn)證了人工免疫的抗病性可以穩(wěn)定遺傳。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了兩次免疫效果差異的原因，十分珍貴。聯(lián)系在西瓜上免疫枯萎病的病情指數(shù)由30.17降低到穩(wěn)定的1.2的例子，就自然認(rèn)證了人工免疫的抗病性是可以遺傳的，對(duì)生物突變與進(jìn)化的機(jī)制的論證是正確的，可借鑒面廣，意義重大。

大白菜；病毒??；植物人工免疫；抗病性遺傳；TyMV病毒；兩性細(xì)胞融合

創(chuàng)新生物資源之路一直是我國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中的重點(diǎn)項(xiàng)目，從物理、化學(xué)、生物和太空技術(shù)進(jìn)行了廣泛研究，經(jīng)過60多年至今，還沒有提出一個(gè)可以通用的應(yīng)用方案。轉(zhuǎn)基因技術(shù)雖然生產(chǎn)出了大宗商品，但還有不少消費(fèi)者并不接受，深知根底的科學(xué)家則指出了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在理論問題上的重要偏差。

植物人工免疫在國際上曾研究了幾十年，了解了接種能產(chǎn)生抗性，但不持久，更不遺傳，沒有應(yīng)用價(jià)值。多年前，筆者在研究大白菜病毒病時(shí)，順便用TuMV病毒在二牛心大白菜上做了一個(gè)探索免疫的試驗(yàn)，一個(gè)經(jīng)常被病毒病毀滅的大白菜品種一次免疫兩次篩選成功，無論在重發(fā)病年或病毒病大流行年都不發(fā)病，而且穩(wěn)定遺傳。但在以后對(duì)其他品種免疫中累遭失敗。于是就進(jìn)行理論研究，慢慢走向了研究生物突變和進(jìn)化的機(jī)制。無論用生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)［1］，還是自然哲學(xué)知識(shí)［2］進(jìn)行論證，都殊途同歸，證明發(fā)現(xiàn)了生物突變和進(jìn)化的機(jī)制，是生物受不利于生存因素刺激產(chǎn)生的應(yīng)對(duì)信息進(jìn)入了正在融合著的精卵兩性細(xì)胞，給下代留下了抵抗不良因素的“記憶”?？墒?，在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這個(gè)發(fā)現(xiàn)時(shí)，即本次在724大白菜上免疫病毒病，雖然沒有達(dá)到以前免疫二牛心白菜那樣理想，但也達(dá)到了高抗標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過反復(fù)比較，終于追索出了原因，更有價(jià)值。

1　在大白菜上免疫病毒病

1.1材料和方法

用分離提純的高感蕪菁花葉病毒（TuMV）病的724大白菜品系，用種子進(jìn)行常規(guī)春化處理［3］在溫室育苗、盆栽，避開26℃以上溫度，常規(guī)管理，培養(yǎng)到植株開花。

用蕪菁花葉病毒株系分化國家研究組的蕪菁花葉病毒的一個(gè)弱株系-TuMV-C4，在使用前18d接種［4］在另一批724白菜幼苗上繁殖毒原。

當(dāng)大白菜植株進(jìn)入盛花初期時(shí)，選晴天進(jìn)行整枝，每株保留2個(gè)枝條各留10～15個(gè)大花蕾，1～2d后選晴天授粉，全部處理在9∶00-9∶40授粉完畢。

處理設(shè)計(jì)是尋找有效免疫時(shí)間究竟在授粉前還是在授粉后哪個(gè)時(shí)間接種。由于當(dāng)時(shí)查到的幾份文獻(xiàn)稱大白菜從授粉到受精需要3～4d，所以就先后做了4批接種處理，第一批是從授粉前101.5h起，每1.5h接種一個(gè)處理，到授粉前72.5h，共做30個(gè)處理。第二批從授粉前72h到22h，每0.5h做一個(gè)處理，共做102個(gè)處理。第三批從授粉后7h起，每0.5h做一次接種處理，到授粉后36h止，共做接種處理60個(gè)。第四批是從授粉前22h到授粉后7h，每0.5h接種處理一次，共做64個(gè)接種處理。每次接種1株，接種全部葉片。白天在24℃～26℃溫室培養(yǎng)植株。在處理40d后采收種子。采種后10d播種，花盆口徑為10cm，裝有無毒營養(yǎng)土。每個(gè)處理的播種量，是采種量之半，一般為8～16粒，每盆播種1粒。

小苗2片真葉期，按常規(guī)方法接種TuMV毒原，充分發(fā)病后按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病情。

調(diào)查后挑出抗病和耐病株進(jìn)行剝?nèi)~［5］，每株只留2片心葉，4h后再接種TuMV。18d后調(diào)查病情，選出抗病株進(jìn)行春化采種。此后如法進(jìn)行第二次免疫和篩選鑒定。

苗期病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。0級(jí)：無病癥；0.1級(jí)：近心葉的幾片葉（以下同）有1片葉的1/3以下面積有輕花葉；0.5級(jí)：有1片葉輕花葉；1級(jí)：1片葉花葉或2片葉輕花葉；3級(jí)：1片葉重花葉或2片葉花葉并稍有抑制生長現(xiàn)象；5級(jí)：2～3片葉重花葉，顯著抑制生長；7級(jí)：多數(shù)葉片重花葉，植株矮化；9級(jí)：植株嚴(yán)重矮化，瀕于死亡。

抗病類型劃分標(biāo)準(zhǔn)。高抗：病情指數(shù)在11.11以下；抗病：病情指數(shù)為11.12～22.22；耐?。翰∏橹笖?shù)為22.23～33.33；感病：病情指數(shù)為33.34～55.55；高感：病情指數(shù)在55.56及以上。

1.2結(jié)果

1.2.1免疫種子的抗病性鑒定

將4批所采種子都分別做了抗病性鑒定，前3批192個(gè)處理都沒有得到1個(gè)抗病或耐病株。第四批處理，在授粉前22h起到授粉時(shí)止，每0.5h做一次免疫處理，加對(duì)照共做48個(gè)處理，在抗病性鑒定中，也都沒有得到抗病或耐病株。只有先授粉后接種的17個(gè)處理中（表1）有4個(gè)處理出現(xiàn)抗病或耐病株。分別是：授粉后間隔10min接種的第49處理中出現(xiàn)1級(jí)（抗?。┎≈?個(gè)。間隔20min的第50處理中出現(xiàn)1級(jí)抗病株3個(gè)。間隔1.5h的第54處理中出現(xiàn)0.5級(jí)高抗病株2個(gè)，1級(jí)抗病株2個(gè)，1.5～2級(jí)耐病株4個(gè)。間隔5.5h的第62處理中出現(xiàn)1級(jí)抗病株1個(gè)。它們各處理的群體病情指數(shù)依次為48.61、20.00、13.89和41.86，以第54處理最低。

表1　大白菜免疫TuMV病毒的子一代的抗性表現(xiàn)Tab.1 Resistance expression of first filial generation by immunizing Chinese cabbage with TuMV virus

1.2.2剝?nèi)~接種

把上述0.5級(jí)、1級(jí)和2級(jí)病株進(jìn)行剝?nèi)~再接種后，結(jié)果（表2）是：第49、50和62處理中的抗病株的病級(jí)都上升到4級(jí)以上，群體病情指數(shù)上升到46.49以上；第54處理的8個(gè)單株中，只有1株的病級(jí)上升到3級(jí)，其他7個(gè)病株的病級(jí)反而下降，出現(xiàn)6個(gè)0.1～0.5級(jí)的高抗單株、1個(gè)1級(jí)抗病單株，群體病情指數(shù)為9.17。

表2　剝?nèi)~再接種后病級(jí)※Tab.2 Disease grade of leaf stripping inoculation※

剝?nèi)~接種后有的病級(jí)上升，有的病級(jí)下降，是抗病材料篩選中的常見現(xiàn)象。原因是：真正的抗病株隨著植株漸長，葉片長大和增加，而病害沒有或很少發(fā)展，使病情指數(shù)自然逐漸降低。偽抗病株則在雙重打擊下現(xiàn)了原形。

1.2.3分析

第54處理，即授粉后1.5h接種TuMV毒原的處理是本次實(shí)驗(yàn)64個(gè)處理（編號(hào)23缺位）中唯一獲得抗病株的處理。該處理的種子在第一批接種鑒定中得抗病株4個(gè)，得率為50.00%，病情指數(shù)為13.89，比其他處理的病情指數(shù)（44.44～55.56，平均53.26）降低73.92%。剝?nèi)~再接種后的得率為87.50%，病情指數(shù)為9.17，比其他處理降低84.86%。

接著，在較低溫度條件下，把第54處理剩余的種子與不免疫的對(duì)照種子做了第二批抗病性檢測(cè)，第54處理的9個(gè)植株有4株為0級(jí)，4株為1級(jí)，1株為2級(jí)，平均病情指數(shù)為7.41，對(duì)照12株中有11株為3級(jí)，1株為5級(jí)，病情指數(shù)為35.18，免疫處理的病情指數(shù)降低了78.94%。關(guān)于同批種子在不同溫度下鑒定的病級(jí)有一定程度的差異是正?，F(xiàn)象。

1.2.4小結(jié)

以上4批免疫實(shí)驗(yàn)總共做了256個(gè)處理，只有第4批的第54處理出現(xiàn)了一個(gè)高抗病群體，其他255個(gè)處理連一個(gè)耐病株也沒有反映出，在大白菜上授粉后1.5h接種的起到了免疫作用。

2　大白菜接種TuMV后產(chǎn)生抗病性的時(shí)間測(cè)試

2.1材料和方法

用鏡高感病毒病的724大白菜品系，分期播種于10cm口徑裝有無毒營養(yǎng)土的花盆中。每盤12盆，每盆保苗1株。在24℃～28℃溫室育苗。第一期苗長到4片真葉時(shí)，第二期苗剛2片葉時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)處理。

毒原繁殖與上一個(gè)實(shí)驗(yàn)相同。

晴天進(jìn)行接種處理。先在4葉期的植株上接種TuMV；接種后馬上用凈水多次沖洗葉面，作為A批接種株。

A批接種株接種后30min開始，從A批接種株采取接種過的葉片做毒原，接到2葉期的B批大白菜苗上。以后每30min做一個(gè)處理。每個(gè)處理1盤12株共26個(gè)處理，加1個(gè)對(duì)照（見表3）。并在另一個(gè)時(shí)間重復(fù)一次。

每次從A批接種株上采取毒原時(shí)，按原接種順序，每次從4株上各采1片葉；但葉位每次都有第一片、第二片、第三片和第四片葉，共研制成接種毒原，按常規(guī)方法接種到B批苗上；接后不用凈水沖洗。

各處理接種前都在26℃～28℃的溫室中培養(yǎng)。B批苗接種后10d調(diào)查病情。

2.2結(jié)果與分析

病情調(diào)查表明：B批不接種的對(duì)照沒有發(fā)病株，而接種處理的各個(gè)單株都明顯發(fā)病，即發(fā)病率都達(dá)100%；但病情指數(shù)差異很大（見表3）。在A批上接種后間隔8h采樣轉(zhuǎn)接到B批的處理的病情指數(shù)是8.33，而其他處理的病情指數(shù)都在15.55～38.89，平均為27.06。反映出間隔8h采取毒原的處理的發(fā)病最輕，比其他處理的病情指數(shù)減少了46.43%～78.58%。

表3　在A株上接種與采毒的間隔時(shí)間不同，接種到B株上的病情表現(xiàn)※※Tab.3 Different interval time of inoculation and venom collection on A strain，and disease performance of inoculation on B strain※※

第二次重復(fù)試驗(yàn)（表4）仍然表明：只有在A批接種株上接種后8h采取的毒原，使B批苗的病害程度最輕，病情指數(shù)只有5.56～12.96，平均為9.26，除間隔8h20min處理受鄰界處理的影響以外，其他16個(gè)處理的病情指數(shù)都在18.52～23.15。間隔8h處理的病害程度減輕了44.02%～69.98%。以上兩批試驗(yàn)都一致說明，在大白菜A批苗上接種TuMV后8h，大白菜產(chǎn)生了抗病性。此時(shí)大白菜的抗性削弱了病毒的活性，采它做毒原，自然侵染點(diǎn)少，侵染力弱，延遲了B苗的病癥表達(dá)的時(shí)間。到接種后15d調(diào)查，間隔8h處理的病情指數(shù)逐漸上升；到20d調(diào)查時(shí)，病情指數(shù)接近其他處理。

3　綜合分析和結(jié)論

根據(jù)作者論證發(fā)現(xiàn)的生物突變和進(jìn)化的機(jī)制是生物受不利于生存的因素刺激產(chǎn)生的應(yīng)對(duì)信息，進(jìn)入正在融合的兩性細(xì)胞中，給子代留下抗病信息。如果不利的因素在后代繼續(xù)存在下去，變異也就能穩(wěn)定，否則就消失。

表4　A株上接種與采毒的間隔時(shí)間不同，接種到B株上的病情表現(xiàn)*Tab.4 Different interval time of inoculation and venom collection on A strain，and disease performance of inoculation on B strain※※

本實(shí)驗(yàn)用TuMV病毒接種大白菜，自然是一種不利于大白菜生存的因素。接種能使大白菜產(chǎn)生抗病性反應(yīng)是人們生活中能體會(huì)到的常識(shí)。因此本研究要解決的問題就是大白菜授粉前或授粉后哪個(gè)時(shí)間接種才能獲得進(jìn)入子代的抗病性。

本實(shí)驗(yàn)從大白菜授粉前101.5h起到授粉后36h的時(shí)區(qū)內(nèi)，每隔一定時(shí)間接種一次TuMV，做了256個(gè)處理。在這個(gè)不同尋常的研究長鏈中，只出現(xiàn)1個(gè)成功的處理——第4批第54處理，即在授粉后1.5h接種的獨(dú)表優(yōu)勢(shì)，第一次測(cè)試的8個(gè)單株中有6個(gè)高抗，群體病情指數(shù)為9.17，而其他255個(gè)處理和對(duì)照中連1個(gè)耐病株也沒有，病情指數(shù)都在44.44以上，平均為53.26。第二次再測(cè)試9個(gè)單株的病情指數(shù)為7.41，比不免疫對(duì)照的病情指數(shù)降低了78.94%。反映出了大白菜免疫TuMV的唯一關(guān)鍵時(shí)間是授粉后1.5h接種。

前述在接近高感病毒病的大白菜上接種TuMV病毒后，產(chǎn)生抗病性的時(shí)間試驗(yàn)表明，在適合本病毒侵染的條件下，接種后8h取出的病汁再接種的植株發(fā)病程度顯著減輕。第一次試驗(yàn)比其他處理減輕了46.43%～78.58%。第二次測(cè)試減輕了44.02%～69.98%，反映出大白菜在接種后8h產(chǎn)生了有效抗病性。

北京蔬菜研究中心徐家炳教授曾研究證明：北京大白菜在正常溫度下，授粉后9～10h受精，即是精、卵細(xì)胞在9.5h左右進(jìn)行融合。

因此，（授粉后1.5h接種）+（接種后8h產(chǎn)生抗病性）=授粉到兩性細(xì)胞融合需要9.5h。表明了產(chǎn)生抗病性的時(shí)間與兩性細(xì)胞融合的時(shí)間重合才是免疫成功的關(guān)鍵，其他任何時(shí)間都不成。顯現(xiàn)了生物能夠接受異常信息產(chǎn)生突變的機(jī)制之所在。

這是母代免疫，子代表現(xiàn)抗病的遺傳現(xiàn)象。第54處理的白菜經(jīng)過第二次免疫和兩代篩選，到第5代的抗病性一直穩(wěn)定在9.03～10.49。雖然沒有達(dá)到免疫的二牛心白菜那樣完全無癥，但也把一個(gè)原病情指數(shù)為53.26的近于高感的大白菜免疫到了高抗病水平，同樣表明了這種方法做的人工免疫的抗病性可以穩(wěn)定遺傳。而且找到了此次在724大白菜上免疫的效果比在二牛心品種上免疫的低的原因，意義更重要。加上在西瓜上免疫枯萎病，到第5代的病情指數(shù)由30.17降到穩(wěn)定的1.24。因此，人工免疫的抗病性可以穩(wěn)定遺傳的途徑和方法已經(jīng)找到，開辟了創(chuàng)新生物資源的有效途徑，也回證了本人發(fā)現(xiàn)的生物突變和進(jìn)化的機(jī)制的論點(diǎn)是正確的。在植物上可廣泛應(yīng)用，也能借鑒于動(dòng)物，意義重大。

4　主要經(jīng)驗(yàn)

人工免疫技術(shù)的程序簡單，但操作細(xì)則易變。操作中有兩個(gè)重要環(huán)節(jié)：一是要明了兩性細(xì)胞融合的時(shí)間，二是要明了免疫接種處理后產(chǎn)生抗病性的時(shí)間。同一個(gè)品種的制種方式（自交、混合交、雜交）不同，授粉到兩性細(xì)胞融合的時(shí)間大不相同，并與當(dāng)時(shí)溫濕度關(guān)系密切，要實(shí)測(cè)。至于免疫接種后產(chǎn)生抗病性的時(shí)間，要進(jìn)行專業(yè)化驗(yàn)或做預(yù)備試驗(yàn)。所用毒原的毒力要強(qiáng)，必要時(shí)進(jìn)行重復(fù)免疫或篩選。

免疫實(shí)驗(yàn)區(qū)要避免其他病害干擾，特別是兩性細(xì)胞融合時(shí)要避免噪音等異常因素干擾。第一次免疫后的種子，要盡早做抗病性篩選或第二次免疫，否則抗病性衰退。

［1］ 劉元?jiǎng)P.發(fā)現(xiàn)生物突變和進(jìn)化的機(jī)制［J］.黑龍江科學(xué)，2016，（03）：154-156.

［2］ 劉元?jiǎng)P.哲學(xué)解讀生物突變和進(jìn)化的機(jī)制［J］.黑龍江科學(xué)，2016，7（8）：150-151.

［3］劉宜生.中國大白菜［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

［4］ 俞大紱.植物病理學(xué)和真菌學(xué)技術(shù)匯編［G］.北京：高等教育出版社，1959.

［5］ 李樹德，劉元?jiǎng)P.中國主要蔬菜抗病育種進(jìn)展［M］.北京：科學(xué)出版社，1995：30-34.

Disease resistance of artificial immunity of plants can inherit I.Immunizing Chinese cabbage with TyMV virus disease

LIU Yuan-kai
（Horticulture Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150060，China）

Disease resistance of artificial immunity can inherit has been a dream of scientists in agriculture and medicine. After 32 years of study，the author found the variation and evolution mechanism of organisms，that is，the corresponding information that's delivered out when the organism stimulated by adverse factors.During the fusion of sperm and egg，the corresponding information happens as well；under this condition，the memory as the resistance factor for the next generation will enter into the fusion cell.Thereby establishing a theoretical basis to the realization of the dream.In the experiment，immunizing Chinese cabbage Er'niuxin species with TyMV virus for the first time，making the species that often affected by devastating harm could not be attacked in the pandemic year of virus and stably inherit，which really plays an important role in production.In the second experiment immunizing No.724 Chinese cabbage with TuMV virus for continuous identification of five generations（their disease indexes are no more than 10.49），which turns a nearly high susceptible strain to a high resistance standard，which approves that disease insistence of artificial immunity can stably inherit.Also the reasons for different effects in two immunities were found，which was very precious.Combining the example of immunizing watermelon with watermelon wilting virus（disease index is from 30.17 down to 1.2），which naturally certified that the disease resistance of artificial immunity can inherit and the argument on mutation and evolution mechanism of organisms is correct，and it has a large range of reference.

Chinese cabbage；Virus disease；Artificial immunity of plants；Inheritance of disease resistance；TyMV virus；Gender cell fusion

S634.1

A

1674-8646（2016）12-0004-05

2016-05-17

劉元?jiǎng)P（1930-），男，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院退休研究員，中國植物病理學(xué)會(huì)前理事，前國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)攻關(guān)局聘農(nóng)業(yè)專家，曾主持《中國TuMV株系分化研究》獲國家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)等。原國務(wù)院授予終身科技津貼，0451-86666482。