劉宇帥，張淑梅，曹　旭，胡基華，姜　威，孟利強(qiáng)，陳靜宇，李　晶

（1.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150001；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010）

煙草野火病與角斑病生防菌株的篩選

劉宇帥1，2，張淑梅1，2，曹旭1，2，胡基華1，2，姜威1，2，孟利強(qiáng)1，2，陳靜宇1，2，李晶1，2

（1.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150001；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010）

本研究通過室內(nèi)平板拮抗作用實驗，篩選對煙草細(xì)菌病害具有較好防治作用的生防菌株，并對其拮抗作用及復(fù)合菌劑進(jìn)行研究。篩選到一株對煙草野火病菌具有拮抗作用的生防菌株CZS，抑菌圈平均直徑為25.92mm；一株對煙草角斑病菌具有拮抗作用的生防菌株18，抑菌圈平均直徑為28.76mm。此外，通過不同配比復(fù)合菌劑的抑菌實驗表明，無論是針對野火病菌還是角斑病菌，生防細(xì)菌CZS、18以2：1配比而得的復(fù)合菌劑抑菌效果最明顯。

煙草細(xì)菌病害；生防菌；篩選；拮抗作用

近年來，煙草的病蟲害危害問題日益突出，嚴(yán)重危害煙株葉片并影響煙葉質(zhì)量，已造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。野火病和角斑病是煙草主要的細(xì)菌病害，野火病是一種由煙草假單胞桿菌 （Pseudomonas syringae pv.tabaci）引起，由Wolf和Foser首次報道，該病最早發(fā)現(xiàn)于美國的弗吉尼亞和北卡羅萊納州［1］。20世紀(jì)40年代末該病害在中國云南煙區(qū)零星發(fā)生，而后隨著煙草栽培面積的擴(kuò)大而漸趨嚴(yán)重［2］。煙草角斑病病原菌為假單胞桿菌，屬丁香假單胞菌，煙草致病變種不產(chǎn)生野火毒素菌系［3］。由于天氣原因，野火病與角斑病經(jīng)?；旌习l(fā)生，病害流行年份可造成重大損失，甚至導(dǎo)致絕收。由于這些病原菌存活力強(qiáng)，采用輪作或田間消除病殘體等栽培措施預(yù)防病害的發(fā)生具有相當(dāng)大的難度［4］。利用化學(xué)藥劑防治，不僅會造成環(huán)境污染和煙葉內(nèi)的農(nóng)藥殘留，而且防治效果也難以保證。因此，生物防治方法越來越受到人們的重視。為此，筆者篩選出對煙草野火病和角斑病具有拮抗作用的生防菌，并對其復(fù)合菌劑進(jìn)行研究。

1　材料與方法

1.1材料

培養(yǎng)基∶LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1 000mL，若固體培養(yǎng)基需加瓊脂15g，pH 7.0）。

菌株∶煙草野火病和角斑病菌由牡丹江煙草科學(xué)研究所贈送，供實驗篩選所用細(xì)菌菌株均為實驗室保藏的生防菌株。

1.2生防菌株的篩選

將實驗室現(xiàn)有保藏的生防細(xì)菌菌株挑取單菌落分別接于5mL LB試管中，于30℃、170 r/min振蕩器中培養(yǎng)70 h待用。將保藏的病原菌以2%的接種量分別取100μL接于5 mL LB試管中，30℃、170 r/min振蕩器中培養(yǎng)16h。分別取100μL病原菌菌液均勻涂滿于LB培養(yǎng)基平板上，然后用滅菌后的牙簽分別蘸取各生防菌液點接于培養(yǎng)基上。設(shè)未接生防菌液為對照組，重復(fù)3次，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天對病原菌生長情況進(jìn)行觀察。

1.3生防菌株的抑菌能力測定

采用與1.2中同樣的方法，將病原菌和初篩獲得的生防細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)。分別取100μL病原菌菌液均勻涂滿于LB培養(yǎng)基平板上，然后取滅菌后的牛津杯置于各平板中，并在其中加入生防菌液各100μL。設(shè)未加生防菌液為對照組，重復(fù)3次，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天對病原菌生長情況進(jìn)行觀察，測量抑菌圈大小。

1.4復(fù)合菌劑的配制及抑菌能力測定

生防細(xì)菌與病原菌的培養(yǎng)同1.2，將兩種生防菌液按1∶1、2∶1、1∶2的體積比進(jìn)行混合，配制成三種復(fù)合菌劑，按1.3中的方法進(jìn)行抑菌實驗。

2　結(jié)果與分析

2.1煙草野火病、角斑病生防菌株的篩選

通過平板抑菌實驗，對實驗室現(xiàn)有的生防菌株抑菌能力進(jìn)行測定，篩選出一株對野火病具有抑菌能力的枯草芽孢桿菌CZS，一株對角斑病具有抑菌能力的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌18。

2.2菌株CZS對煙草野火病病原菌的拮抗作用

通過室內(nèi)平板拮抗作用實驗對菌株CZS的拮抗作用進(jìn)行測定，結(jié)果表明在培養(yǎng)2d后，對照組中野火病菌生長旺盛，菌落布滿整個平板。而加有生防菌液的培養(yǎng)皿內(nèi)牛津杯周圍出現(xiàn)明顯的透明抑菌圈，抑菌圈平均直徑為25.92mm，見圖1。

圖1　菌株CZS對煙草野火病病原菌的拮抗作用Fig.1 Inhibitory activity of CZS strain on tobacco wildfire pathogenic bacteria

2.3菌株18對煙草角斑病病原菌的拮抗作用

通過室內(nèi)平板拮抗作用實驗對菌株18的拮抗作用進(jìn)行測定，結(jié)果表明在培養(yǎng)3d后，對照組中角斑病菌生長旺盛，菌落布滿整個平板。而加有生防菌液的培養(yǎng)皿內(nèi)牛津杯周圍出現(xiàn)明顯的透明抑菌圈，抑菌圈平均直徑為28.76mm，見圖2。

圖2　菌株CZS對煙草野火病病原菌的拮抗作用Fig.2 Inhibitory activity of CZS strain on tobacco wildfire pathogenic bacteria

2.4復(fù)合菌劑的拮抗作用

通過室內(nèi)平板拮抗作用實驗，對三種復(fù)合菌劑的抑菌效果進(jìn)行測定。當(dāng)生防細(xì)菌CZS的菌數(shù)為5.55× 109個/mL，生防細(xì)菌18的菌數(shù)為6.95×109個/mL時，從表1、表2可以得出，無論是針對煙草野火病菌還是角斑病菌，三種配比組合的抑菌效果均很明顯，通過spss軟件分析雖然三種組合的數(shù)值間不具有顯著性差異（P＞0.05），但就抑菌能力來看，生防細(xì)菌CZS、18以2∶1配比而得的復(fù)合菌劑抑菌能力最強(qiáng)，因此最優(yōu)比例為2∶1。

表1　不同配比的復(fù)合菌劑對野火病菌的抑菌作用（抑菌圈大小單位：mm）Tab.1 Bacteriostatic action of complex microbial inoculants in different proportion on wildfire pathogenic bacteria （inhibition zone size unit：mm）

表2　不同配比的復(fù)合菌劑對角斑病菌的抑菌作用（抑菌圈大小單位：mm）Tab.2 Bacteriostatic action of complex microbial inoculants in different proportion on angular leaf spot pathogenic bacteria （inhibition zone size unit：mm）

3　結(jié)論

生物防治作為煙草病害綜合防治的重要組成部分，具有無污染、無公害、長效等優(yōu)點，在可持續(xù)農(nóng)業(yè)模式中占有十分重要的地位。本研究通過室內(nèi)平板拮抗作用實驗，分別對煙草細(xì)菌病害野火病與角斑病篩選到一株生防細(xì)菌。其中針對野火病的生防細(xì)菌經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，角斑病的生防細(xì)菌經(jīng)鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。由于天氣原因野火病與角斑病經(jīng)?；旌习l(fā)生，病害流行年份可造成重大損失，但是能夠同時抑制這兩種病害的復(fù)合菌劑報道很少。本研究將兩種生防細(xì)菌按不同比例進(jìn)行混合，經(jīng)過拮抗作用實驗發(fā)現(xiàn)，生防細(xì)菌CZS、18以2∶1配比而得的復(fù)合菌劑具有最強(qiáng)的抑菌效果。

［1］ Lucas G B.Diseases of Tobacco（Third edition）［M］.Raieigh North Carolina，USA，1975.

［2］ 王玲玲，魯燕泣，盛存波，等.煙草野火病土壤頡頏細(xì)菌的篩選和鑒定［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，15（3）∶79-82.

［3］ 姜新，白建保，王左斌，等.煙草角斑病研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35 （7）∶2014-2015.

［4］ 朱賢朝，王彥亭，王智發(fā).中國煙草病害［M］.北京∶中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

Screening of tobacco wildfire and angular leaf spot biocontrol strain

LIU Yu-shuai1，2，ZHANG Shu-mei1，2，CAO Xu1，2，HU Ji-hua1，2，JIANG Wei1，2，MENG Li-qiang1，2，CHEN Jing-yu1，2，LI Jing1，2
（1.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150001，China；2.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，China）

In this study，we screened biocontrol strains which had good effect on tobacco bacterial diseases by laboratory plate antagonism test，and then studied their inhibitory activity and compound microbial agents.We screened a strain CZS which had inhibitory effect on tobacco wildfire disease which the average diameter of inhibition zone was 25.92mm，and a strain 18 which had inhibitory effect on Pseudomonas syringae pv.Tabaci which the average diameter of inhibition zone was 28.76mm.In addition，through the antibacterial test of compound microbial agents with different proportions indicated that compound microbial agent that CZS，18 were in a 2∶1 ratio had the most obvious inhibitory effect on this two kinds of bacterial diseases.

Tobacco bacterial diseases；Biocontrol strains；Screening；Inhibitory activity

S435.72

A

1674-8646（2016）12-0011-03

2016-05-06

劉宇帥（1988—），女，黑龍江哈爾濱人，碩士，助理研究員，從事農(nóng)業(yè)微生物、分子生物學(xué)、生物防治方面研究。

李晶（1966—），黑龍江哈爾濱人，博士，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，從事農(nóng)業(yè)微生物、分子生物學(xué)、生物防治研究。